戒毒一號(hào)對(duì)甲基苯丙胺誘導(dǎo)的小鼠行為敏化的影響

李 燦，唐利軍，司遠(yuǎn)仁，肖華橋，茹 琴，周 梅，李超英*

（1.江漢大學(xué) 武漢生物醫(yī)學(xué)研究院，湖北 武漢 430056；2.應(yīng)用毒理湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北 武漢 430075；3.武漢萬(wàn)濟(jì)精神病醫(yī)院，湖北 武漢 430050）

0 引言

甲基苯丙胺（methamphetamine，METH）為苯丙胺類(lèi)精神興奮劑，應(yīng)用后會(huì)提高中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)多巴胺（dopamine，DA）水平，產(chǎn)生強(qiáng)烈的欣快效應(yīng)，是一種合成毒品。與傳統(tǒng)毒品主要的鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛作用不同的是，METH具有精神依賴性和神經(jīng)毒性兩個(gè)主要特點(diǎn)，攝入后短時(shí)間即可誘發(fā)神經(jīng)損傷[1]。METH的長(zhǎng)期濫用可促發(fā)成癮者精神疾病和攻擊行為，造成顯著的神經(jīng)退行性改變[2]。METH成癮者普遍表現(xiàn)為嚴(yán)重的依賴性和很高的復(fù)吸率，目前尚無(wú)有效治療藥物。因此，尋求有效、低毒的干預(yù)藥物對(duì)METH成癮患者的臨床治療意義重大。

毒品致病機(jī)制復(fù)雜，近年來(lái)中藥戒毒成為國(guó)內(nèi)外研究的熱點(diǎn)。本課題組為了從中藥中尋找有效的戒毒復(fù)方，進(jìn)行了大量戒毒中藥篩選，制備了由延胡索、黨參、甘草、茯苓、白術(shù)、西洋參、黃芪、當(dāng)歸8味中藥組成的戒毒一號(hào)（Jieduyihao，JDYH）。行為敏化（behavioral sensitization）系指反復(fù)、間斷給予依賴性藥物（如嗎啡、苯丙胺、可卡因、尼古丁、酒精等）后，動(dòng)物對(duì)依賴性藥物的行為效應(yīng)增加，又稱反向耐受[3]。行為敏化是動(dòng)物成癮的主要特征之一，建立行為敏化動(dòng)物模型為研究藥物成癮的神經(jīng)生物學(xué)機(jī)制以及評(píng)價(jià)相關(guān)藥物對(duì)行為敏化的干預(yù)作用提供了重要的試驗(yàn)手段，目前已得到廣泛的研究和應(yīng)用[4-5]。本研究擬通過(guò)考察中藥復(fù)方戒毒一號(hào)對(duì)METH誘導(dǎo)的行為敏化的影響，評(píng)價(jià)戒毒一號(hào)在防治METH成癮中的作用，為戒毒一號(hào)下一步進(jìn)行臨床研究提供依據(jù)。

1 儀器與材料

C57BL/6小鼠，SPF級(jí)，雄性，體重18～ 22 g，動(dòng)物合格證：SCXK（京）2016-0011，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司提供，湖北省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物設(shè)施使用證明由江漢大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供（No.00020518）。將小鼠隨機(jī)分組，每組15只。溫度（22±1）℃，濕度（50±10）%。所有關(guān)于動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的操作均符合江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)要求。

戒毒一號(hào)總重94 g（各組分中藥購(gòu)買(mǎi)自湖北天濟(jì)中藥飲片公司）。用1 400 mL水煎煮中藥至400 mL，濃縮成所需濃度的浸膏，灌胃給藥。METH（純度98%）由湖北省公安廳禁毒總隊(duì)提供，溶于生理鹽水，腹腔給藥。戒毒一號(hào)和METH均現(xiàn)配現(xiàn)用。

小鼠產(chǎn)生行為敏化效應(yīng)的行為特征表現(xiàn)為自發(fā)活動(dòng)顯著升高，主要由其活動(dòng)距離來(lái)反應(yīng)。小鼠的運(yùn)動(dòng)行為由動(dòng)物自發(fā)活動(dòng)視頻分析系統(tǒng)記錄，此系統(tǒng)由8個(gè)等大（25 cm×25 cm×45 cm，長(zhǎng)×寬×高）的隔音箱組成，寧波安來(lái)科技公司制造。本試驗(yàn)METH誘導(dǎo)小鼠的行為敏化的試驗(yàn)方法參考Li JING等[6]的研究。

2 方法

2.1 戒毒一號(hào)單次給藥對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響

取C57BL/6小鼠45只，隨機(jī)分成3組，即對(duì)照組（同體積生理鹽水）、戒毒一號(hào)低劑量組（14.12 g/kg）和戒毒一號(hào)高劑量組（56.48 g/kg）。單次灌胃給藥60 min后進(jìn)行小鼠的自發(fā)活動(dòng)檢測(cè)來(lái)判斷單次灌胃戒毒一號(hào)對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響。測(cè)定60 min，每隔5 min記錄數(shù)據(jù)1次。

2.2 戒毒一號(hào)多次給藥對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響

取C57BL/6小鼠45只，隨機(jī)分成3組，即對(duì)照組（同體積生理鹽水），戒毒一號(hào)低劑量組（14.12 g/kg）和戒毒一號(hào)高劑量組（56.48 g/kg）。形成期各組灌胃相應(yīng)藥物，連續(xù)7 d，轉(zhuǎn)化期停藥7 d（無(wú)任何處理）。第15天，給藥組小鼠給予相應(yīng)劑量的戒毒一號(hào)并檢測(cè)自發(fā)活動(dòng)，觀察戒毒一號(hào)自身是否產(chǎn)生行為敏化。分別在第1天，第7天，第15天給藥60 min后測(cè)定60 min內(nèi)小鼠的自發(fā)活動(dòng)性。詳細(xì)流程見(jiàn)圖1。

2.3 戒毒一號(hào)對(duì)急性METH處理后所導(dǎo)致小鼠高活動(dòng)性增強(qiáng)效應(yīng)的影響

取C57BL/6小鼠60只隨機(jī)分成4組，即對(duì)照組、模型組、戒毒一號(hào)低劑量組（14.12 g/kg）和戒毒一號(hào)高劑量組（56.48 g/kg）。給藥組給予相應(yīng)劑量戒毒一號(hào)，對(duì)照組和模型組均腹腔注射同體積生理鹽水。30 min后，戒毒一號(hào)給藥組和模型組均腹腔注射METH（2 mg/kg），對(duì)照組給予同體積生理鹽水，30 min后測(cè)定60 min內(nèi)小鼠的自發(fā)活動(dòng)。

圖1 戒毒一號(hào)多次給藥對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響流程圖Fig.1 Testing schedule of multiple administrations of JDYH on locomotor activity in mice

2.4 METH誘導(dǎo)的行為敏化

取C57BL/6小鼠30只隨機(jī)分成2組，即對(duì)照組、模型組。形成期模型組每天腹腔注射METH（2 mg/kg），對(duì)照組腹腔注射等量生理鹽水，連續(xù)7 d。轉(zhuǎn)化期停藥7 d無(wú)任何處理。表達(dá)期即第15天，所有動(dòng)物腹腔注射METH（2 mg/kg）激發(fā)，30 min后測(cè)定60 min內(nèi)小鼠的自發(fā)活動(dòng)。詳細(xì)流程見(jiàn)圖2。

圖2 甲基苯丙胺誘導(dǎo)行為敏化流程圖Fig.2 Testing schedule of behavioral sensitization induced by METH in mice

2.5 戒毒一號(hào)對(duì)METH誘導(dǎo)的小鼠行為敏化形成的影響

取C57BL/6小鼠60只隨機(jī)分成4組，即對(duì)照組、模型組、戒毒一號(hào)低劑量組（14.12 g/kg）和戒毒一號(hào)高劑量組（56.48 g/kg）。形成期各組動(dòng)物按劑量灌胃給藥，對(duì)照組和模型組灌胃等量生理鹽水。給藥60 min后，戒毒一號(hào)給藥組和模型組動(dòng)物均腹腔注射METH（2 mg/kg），對(duì)照組給予等體積生理鹽水，連續(xù)7 d。轉(zhuǎn)化期停藥7 d（無(wú)任何處理）。表達(dá)期即第15天，所有動(dòng)物腹腔注射METH（2 mg/kg）激發(fā)，30 min后測(cè)定60 min內(nèi)小鼠的自發(fā)活動(dòng)。詳細(xì)流程見(jiàn)圖3。

圖3 戒毒一號(hào)對(duì)甲基苯丙胺誘導(dǎo)的小鼠行為敏化形成的影響流程圖Fig.3 Testing schedule of JDYH on development of behavioral sensitization induced by METH in mice

2.6 戒毒一號(hào)對(duì)METH誘導(dǎo)的小鼠行為敏化轉(zhuǎn)化的影響

取C57BL/6小鼠60只隨機(jī)分成4組，即對(duì)照組、模型組、戒毒一號(hào)低劑量組（14.12 g/kg）和戒毒一號(hào)高劑量組（56.48 g/kg）。形成期除對(duì)照組腹腔注射生理鹽水外，其他各組動(dòng)物均腹腔注射METH（2 mg/kg），連續(xù)7 d。轉(zhuǎn)化期，停用METH，并分別灌胃生理鹽水或戒毒一號(hào)（14.12、56.48 g/kg），每日1次。表達(dá)期所有動(dòng)物腹腔注射METH（2 mg/kg），30 min后測(cè)定60 min內(nèi)小鼠的自發(fā)活動(dòng)。詳細(xì)流程見(jiàn)圖4。

圖4 戒毒一號(hào)對(duì)甲基苯丙胺誘導(dǎo)的小鼠行為敏化轉(zhuǎn)化的影響流程圖Fig.4 Testing schedule of JDYH on transfer of behavioral sensitization induced by METH in mice

2.7 戒毒一號(hào)對(duì)METH誘導(dǎo)的小鼠行為敏化表達(dá)的影響

取C57BL/6小鼠60只隨機(jī)分成4組，即對(duì)照組、模型組、戒毒一號(hào)低劑量組（14.12 g/kg）和戒毒一號(hào)高劑量組（56.48 g/kg）。形成期除對(duì)照組腹腔注射生理鹽水外，其他各組動(dòng)物均腹腔注射METH（2 mg/kg），連續(xù)7 d。轉(zhuǎn)化期停藥7 d（無(wú)任何處理）。第15天，分別灌胃生理鹽水或戒毒一號(hào)（14.12、56.48 g/kg），30 min后，所有小鼠腹腔注射METH（2 mg/kg），30 min后測(cè)定60 min內(nèi)小鼠的自發(fā)活動(dòng)。詳細(xì)流程見(jiàn)圖5。

圖5 戒毒一號(hào)對(duì)甲基苯丙胺誘導(dǎo)的小鼠行為敏化表達(dá)的影響流程圖Fig.5 Testing schedule of JDYH on expression of behavioral sensitization induced by METH in mice

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

試驗(yàn)采用SPSS 23.0軟件對(duì)所得各項(xiàng)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，試驗(yàn)結(jié)果用±s表示。組間比較采用重復(fù)測(cè)量的方差分析法、單因素方差分析法和LSD檢驗(yàn)，P＜0.05表明差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。試驗(yàn)結(jié)果用Sigmaplot 11.0軟件制作成圖。

3 結(jié)果

3.1 戒毒一號(hào)單次給藥對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響

如圖6所示，與對(duì)照組相比，戒毒一號(hào)低劑量和高劑量組小鼠自發(fā)活動(dòng)計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。表明單次灌胃后，戒毒一號(hào)低、高劑量均對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)沒(méi)有抑制作用。

3.2 戒毒一號(hào)多次給藥對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響

結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，戒毒一號(hào)低、高劑量組小鼠在第1天、第7天和第15天時(shí)，自發(fā)活動(dòng)計(jì)數(shù)差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與給藥第7天比，給藥第15天，戒毒一號(hào)低、高劑量組小鼠自發(fā)活動(dòng)計(jì)數(shù)并未顯著升高，表明戒毒一號(hào)自身不產(chǎn)生行為敏化效應(yīng)，結(jié)果見(jiàn)圖7。

3.3 戒毒一號(hào)對(duì)甲基苯丙胺引起小鼠高活動(dòng)性的影響

結(jié)果表明，單次給予METH（2 mg/kg），可使小鼠自發(fā)活動(dòng)明顯增加（P＜0.01）。在腹腔注射METH前30 min，各給藥組灌胃相應(yīng)劑量戒毒一號(hào)，與模型組相比，戒毒一號(hào)低、高劑量組小鼠自發(fā)活動(dòng)計(jì)數(shù)差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），表明戒毒一號(hào)對(duì)單次給予METH誘發(fā)的小鼠高活動(dòng)性無(wú)顯著影響，結(jié)果見(jiàn)圖8。

圖6 戒毒一號(hào)單次給藥對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響（n=13～15）Fig.6 Effects of a single dose administration of JDYH on locomotor activity in mice

圖7 戒毒一號(hào)多次給藥對(duì)小鼠自發(fā)活動(dòng)的影響（n=14～15）Fig.7 Effects of multiple administrations of JDYH on locomotor activity in mice

圖8 戒毒一號(hào)對(duì)急性甲基苯丙胺處理所致小鼠活動(dòng)效應(yīng)增強(qiáng)的影響（n=13～15）Fig.8 Effects of JDYH on hyperactivity induced by acute administration of METH in mice

3.4 甲基苯丙胺誘導(dǎo)的行為敏化

結(jié)果表明，與對(duì)照組相比，模型組在第1天、第7天和第15天時(shí)，小鼠自發(fā)活動(dòng)性顯著增加（P＜0.01）。且與第1天模型組相比，第7天模型組小鼠活動(dòng)性顯著升高（P＜0.05），表明METH慢性給藥小鼠的自發(fā)活動(dòng)性較單次給予METH（2 mg/kg）引起的小鼠活動(dòng)性增高更明顯，而與第7天模型組相比，第15天模型組小鼠活動(dòng)性也顯著升高（P＜0.05），表明2 mg/kg甲基苯丙胺能誘導(dǎo)行為敏化。結(jié)果見(jiàn)圖9。

圖9 甲基苯丙胺誘導(dǎo)的行為敏化（n=15）Fig.9 Behavioral sensitization induced by METH in mice

3.5 戒毒一號(hào)對(duì)METH誘導(dǎo)的小鼠行為敏化形成的影響

小鼠灌胃生理鹽水或戒毒一號(hào)，30 min后腹腔注射生理鹽水或METH，連續(xù)7 d，停藥7 d。第15天動(dòng)物腹腔注射METH（2 mg/kg）激發(fā)行為敏化。與對(duì)照組相比，模型組小鼠的自發(fā)活動(dòng)計(jì)數(shù)有顯著升高（P＜0.05），表明試驗(yàn)動(dòng)物已穩(wěn)定建立了對(duì)METH的行為敏化。與模型組相比，戒毒一號(hào)低、高劑量組小鼠的自發(fā)活動(dòng)計(jì)數(shù)明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），表明戒毒一號(hào)可以抑制小鼠METH行為敏化的形成。結(jié)果見(jiàn)圖10。

圖10 戒毒一號(hào)對(duì)小鼠甲基苯丙胺行為敏化形成的影響（n=15）Fig.10 Effects of JDYH on development of behavioral sensitization induced by METH in mice

3.6 戒毒一號(hào)對(duì)METH誘導(dǎo)的小鼠行為敏化轉(zhuǎn)化的影響

小鼠慢性METH（2 mg/kg）處理7 d后，第8天至第14天，灌胃生理鹽水或戒毒一號(hào)。第15天所有動(dòng)物腹腔注射METH激發(fā)行為敏化。與對(duì)照組相比，模型組小鼠的自發(fā)活動(dòng)計(jì)數(shù)明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），表明試驗(yàn)動(dòng)物對(duì)METH的行為敏化已建立。與模型組相比，戒毒一號(hào)低、高劑量組小鼠的自發(fā)活動(dòng)計(jì)數(shù)明顯降低（P＜0.05或P＜0.01），表明戒毒一號(hào)可以抑制小鼠METH行為敏化的轉(zhuǎn)化。結(jié)果見(jiàn)圖11。

圖11 戒毒一號(hào)對(duì)小鼠甲基苯丙胺行為敏化轉(zhuǎn)化的影響（n=15）Fig.11 Effects of JDYH on transfer of behavioral sensitization induced by METH in mice

3.7 戒毒一號(hào)對(duì)METH誘導(dǎo)的小鼠行為敏化表達(dá)的影響

小鼠慢性METH（2 mg/kg）處理7 d后，停藥7 d。第15天，腹腔注射METH激發(fā)行為敏化前30 min，灌胃生理鹽水或戒毒一號(hào)。與對(duì)照組相比，模型組小鼠的自發(fā)活動(dòng)計(jì)數(shù)明顯高于對(duì)照組（P＜0.05），表明試驗(yàn)動(dòng)物對(duì)METH的行為敏化已建立。與模型組相比，戒毒一號(hào)低、高劑量組小鼠的自發(fā)活動(dòng)計(jì)數(shù)明顯降低（P＜0.05），表明戒毒一號(hào)可以抑制小鼠METH行為敏化的表達(dá)。結(jié)果見(jiàn)圖12。

圖12 戒毒一號(hào)對(duì)小鼠甲基苯丙胺行為敏化表達(dá)的影響（n=15）Fig.12 Effects of JDYH on expression of behavioral sensitization induced by METH in mice

4 討論

行為敏化可分為3個(gè)階段：形成期、轉(zhuǎn)化期和表達(dá)期，即在反復(fù)給予等量成癮藥物干預(yù)5～7 d（形成期）后，進(jìn)行7～14 d的斷藥處理（轉(zhuǎn)化期），斷藥結(jié)束后的第1天再次給予該藥物，并檢測(cè)動(dòng)物的自發(fā)活動(dòng)（表達(dá)期）。行為敏化效應(yīng)的形成、轉(zhuǎn)化和表達(dá)與藥物成癮導(dǎo)致的反復(fù)強(qiáng)迫性覓藥和復(fù)吸行為密切相關(guān)。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，間斷、重復(fù)腹腔注射METH（2 mg/kg）可以誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生行為敏化，且METH行為敏化小鼠的自發(fā)活動(dòng)性較單次給予METH引起的小鼠活動(dòng)性增高明顯，表明METH引起的行為敏化可能使METH導(dǎo)致的動(dòng)物高活動(dòng)性進(jìn)一步增強(qiáng)。

本研究分別在行為敏化的3個(gè)階段給予戒毒一號(hào)干預(yù)，觀察戒毒一號(hào)對(duì)METH行為敏化的影響。結(jié)果表明，在METH誘導(dǎo)的行為敏化效應(yīng)的不同階段給予戒毒一號(hào)干預(yù)，可影響METH行為敏化的形成、轉(zhuǎn)化和表達(dá)，提示戒毒一號(hào)對(duì)METH成癮行為的形成、轉(zhuǎn)化和表達(dá)有拮抗作用。

本研究發(fā)現(xiàn)單次、多次給予戒毒一號(hào)對(duì)小鼠的自發(fā)活動(dòng)性均無(wú)影響，說(shuō)明戒毒一號(hào)自身不產(chǎn)生敏化效應(yīng)，且無(wú)中樞鎮(zhèn)靜的不良反應(yīng)，排除戒毒一號(hào)通過(guò)抑制小鼠活動(dòng)來(lái)達(dá)到對(duì)行為敏化的抑制作用。研究表明腦內(nèi)DA系統(tǒng)是與行為敏化有關(guān)的重要腦區(qū)[7]。目前占優(yōu)勢(shì)的觀點(diǎn)認(rèn)為成癮藥物通過(guò)激活中腦邊緣多巴胺系統(tǒng)，促進(jìn)了DA的釋放并誘導(dǎo)行為敏化效應(yīng)的發(fā)生[8]。研究表明METH通過(guò)增強(qiáng)DA合成過(guò)程中限速酶（酪氨酸羥化酶）的活性，促進(jìn)DA的合成與釋放，METH還能通過(guò)抑制突觸內(nèi)的囊泡單胺類(lèi)轉(zhuǎn)運(yùn)和DA的單胺氧化酶活性來(lái)抑制多巴胺的代謝，進(jìn)而升高獎(jiǎng)賞腦區(qū)內(nèi)DA的含量，增強(qiáng)DA系統(tǒng)的功能，產(chǎn)生獎(jiǎng)賞效應(yīng)和精神依賴[9-11]。研究表明METH可致海馬、前額葉皮層、紋狀體等腦區(qū)DA含量明顯升高，而腦內(nèi)DA受體興奮與METH成癮相關(guān)[12-13]，提示甲基苯丙胺行為敏化的形成可能與中樞DA能神經(jīng)系統(tǒng)的功能增高有關(guān)。

戒毒一號(hào)中的主要成分延胡索是罌粟科紫堇屬植物延胡索（Corydalis yanhusuoW.T.Wang）的干燥塊莖，中醫(yī)認(rèn)為延胡索辛散溫通，具有活血、行氣、止痛之功效?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，延胡索及其主要成分左旋四氫帕馬?。╨-tetrahydropalmaine，l-THP）均能阻滯甲基苯丙胺導(dǎo)致的紋狀體、伏隔核、前額葉皮層等腦區(qū)中多巴胺受體（dopamine receptor，DAR）的下調(diào)，上調(diào)多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（dopamine transporter，DAT）的表達(dá)，降低DA水平，逆轉(zhuǎn)甲基苯丙胺對(duì)DA神經(jīng)元的損傷，提示延胡索和l-THP治療精神依賴的機(jī)制與其下調(diào)升高的DA水平以及上調(diào)DAT和DAR的表達(dá)有關(guān)[14-16]；說(shuō)明延胡索具有治療METH成癮的應(yīng)用前景，可以通過(guò)抑制伏隔核及尾殼核內(nèi)METH誘導(dǎo)的DA水平的增加來(lái)抑制METH引起的行為敏化[17]；表明戒毒一號(hào)可能通過(guò)調(diào)節(jié)腦內(nèi)DA系統(tǒng)功能來(lái)抑制METH誘導(dǎo)的行為敏化。戒毒一號(hào)中的其他成分被證實(shí)對(duì)神經(jīng)系統(tǒng)有鎮(zhèn)靜[18-19]、催眠[20-21]、抗驚厥[22]作用；具益氣補(bǔ)中、生津養(yǎng)血[23-26]、抗炎[27]等作用。本試驗(yàn)中，推測(cè)戒毒一號(hào)可以提高成癮者免疫力和身體素質(zhì)。本試驗(yàn)首次將戒毒一號(hào)應(yīng)用于METH誘導(dǎo)的行為敏化影響的研究，發(fā)現(xiàn)戒毒一號(hào)對(duì)METH行為敏化的形成、轉(zhuǎn)化和表達(dá)均有拮抗作用，推測(cè)戒毒一號(hào)通過(guò)多途徑拮抗METH引起的DA水平的升高和行為敏化效應(yīng)，但是其具體作用機(jī)制還需進(jìn)一步深入研究。