干擾β-catenin表達(dá)對(duì)淋巴瘤細(xì)胞增殖、凋亡及cleaved caspase 3蛋白表達(dá)水平的影響

凡治國(guó)，李志平，任超

安陽(yáng)市腫瘤醫(yī)院普內(nèi)科，河南 安陽(yáng) 455000

淋巴瘤發(fā)生于淋巴結(jié)和節(jié)外相鄰淋巴組織中，是一種異質(zhì)性的由淋巴細(xì)胞或者前體細(xì)胞引起的腫瘤，屬于血液系統(tǒng)惡性腫瘤[1]。近年來，淋巴瘤的發(fā)病率及病死率呈逐年上升趨勢(shì)，化療是目前治療淋巴瘤的主要方法，但仍有超過15%的淋巴瘤患者出現(xiàn)耐藥、復(fù)發(fā)等現(xiàn)象，再加上化療后不良反應(yīng)較大，尋找新的治療方法一直是研究的重點(diǎn)[2]。β-連環(huán)蛋白（β-catenin）是經(jīng)典Wnt信號(hào)通路中的關(guān)鍵調(diào)控蛋白，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中發(fā)揮重要作用[3]。研究表明，β-catenin在腫瘤組織中過表達(dá)，并且與腫瘤的發(fā)生、轉(zhuǎn)移有關(guān)[4]。β-catenin在淋巴瘤中表達(dá)上調(diào)，并且與患者的臨床分期呈正相關(guān)，而βcatenin對(duì)淋巴瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響尚不十分清楚[5]。本研究以淋巴瘤細(xì)胞為研究對(duì)象，通過小干擾RNA（small interfering RNA，siRNA）降低淋巴瘤細(xì)胞中β-catenin的表達(dá)，探討β-catenin對(duì)淋巴瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響及機(jī)制，以期為靶向βcatenin治療淋巴瘤提供理論依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

淋巴瘤細(xì)胞Raji購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度檢測(cè)試劑盒購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物工程材料有限公司；β-肌動(dòng)蛋白（β-actin）、β-catenin引物由上海生工生物工程股份有限公司合成；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；β-cateninsiRNA及陰性對(duì)照control siRNA均購(gòu)自美國(guó)Santa Cruz Biotech公司；c-myc多克隆抗體、細(xì)胞周期蛋白D1（cyclin D1）多克隆抗體、活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3，cleaved caspase 3）多克隆抗體、βcatenin多克隆抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；實(shí)時(shí)逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；噻唑藍(lán)（methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide，MTT）購(gòu)自碧云天生物技術(shù)研究所。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

取出保存在液氮罐中的淋巴瘤細(xì)胞Raji，37℃融化1 min，加入含有10%胎牛血清的RPMI 1640細(xì)胞培養(yǎng)液，1000 r/min離心10 min，吸除上清后，在細(xì)胞沉淀中加入5 ml細(xì)胞培養(yǎng)液混勻，接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，培養(yǎng)條件：37℃、5%CO2培養(yǎng)箱。待細(xì)胞密度達(dá)到80%時(shí)，采用0.25%的胰蛋白酶37℃消化1 min，轉(zhuǎn)移至離心管中，1000 r/min離心10 min，棄上清，應(yīng)用新鮮的細(xì)胞培養(yǎng)液重懸細(xì)胞，按照1∶2的比例接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。將淋巴瘤細(xì)胞Raji分為3組：對(duì)照組、siRNA control組、β-cateninsiRNA組。對(duì)照組細(xì)胞正常培養(yǎng)，不進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，β-cateninsiRNA組和siRNA control組細(xì)胞分別轉(zhuǎn)染β-cateninsiRNA及陰性對(duì)照siRNA control，轉(zhuǎn)染步驟參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑盒說明書。

1.3 RT-PCR檢測(cè)β-catenin mRNA表達(dá)水平

取對(duì)照組、siRNA control組、β-cateninsiRNA組細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，參照RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)檢測(cè)RNA的濃度及純度。應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，RTPCR試劑盒檢測(cè)β-cateninmRNA的表達(dá)水平。βcatenin上游引物為5'-TGGTGACAGGGAAGACATCA-3'，下游引物為5'-CCATAGTGAAGGCGAACTGC-3'。β-actin上游引物為5'-GAGACCTTCAACACCCCAGC-3'，下游引物為5'-ATGTCACGCACGATTTCCC-3'。以β-actin為內(nèi)參，采用2-△△Ct法計(jì)算β-cateninmRNA 表達(dá)水平。反應(yīng)條件：94 ℃ 45 s，56 ℃ 60 s，72 ℃ 80 s，共35個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測(cè)β-catenin蛋白表達(dá)水平

取對(duì)照組、siRNA control組、β-cateninsiRNA組細(xì)胞，培養(yǎng)48 h后，加入細(xì)胞裂解液，冰上裂解30 min后，14 000 r/min離心15 min，將蛋白上清吸取至EP管中，保存于-80℃。應(yīng)用BCA蛋白濃度檢測(cè)試劑盒檢測(cè)蛋白濃度。將蛋白樣品與5×loading buffer按照4∶1的比例混合后，100℃煮沸5 min。每孔加入40 μg變性蛋白樣品，電泳初始電壓為80 V，待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠和濃縮膠的交界處時(shí)，將電壓調(diào)至120 V；待溴酚藍(lán)進(jìn)入分離膠的底端邊緣時(shí)，結(jié)束電泳，90 V轉(zhuǎn)膜90 min。加入5%脫脂奶粉室溫封閉60 min；與1∶1000稀釋的一抗，4℃孵育過夜；與1∶2000稀釋的二抗，室溫反應(yīng)60 min。滴加顯色液，曝光，以β-actin為內(nèi)參，分析β-catenin蛋白的表達(dá)水平。β-catenin蛋白表達(dá)水平=βcatenin蛋白灰度值/β-actin蛋白灰度值。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖

對(duì)照組、siRNA control組、β-cateninsiRNA組以每孔3000個(gè)細(xì)胞接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，培養(yǎng)48 h后，每孔中加入20 μl MTT溶液（5 mg/ml），孵育4 h，加入150 μl二甲基亞砜溶液，振蕩反應(yīng)10 min后，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處的光密度（optical density，OD）值，設(shè)置空白組（不加細(xì)胞），每組設(shè)置7個(gè)復(fù)孔，計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=（轉(zhuǎn)染組OD值-空白組OD值）（/對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

對(duì)照組、siRNA control組、β-cateninsiRNA組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，收集1×106個(gè)細(xì)胞，用冰預(yù)冷的磷酸鹽緩沖液（phosphate buffer saline，PBS）洗滌重懸細(xì)胞2次，1000 r/min離心10 min，棄PBS，在細(xì)胞中加入結(jié)合緩沖液，分別加入5 μl碘化丙啶（propidium iodide，PI）和 5 μl膜聯(lián)蛋白V-異硫氰酸熒光素（Annexin V-FITC），避光條件下反應(yīng)25 min，加400 μl結(jié)合緩沖液，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Western blot檢測(cè)cleaved caspase 3、c-myc、cyclin D1蛋白表達(dá)水平

對(duì)照組、siRNA control組、β-cateninsiRNA組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，提取細(xì)胞中的蛋白，Western blot檢測(cè)細(xì)胞中的 cleaved caspase 3、c-myc、cyclin D1蛋白表達(dá)水平，步驟同1.4。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對(duì)-數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 β-catenin mRNA和蛋白表達(dá)水平的比較

β-cateninsiRNA組的β-cateninmRNA和βcatenin蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對(duì)照組和siRNA control組的βcateninmRNA和β-catenin蛋白表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（圖1、表1）

圖1 Western blot檢測(cè)β-catenin蛋白表達(dá)水平

表1 3組細(xì)胞中β-catenin mRNA和β-catenin蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

表1 3組細(xì)胞中β-catenin mRNA和β-catenin蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

注：*與對(duì)照組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組siRNAcontrol組β-catenin siRNA組β-catenin mRNA 1.00±0.08 0.98±0.13 0.25±0.05*β-catenin蛋白0.68±0.08 0.69±0.06 0.17±0.04*

2.2 細(xì)胞存活率的比較

β-cateninsiRNA組的細(xì)胞存活率為（52.18±6.37）%，低于對(duì)照組的100%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；siRNA control組的細(xì)胞存活率為（97.67±1.84）%，與對(duì)照組的100%比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3 細(xì)胞凋亡率的比較

β-cateninsiRNA組的細(xì)胞凋亡率為（29.87±2.49）%，高于對(duì)照組的（10.25±2.14）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；siRNA control組的細(xì)胞凋亡率為（11.57±1.74）%，與對(duì)照組的（10.25±2.14）%比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（圖2）

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡

2.4 cleaved caspase 3、c-myc、cyclin D1蛋白表達(dá)水平的比較

β-cateninsiRNA組的cleaved caspase 3蛋白表達(dá)水平高于對(duì)照組，c-myc、cyclin D1蛋白表達(dá)水平均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；siRNA control組和對(duì)照組的cleaved caspase 3、cmyc、cyclin D1蛋白表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（圖3、表2）

圖3 Western blot檢測(cè)cleaved caspase 3、c-myc、cyclin D1蛋白表達(dá)水平

表2 3組細(xì)胞中cleaved- caspase 3、c-myc、cyclin D1蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

表2 3組細(xì)胞中cleaved- caspase 3、c-myc、cyclin D1蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

注：*與對(duì)照組比較，P＜0.05

組別對(duì)照組siRNAcontrol組β-catenin siRNA組0.35±0.06 0.37±0.03 0.99±0.11*0.42±0.09 0.44±0.06 0.10±0.02*1.06±0.13 1.07±0.11 0.15±0.04*cleaved caspase 3c-myc cyclin D1

3 討論

β-catenin是一種廣泛存在于組織器官中的蛋白，一方面可以與黏附相關(guān)蛋白結(jié)合形成復(fù)合物，調(diào)控細(xì)胞黏附作用，另一方面可以進(jìn)入細(xì)胞核，調(diào)控細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程，影響細(xì)胞的增殖和凋亡[6-9]。研究表明，當(dāng)細(xì)胞中β-catenin與黏附相關(guān)蛋白形成的復(fù)合物的降解受到阻礙時(shí)，β-catenin大量聚集在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)，最終進(jìn)入細(xì)胞核內(nèi)與T細(xì)胞淋巴因子或者淋巴增強(qiáng)因子結(jié)合，啟動(dòng)下游靶基因（如c-myc、cyclin D1）的轉(zhuǎn)錄，導(dǎo)致細(xì)胞異常增殖[10]。β-catenin在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，秦貝貝等[11]通過免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)淋巴細(xì)胞和淋巴組織中βcatenin的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)β-catenin在淋巴瘤中表達(dá)上調(diào)。研究表明，β-catenin能夠調(diào)控肺癌、胰腺癌、腦膠質(zhì)瘤、白血病等多種腫瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，在腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)過程中發(fā)揮促進(jìn)作用[12-15]。

淋巴瘤是一種惡性腫瘤，起源于淋巴造血系統(tǒng)。淋巴瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和凋亡與淋巴瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)[16]。細(xì)胞的增殖和凋亡是一個(gè)極為復(fù)雜的過程，是一系列調(diào)控因子共同作用的最終結(jié)果。caspase是一個(gè)成員較多的蛋白酶家族，目前發(fā)現(xiàn)人體內(nèi)的caspase蛋白家族成員至少有11種，其中caspase 3在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮凋亡執(zhí)行因子的作用。caspase 3在正常情況下以酶原的形式存在，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，caspase 3被活化成為cleaved caspase 3，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用[17-18]。cyclin D1是一種可以促進(jìn)細(xì)胞增殖的細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，是Wnt/β-catenin信號(hào)通路的下游靶基因，也是一種公認(rèn)的癌基因，在基因轉(zhuǎn)錄過程中發(fā)揮促進(jìn)作用[19]。c-myc能夠使細(xì)胞無限增殖，是一種癌基因，在細(xì)胞生長(zhǎng)、分化、凋亡等過程中發(fā)揮調(diào)控作用[20]。有研究表明，cyclin D1、c-myc在腫瘤組織中過表達(dá)，而cleaved caspase 3在腫瘤組織中表達(dá)下調(diào)[21]。崔艷香等[22]通過流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)淋巴瘤患者中cyclin D1的表達(dá)水平，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，淋巴瘤患者中cyclin D1的熒光強(qiáng)度高于健康人。楊順娥等[23]研究表明，c-myc在淋巴瘤中的陽(yáng)性表達(dá)率為77%，而在淋巴增生組織中的陽(yáng)性表達(dá)率為22%。

本研究結(jié)果顯示，干擾β-catenin表達(dá)后，淋巴瘤細(xì)胞的增殖能力下降，細(xì)胞凋亡率升高，細(xì)胞中cleaved caspase 3蛋白表達(dá)水平升高，cyclin D1、cmyc蛋白表達(dá)水平下降。提示干擾β-catenin的表達(dá)可能通過影響cyclin D1、c-myc、cleaved caspase 3蛋白的表達(dá)，抑制淋巴瘤細(xì)胞增殖，促進(jìn)淋巴瘤細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果說明β-catenin是一種癌基因。然而本研究也有不足之處，只在一種淋巴瘤細(xì)胞中對(duì)β-catenin的作用進(jìn)行了初步探討，后續(xù)實(shí)驗(yàn)中會(huì)在多種淋巴瘤細(xì)胞中進(jìn)行驗(yàn)證，并對(duì)其具體作用機(jī)制進(jìn)行深入研究。本研究為后續(xù)進(jìn)一步探討β-catenin在淋巴瘤中的作用奠定了基礎(chǔ)，為治療淋巴瘤提供了新思路。