PD-L1在頭頸部鱗癌中的表達(dá)及其臨床意義△

王迪，曲媛，劉慧穎，張?jiān)?，?chē)軼群#

國(guó)家癌癥中心/國(guó)家腫瘤臨床醫(yī)學(xué)研究中心/中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院1檢驗(yàn)科，2放射治療科，北京100021

3北京市朝陽(yáng)區(qū)三環(huán)腫瘤醫(yī)院檢驗(yàn)科，北京 100122

頭頸部腫瘤是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，發(fā)病率居世界惡性腫瘤的第6位，其中鱗狀細(xì)胞癌占90%～95%[1]。目前，早期頭頸部鱗癌（head and neck squamous cell carcinoma，HNSCC）的治療主要以手術(shù)和單純放療或同步放化療為主，5年生存率為40%～60%，但出現(xiàn)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)的患者，放化療后平均生存時(shí)間僅為6～9個(gè)月[2]。因此，尋找能夠預(yù)測(cè)HNSCC遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和局部復(fù)發(fā)的分子標(biāo)志物是臨床亟待解決的問(wèn)題。程序性死亡受體1（programmed cell death 1，PDCD1，也稱(chēng)PD-1）是一種重要的免疫抑制分子，程序性死亡受體配體1（programmed cell death 1 ligand 1，PDCD1LG1，也稱(chēng)PD-L1）和程序性死亡受體配體2（programmed cell death 1 ligand 2，PDCD1LG2，也稱(chēng) PD-L2）為其配體。近年來(lái)應(yīng)用免疫組織化學(xué)方法，已先后在乳腺癌[3]、黑色素瘤[4]、腎細(xì)胞癌[5]、肺鱗狀細(xì)胞癌[6]、鼻咽癌[7]等人類(lèi)腫瘤組織中檢測(cè)到PD-1和PD-L1的表達(dá)。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)慢性感染環(huán)境使被感染組織發(fā)生癌變的危險(xiǎn)程度增加，炎癥成分也存在于與腫瘤相關(guān)的微環(huán)境中[8]。血清C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）是一種非特異性的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，在機(jī)體發(fā)生損傷、炎性反應(yīng)、感染、腫瘤等情況時(shí)會(huì)升高。文獻(xiàn)報(bào)道，CRP與惡性腫瘤的病理分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、預(yù)后等具有相關(guān)性[9-12]。本研究收集了69例HNSCC患者的病歷資料，并收集相應(yīng)的腫瘤組織和外周血標(biāo)本，旨在研究PD-L1在HNSCC中的表達(dá)情況及與外周血CRP水平的關(guān)系，并討論P(yáng)D-L1表達(dá)與HNSCC患者1年內(nèi)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的關(guān)系，為HNSCC患者的預(yù)后評(píng)價(jià)提供新的方向，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

收集2016年1月至2017年1月于中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院腫瘤醫(yī)院經(jīng)病理確診的69例HNSCC患者的腫瘤組織和外周血標(biāo)本。納入標(biāo)準(zhǔn)：①接受放射治療；②具備完整的臨床資料；③無(wú)心臟、肝臟、腎臟、消化道和代謝異常；④無(wú)神經(jīng)系統(tǒng)疾病史。69例患者中，男62例，年齡為27～78歲，中位年齡為55.5歲；女7例，年齡為23～70歲，中位年齡為67.0歲。腫瘤部位：口腔13例，口咽23例，喉14例，下咽19例。

1.2 試劑

兔單克隆抗體PD-L1（1∶200稀釋?zhuān)⑿∈髥慰寺】贵wP16（即用型）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）抗體（1∶200 稀釋?zhuān)?、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）（1∶200 稀釋?zhuān)┚?gòu)自英國(guó) Abcam公司；免疫組織化學(xué)染色試劑盒（PV-9000）、蘇木素均購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；CRP檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京九強(qiáng)生物技術(shù)有限公司；Cobas-8000全自動(dòng)化分析儀購(gòu)自羅氏公司。

1.3 免疫組織化學(xué)染色和外周血CRP檢測(cè)

所有標(biāo)本均經(jīng)10%中性福爾馬林固定，常規(guī)石蠟包埋，4 μm厚連續(xù)切片。脫蠟，水合，抗原修復(fù)。分別加入PD-L1、P16、EGFR、VEGF抗體，4℃過(guò)夜。使用免疫組織化學(xué)染色試劑盒進(jìn)行二抗孵育和染色。操作步驟嚴(yán)格按照產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。由兩位病理醫(yī)師評(píng)估染色強(qiáng)度。＞10%的腫瘤細(xì)胞細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒界定為PD-L1陽(yáng)性。外周血CRP水平檢測(cè)：空腹?fàn)顟B(tài)下，抽取患者肘靜脈血4 ml，離心分離血清，使用CRP檢測(cè)試劑盒，采用免疫透射比濁法測(cè)定CRP水平。

1.4 隨訪

治療結(jié)束后，每3個(gè)月對(duì)患者進(jìn)行1次隨訪，包括胸腹部計(jì)算機(jī)斷層成像（computed tomography，CT）、頭頸部磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）。當(dāng)發(fā)現(xiàn)頭頸部腫塊時(shí)，穿刺進(jìn)行細(xì)胞學(xué)檢查。隨訪時(shí)間為1～17個(gè)月。遠(yuǎn)處無(wú)轉(zhuǎn)移生存期（distant metastasis-free survival，DMFS）定義為從放療開(kāi)始到患者出現(xiàn)轉(zhuǎn)移或隨訪截止時(shí)間。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 22.0軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)和率（%）表示，組間比較采用Fisher確切概率法或χ2檢驗(yàn)，等級(jí)資料的比較采用秩和檢驗(yàn)。不符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用秩和檢驗(yàn)。采用Kaplan-Meier法繪制生存曲線(xiàn)，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 PD-L1表達(dá)與HNSCC患者臨床特征的關(guān)系

由兩位病理學(xué)專(zhuān)家經(jīng)HE染色診斷為HNSCC（圖1A），免疫組織化學(xué)染色顯示PD-L1主要表達(dá)于腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)（圖1B）。HNSCC患者的PD-L1陽(yáng)性表達(dá)率為14.5%（10/69）。PDL1陰性表達(dá)和PD-L1陽(yáng)性表達(dá)HNSCC患者的性別、年齡、TNM分期、腫瘤原發(fā)灶分期、淋巴結(jié)受累數(shù)目、P16表達(dá)情況、EGFR表達(dá)情況比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）；PD-L1陰性表達(dá)和PD-L1陽(yáng)性表達(dá)HNSCC患者的1年內(nèi)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移情況、VEGF表達(dá)情況比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）（表1）。

圖1 HNSCC患者腫瘤組織的HE染色和免疫組織化學(xué)染色（×100）

2.2 PD-L1表達(dá)情況與HNSCC患者遠(yuǎn)處無(wú)轉(zhuǎn)移生存情況的關(guān)系

隨訪1～17個(gè)月，PD-L1陰性表達(dá)HNSCC患者的遠(yuǎn)處無(wú)轉(zhuǎn)移生存情況明顯優(yōu)于PD-L1陽(yáng)性表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.851，P=0.003）。（圖2）

2.3 PD-L1表達(dá)情況與外周血CRP的關(guān)系

PD-L1陰性表達(dá)患者的外周血CRP水平為0.17（0.06，0.88）mg/dl，高于PD-L1陽(yáng)性表達(dá)患者的0.06（0.00，0.21）mg/dl，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（Z=1.998，P=0.046）。

表1 HNSCC患者腫瘤組織中PD-L1表達(dá)情況與臨床特征的關(guān)系（n=69）

圖2 PD-L1陽(yáng)性表達(dá)（n =10）和PD-L1陰性表達(dá)（n=59）HNSCC患者的遠(yuǎn)處無(wú)轉(zhuǎn)移生存曲線(xiàn)

3 討論

PD-1常被稱(chēng)為免疫調(diào)節(jié)中的“檢查點(diǎn)分子”，并協(xié)助維護(hù)自我耐受。免疫檢查點(diǎn)分子是指一組免疫受體，當(dāng)其與配體結(jié)合時(shí)，傳遞抑制信號(hào)以抑制效應(yīng)功能[13]。腫瘤微環(huán)境由非腫瘤基質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成，包括免疫細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和新生毛細(xì)血管系統(tǒng)等，其通過(guò)與腫瘤細(xì)胞之間的相互作用來(lái)影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。在腫瘤發(fā)生、浸潤(rùn)、進(jìn)展過(guò)程中，腫瘤微環(huán)境會(huì)誘導(dǎo)浸潤(rùn)的T細(xì)胞高表達(dá)PD-1分子，腫瘤細(xì)胞通過(guò)高表達(dá)PD-1的配體PD-L1和PD-L2，傳遞負(fù)性調(diào)控信號(hào)，導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境中PD-1/PD-L1信號(hào)通路持續(xù)激活，T細(xì)胞的功能被抑制，無(wú)法殺傷腫瘤細(xì)胞，最終促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[14]。PD-1抗體可以通過(guò)PD-1/PD-L1信號(hào)通路抑制腫瘤抗原特異性T細(xì)胞的活化，下調(diào)腫瘤抗原特異性T細(xì)胞介導(dǎo)的腫瘤免疫應(yīng)答，部分恢復(fù)T細(xì)胞的功能，使這些細(xì)胞能夠繼續(xù)殺傷腫瘤細(xì)胞，影響腫瘤進(jìn)展[15]。目前有關(guān)HNSCC的臨床試驗(yàn)結(jié)果表明，PD-1/PD-L1抑制劑有較好的抗腫瘤作用，尤其是對(duì)復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的HNSCC患者有效，其中57%的患者出現(xiàn)了腫瘤退縮，客觀緩解率達(dá)24.8%[16]。因此，以PD-L1為靶點(diǎn)的免疫調(diào)節(jié)對(duì)HNSCC是一種新的抗腫瘤策略。

近年來(lái)的研究發(fā)現(xiàn)，在HNSCC患者中，PD-L1高表達(dá)與不良預(yù)后有關(guān)且不依賴(lài)于腫瘤起源，通過(guò)單因素分析發(fā)現(xiàn)，PD-L1高表達(dá)是預(yù)后不良的指征，多因素分析驗(yàn)證了PD-L1可以作為預(yù)后生物標(biāo)志物，獨(dú)立于其他眾所周知的預(yù)后因素，如腫瘤分期和腫瘤分級(jí)[17]。原發(fā)性腫瘤遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移和PD-L1高表達(dá)之間有顯著關(guān)聯(lián)，提示腫瘤轉(zhuǎn)移可能與抗腫瘤免疫功能的破壞有關(guān)[13]。本研究結(jié)果顯示，PD-L1陰性表達(dá)HNSCC患者的遠(yuǎn)處無(wú)轉(zhuǎn)移生存情況明顯優(yōu)于PD-L1陽(yáng)性表達(dá)患者，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=8.851，P=0.003），與Müller等[17]的研究結(jié)果一致。但本研究中，69例HNSCC患者中只有10例（14.5%）患者的PD-L1呈陽(yáng)性表達(dá)，低于Müller等[17]的研究結(jié)果（28%的腫瘤組織中PD-L1呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)），分析可能是由于免疫組織化學(xué)染色中使用的抗體不同或PD-L1陽(yáng)性的界定標(biāo)準(zhǔn)不一致造成。本研究結(jié)果顯示，PD-L1陰性表達(dá)HNSCC患者的1年內(nèi)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率為6.8%（4/59），低于PD-L1陽(yáng)性表達(dá)患者的40.0%（4/10），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表明PD-L1陽(yáng)性表達(dá)HNSCC患者在1年內(nèi)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)更高；PD-L1陽(yáng)性表達(dá)患者的VEGF陽(yáng)性表達(dá)率為50.0%，明顯高于PD-L1陰性表達(dá)患者的6.8%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），提示應(yīng)用抗PD-L1聯(lián)合抗血管生成藥物治療HNSCC具有潛在價(jià)值。

目前，檢測(cè)PD-L1的方法主要為免疫組織化學(xué)法。當(dāng)有些患者的病變部位經(jīng)手術(shù)切除后無(wú)法獲取組織進(jìn)行PD-L1檢測(cè)時(shí)，需要找出其他與預(yù)后相關(guān)且與PD-L1相關(guān)的指標(biāo)來(lái)指導(dǎo)評(píng)價(jià)預(yù)后。在腫瘤微環(huán)境中，炎癥有助于惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和存活、血管生成、腫瘤轉(zhuǎn)移、適應(yīng)性免疫的破壞、對(duì)激素和化學(xué)治療劑的反應(yīng)降低[8]。CRP是一種典型的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，CRP的合成與致炎性細(xì)胞因子有著密切的關(guān)系。研究顯示，CRP是白細(xì)胞介素-6（interleukin-6，IL-6）的替代標(biāo)志物[18]。本研究通過(guò)檢測(cè)69例HNSCC患者治療前的外周血CRP水平，發(fā)現(xiàn)PD-L1表達(dá)與外周血CRP水平有關(guān)，PD-L1陽(yáng)性表達(dá)患者的外周血CRP水平低于PD-L1陰性表達(dá)患者（P＜0.05）。推測(cè)可能是由于PD-L1陽(yáng)性表達(dá)的HNSCC患者中PD-1/PD-L1信號(hào)通路持續(xù)激活，機(jī)體處于免疫抑制狀態(tài)。雖然CRP是一種非特異性炎性標(biāo)志物，但檢測(cè)方法簡(jiǎn)單，費(fèi)用低廉，可作為常規(guī)檢查項(xiàng)目在臨床開(kāi)展，對(duì)HNSCC患者的PD-L1表達(dá)水平及機(jī)體免疫狀態(tài)具有輔助診斷價(jià)值。

綜上所述，PD-L1在HNSCC患者腫瘤組織中的陽(yáng)性表達(dá)率較高，可用于預(yù)測(cè)HNSCC患者1年內(nèi)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的可能性，同時(shí)與外周血CRP水平密切相關(guān)，可反映機(jī)體的免疫狀態(tài)。PD-L1可能作為HNSCC患者遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的標(biāo)志物，可作為靶點(diǎn)進(jìn)行免疫治療。由于本研究樣本量較少，結(jié)果可能存在偏倚，需要擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步驗(yàn)證。為了更好地延長(zhǎng)HNSCC患者的生存時(shí)間，選擇有效的免疫分子標(biāo)志物和免疫治療方案將為進(jìn)展期HNSCC的治療開(kāi)辟新的思路。