勵(lì)精圖治
——代謝組學(xué)在精準(zhǔn)化藥物治療中的角色

張 鳳，陳萬生

0 引 言

新陳代謝是活細(xì)胞中全部有序化學(xué)反應(yīng)的總稱，是生物體最基本的生命活動(dòng)過程。機(jī)體無時(shí)無刻不在進(jìn)行著新陳代謝。代謝組學(xué)的本質(zhì)就是系統(tǒng)研究機(jī)體代謝物的變化規(guī)律，揭示在特定時(shí)間點(diǎn)機(jī)體內(nèi)部發(fā)生的生物化學(xué)活動(dòng)，是系統(tǒng)生物學(xué)的重要組成部分［1-2］。代謝組學(xué)的研究目的是通過研究代謝物之間的相互轉(zhuǎn)化與含量水平變化，將這些信息與病理生理過程中的生物化學(xué)以及生理功能改變聯(lián)系起來，發(fā)現(xiàn)潛在的生物標(biāo)志物。代謝物水平受許多因素的影響，包括遺傳、疾病、環(huán)境、藥物、飲食等，故代謝組學(xué)反應(yīng)的是上述因素綜合作用后機(jī)體的代謝組水平特征，是對生命活動(dòng)“最后環(huán)節(jié)”的研究，被譽(yù)為“真實(shí)場景的評估”，與表型最為接近的組學(xué)，最能反應(yīng)機(jī)體未來發(fā)生的變化；且這些特征性代謝物的出現(xiàn)或改變一般遠(yuǎn)早于傳統(tǒng)的病理學(xué)終點(diǎn)。因此，對于特征性代謝物的干預(yù)使得疾病的治療有極大的可能性［3-4］。另外，代謝物的動(dòng)態(tài)特性有助于疾病的診斷和預(yù)后評判，以及預(yù)測和監(jiān)測藥物治療效果，正逐漸成為精準(zhǔn)化藥物治療的有力工具。

1 代謝組學(xué)分析的層次

Fiehn［5］將代謝組學(xué)分析分為以下幾個(gè)層次：代謝物的靶標(biāo)分析，主要針對樣本中的一個(gè)或者幾個(gè)化合物；代謝輪廓分析，對某一特定類別的代謝產(chǎn)物或某一代謝途徑的所有中間物進(jìn)行分析；代謝組學(xué)分析，采用特定的方法對樣本中所有代謝物進(jìn)行定性和定量分析；代謝指紋分析，對樣本進(jìn)行快速分類分析。前3個(gè)層次為靶向代謝組學(xué)技術(shù)，最后1項(xiàng)為非靶向代謝組學(xué)技術(shù)。因此，當(dāng)前一般認(rèn)為非靶向代謝組學(xué)技術(shù)為定性分析，通過差異組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)候選生物標(biāo)志物，提出科學(xué)假設(shè)；靶向代謝組學(xué)技術(shù)為定量分析，以非靶向代謝組學(xué)技術(shù)確定的一組候選生物標(biāo)志物為分析目標(biāo)，通過準(zhǔn)確的定性和定量分析驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)提出的假設(shè)，完成對候選生物標(biāo)志物進(jìn)行篩選、確認(rèn)和驗(yàn)證。

2 代謝組學(xué)的研究方法

2.1樣本類型代謝組學(xué)分析可利用各種生物樣本，從尿液和血液到糞便、滑液、唾液、組織、特定細(xì)胞和腫瘤組織等。血液（以血清和血漿的形式）和尿液是最容易獲取的生物樣本，因?yàn)樗鼈內(nèi)菀淄ㄟ^微創(chuàng)方法對患者及健康人進(jìn)行采集，也不需要對這些類型的生物樣品進(jìn)行額外的研磨或分餾。其中血液所提供的小分子信息多于尿液，相對于尿液而言比較容易保存及前處理，因此成為最佳選擇［6-7］。但兩者也不是萬能的分析樣本，如在風(fēng)濕性疾病患者中，關(guān)節(jié)或骨骼的滑液和組織與發(fā)病機(jī)制的關(guān)系較血液或尿液更為密切［8］。

2.2樣本處理不同的生物樣本需要的前處理方法不同，主要是獲得性質(zhì)、狀態(tài)均一化的樣本，并且盡可能降低生物樣本中的殘留酶、氧化還原反應(yīng)等的影響，一般包括液液萃取、固相萃取、蛋白沉淀、冷凍干燥等。在實(shí)際操作的過程中，樣本的前處理取決于實(shí)驗(yàn)選擇的代謝組學(xué)檢測技術(shù)。如由于尿液中小分子極性物質(zhì)濃度較高，在核磁共振（nuclear magnetic resonance，NMR）檢測時(shí)應(yīng)加入相應(yīng)濃度的緩沖鹽，降低鹽濃度造成的化學(xué)位移偏移和弛豫時(shí)間偏倚；在采用氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（gas chromatography-mass spectrometer，GC-MS）法時(shí)，應(yīng)對樣本進(jìn)行充分的衍生化，增強(qiáng)代謝產(chǎn)物的熱穩(wěn)定性，提高質(zhì)譜離解能力；在進(jìn)行液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用（liquid chromatography-mass spectrometer，LC-MS）分析時(shí)，首先應(yīng)去除生物樣本中的蛋白［9-10］。一般情況下并不會(huì)對生物樣本進(jìn)行多次或者多步驟的處理，以免失去一些內(nèi)源性代謝物的信息。為盡可能降低生物樣本中的殘留酶、氧化還原反應(yīng)等的影響，生物樣本在采集后需要進(jìn)行“淬滅”，最常用的方法是冷凍處理（液氮保存）或者冷甲醇保存等，避免強(qiáng)酸、強(qiáng)堿、高溫等條件，減少代謝物降解［11］。

2.3樣本檢測代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)采集對象種類繁多，所檢測化合物分布類型廣泛、理化性質(zhì)存在明顯差異，因此很難對生物樣本用同一種方法進(jìn)行全面的分析。目前主要的數(shù)據(jù)采集和分析技術(shù)包括NMR、MS和LC、GC、毛細(xì)管電泳（capillary electrophoresis，CE）等技術(shù)聯(lián)用的方式，這些技術(shù)各有千秋、各有側(cè)重，能夠在實(shí)際應(yīng)用的過程中相互補(bǔ)充。

NMR是最先應(yīng)用于代謝組學(xué)研究的技術(shù)，主要優(yōu)點(diǎn)是可以對代謝物進(jìn)行定量分析，對樣本無破壞性，分析速度快，不需要衍生化前處理，不需要樣本分離等；但靈敏度低、檢測動(dòng)態(tài)范圍窄。GC不能直接得到體系中難揮發(fā)的大多數(shù)代謝組分的信息，對于揮發(fā)性較低的代謝產(chǎn)物需要衍生化處理，預(yù)處理過程繁瑣。相比較而言，MS具有較高的靈敏度和專屬性，可以實(shí)現(xiàn)對多個(gè)化合物的同時(shí)快速分析與鑒定［12-14］。因此，隨著質(zhì)譜及其聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，越來越多的研究者將多種LC-MS技術(shù)用于代謝組學(xué)的研究，實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物背景代謝產(chǎn)物的充分表征。在近幾十年以來，質(zhì)譜檢測、分析技術(shù)的發(fā)展逐漸實(shí)現(xiàn)復(fù)雜生物背景的生物樣本的充分表征，使得LC-MS逐漸成為了代謝組學(xué)研究的重點(diǎn)［15-16］。

2.4質(zhì)量保證和質(zhì)量控制質(zhì)量保證（quality assurance，QA）和質(zhì)量控制（quality control，QC）是代謝組學(xué)成功的2個(gè)不可或缺的質(zhì)量管理過程，包括在任何高通量分析化學(xué)實(shí)驗(yàn)室中獲取高質(zhì)量數(shù)據(jù)的應(yīng)用。QA定義了在采集樣品前實(shí)施的所有計(jì)劃和系統(tǒng)活動(dòng)，以確保隨后的分析過程能夠滿足預(yù)定的質(zhì)量要求；QC可定義為在數(shù)據(jù)采集后用于測量和報(bào)告這些質(zhì)量要求的操作技術(shù)和活動(dòng)［17］。對QA而言，樣本采集的分析前階段，包括生物樣本的收集、處理、運(yùn)輸、儲(chǔ)存等變量均可能造成實(shí)驗(yàn)誤差，已被認(rèn)為是造成多數(shù)臨床檢測結(jié)果出現(xiàn)錯(cuò)誤的變量，應(yīng)該在實(shí)驗(yàn)進(jìn)行中予以規(guī)范［18-19］；QC主要參照FDA生物樣本分析方法學(xué)驗(yàn)證指導(dǎo)原則（2018版）和新版中國藥典（2015版）9012生物樣品定量分析方法驗(yàn)證指導(dǎo)原則的要求進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證［20-21］。由于生物標(biāo)志物屬于內(nèi)源性物質(zhì)，不同于藥物這樣的外源性物質(zhì)，有研究者認(rèn)為目前以藥物代謝動(dòng)力學(xué)研究為中心的指南無法充分描述生物標(biāo)志物方法驗(yàn)證［22］。但任何分析方法開發(fā)中的關(guān)鍵點(diǎn)都是驗(yàn)證每個(gè)步驟以獲得可靠和可重復(fù)的結(jié)果，非靶向、靶向代謝組學(xué)并不超出此標(biāo)準(zhǔn)，生物樣本分析的方法值得借鑒和學(xué)習(xí)，包括準(zhǔn)確度、精密度、特異度、最低檢測限、最低定量限等，已經(jīng)成為目前正廣泛使用的有效的驗(yàn)證策略［23］。除此以外，質(zhì)控樣本的制備、數(shù)據(jù)處理方法的應(yīng)用都是分析方法開發(fā)過程中需要考慮的一些環(huán)節(jié)。

在本課題組開展的靶向代謝組學(xué)研究方案中，我們嚴(yán)格參照FDA和中國藥典的相關(guān)指導(dǎo)原則完成完整的方法學(xué)論證；并嚴(yán)格規(guī)范分析前階段中樣本采集、運(yùn)輸?shù)牟僮?，對采血管的使用、樣本的保存條件這兩種主觀因素進(jìn)行了考察與規(guī)范，從檢測結(jié)果穩(wěn)定性和一致性入手，規(guī)范樣本分析前階段的采血管類型和樣本在采血管中的保存時(shí)間，為血漿中氨基酸靶向代謝組學(xué)分析提供質(zhì)量保證，從而對樣本中內(nèi)源性物質(zhì)的真實(shí)情況給予最大程度的還原［24-26］。

2.5數(shù)據(jù)分析與統(tǒng)計(jì)分析代謝組學(xué)的數(shù)據(jù)分析是指將海量的多維數(shù)據(jù)輪廓譜進(jìn)行降維處理，將代謝組學(xué)的變化同環(huán)境、病理、生理的變化聯(lián)系起來，用可視化的數(shù)學(xué)模型將不同狀態(tài)下代謝產(chǎn)物譜表征出來。許多統(tǒng)計(jì)技術(shù)可用于代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的分析，包括單變量和多變量分析［27］。通常分析的起點(diǎn)是代謝物數(shù)據(jù)的QC，即數(shù)據(jù)的預(yù)處理。處理包括如下步驟：即數(shù)據(jù)歸一化，以消除或減少原始數(shù)據(jù)中不必要的總體變化；數(shù)據(jù)標(biāo)準(zhǔn)化，以消除不同代謝物濃度數(shù)量級(jí)的差別，必要時(shí)需對濃度使用數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換，或者消除異方差性的影響，使得數(shù)據(jù)滿足一些線性分析技術(shù)的要求。接下來，進(jìn)行單變量或多變量統(tǒng)計(jì)分析，以確定候選生物標(biāo)志物。在線性回歸模型、廣義線性模型、t檢驗(yàn)或方差分析等單變量分析方法中，對每個(gè)變量分別進(jìn)行檢驗(yàn)。多變量分析在尋找生物標(biāo)志物分類和預(yù)測疾病的許多方面優(yōu)勢明顯，主要包括主成分分析、偏最小二乘判別分析、懲罰回歸模型、隨機(jī)森林模型和支持向量機(jī)等［28］。

2.6候選生物標(biāo)志物及其生物學(xué)意義闡明變量分析獲得的差異化合物稱為候選生物標(biāo)志物，需要對其生物學(xué)意義進(jìn)行挖掘，找出在病理和生理變化下體內(nèi)代謝通路及其相關(guān)基因、酶等的變化，以便后期開展標(biāo)志物驗(yàn)證，確定候選生物標(biāo)志物的應(yīng)用價(jià)值。常用的有DAVID（The Database for Annotation，Visualisation and Integrated Discovery）和IPA（Ingenuity Pathway Analysis）軟件，用于識(shí)別代謝物特征和疾病之間關(guān)聯(lián)的生物學(xué)途徑［29-30］。由于上述軟件需要付費(fèi)，本課題組主要采用建立在網(wǎng)絡(luò)基礎(chǔ)上的代謝通路分析軟件Metaboanalyst分析。通過網(wǎng)絡(luò)富集分析和拓?fù)浞治龅贸龃x網(wǎng)絡(luò)得分（-log P）和影響因子，指出機(jī)體變化下的代謝通路［31］。由此獲得的候選生物標(biāo)志物需要經(jīng)過進(jìn)一步的確認(rèn)，包括代謝通路和臨床試驗(yàn)驗(yàn)證，用以獲得更為準(zhǔn)確的標(biāo)志物信息，由此預(yù)測藥物療效的生物標(biāo)志物對于提高精確醫(yī)學(xué)的發(fā)展至關(guān)重要。目前有關(guān)肺癌分析生物標(biāo)志物的驗(yàn)證是值得參考的案例，可以在Ⅱ期藥物臨床試驗(yàn)伴隨進(jìn)行，其研究結(jié)果可以有4種可能的方法來指導(dǎo)Ⅲ期試驗(yàn)設(shè)計(jì)：使用生物標(biāo)志物驅(qū)動(dòng)的富集設(shè)計(jì)、生物標(biāo)志物分層設(shè)計(jì)、執(zhí)行常規(guī)隨機(jī)設(shè)計(jì)，或在當(dāng)前結(jié)果下放棄/終止［32-33］。

另外，在生物標(biāo)志物檢測開發(fā)的質(zhì)量保證和質(zhì)量控制的條件下，由于檢測方法系統(tǒng)化、自動(dòng)化和標(biāo)準(zhǔn)化的要求，尤其基于質(zhì)譜分析方法的不斷提升使得生物標(biāo)志物檢測試劑盒自動(dòng)化、小型化和普適性的開發(fā)勢在必行。

3 勵(lì)精圖治 挑戰(zhàn)不斷

從2016年腫瘤細(xì)胞具有“重構(gòu)能量代謝體系”的基本特征被揭示后，20世紀(jì)30年代生物學(xué)家Otto Warbug發(fā)現(xiàn)的“瓦爾堡效應(yīng)”（Warburg effect）又開始登上腫瘤研究舞臺(tái)，即糖酵解和三羧酸循環(huán)為主的葡萄糖代謝紊亂是腫瘤細(xì)胞生長增殖過程中的一個(gè)特有代謝特征［34］。因此，基于癌癥代謝的轉(zhuǎn)化性研究是當(dāng)前精準(zhǔn)藥物治療中最有代表性也最具引領(lǐng)性的方向。

陳賽娟院士和賈偉教授合作開展的772份急性髓細(xì)胞白血?。╝cute myeloid leukemia，AML）患者血清代謝組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)AML患者的糖酵解代謝水平非常活躍，患者的糖酵解代謝活性越高，其生存越差，并且確定了血清2-HG水平是一個(gè)較為有效的預(yù)后因子。在此基礎(chǔ)上開展的細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)活躍的糖酵解代謝可顯著降低AML細(xì)胞對化療藥阿糖胞苷的敏感性，且AML細(xì)胞異常活躍的糖酵解代謝可導(dǎo)致骨髓微環(huán)境中葡萄糖水平嚴(yán)重不足。進(jìn)一步的代謝流分析研究發(fā)現(xiàn)AML細(xì)胞啟動(dòng)一個(gè)替代機(jī)制轉(zhuǎn)而利用果糖保持足量的碳源攝取以維持細(xì)胞的惡性增殖，使用RNA沉默技術(shù)干擾AML細(xì)胞的SLC2A5基因表達(dá)，可顯著降低細(xì)胞對果糖的攝取以及果糖誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖，證實(shí)了果糖在腫瘤增殖中的地位。而后，他們在AML動(dòng)物模型中發(fā)現(xiàn)果糖類似物2，5-脫水-D-甘露醇（2，5-AM）對該果糖轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)子GLUT5有高度親和性，與阿糖胞苷聯(lián)合使用后的療效強(qiáng)于兩者中任何一個(gè)單用藥物的效果。這表明，針對GLUT5的小分子化學(xué)藥物或者抗體藥物有望與目前的常用腫瘤化療藥物聯(lián)合使用，可能極大地改善癌癥患者的治療效果［35-36］。由此不難看出，代謝組學(xué)對于疾病機(jī)理的闡明、精準(zhǔn)治療離不開個(gè)體遺傳特征的緊密聯(lián)系；同時(shí)，個(gè)體代謝和遺傳特征之間的緊密聯(lián)系使得研究代謝水平變化的途徑成為可能。為使代謝組學(xué)領(lǐng)域充分發(fā)揮其潛力，研究人員需要考慮代謝物產(chǎn)生的遺傳因素以及這些代謝物在疾病過程中的潛在作用，而不僅僅是揭示代謝物水平的改變。

代謝組學(xué)從發(fā)現(xiàn)至今已經(jīng)有了20多年的歷程，有諸多關(guān)于精準(zhǔn)藥物治療的候選生物標(biāo)志物被發(fā)現(xiàn)；但是真正被運(yùn)用于臨床的比例卻很低。美國梅奧診所提供的測試目錄僅提供了臨床實(shí)踐中使用的幾十種標(biāo)志物。大多數(shù)文獻(xiàn)中基本上是小規(guī)模的初步類型研究，其中許多研究在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)上存在一些問題，如樣本量大小、樣本前處理技術(shù)、疾病組和對照組的選擇、樣本檢測和分析技術(shù)等，甚至可能導(dǎo)致錯(cuò)誤的發(fā)現(xiàn)或遺漏有效的標(biāo)志物信息。其次，基于代謝組學(xué)技術(shù)對生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)階段是最重要、最基礎(chǔ)的階段，但驗(yàn)證和確認(rèn)則是決定生物標(biāo)志物能否應(yīng)用于臨床的關(guān)鍵，而這個(gè)驗(yàn)證過程往往需要若干年代，需要對每種可能的對照組情況，也就是不同的數(shù)據(jù)子集來支持生物標(biāo)志物的應(yīng)用［37］。Henry Nix曾表達(dá)：數(shù)據(jù)的組合不等于信息，信息的組合不等于知識(shí)，知識(shí)的組合不等于智慧，智慧的組合不等于事實(shí)［38］。因此，代謝組標(biāo)準(zhǔn)倡議（metabolomics standards initiative，MSI）發(fā)起并隨后發(fā)表了一系列關(guān)于最低報(bào)告標(biāo)準(zhǔn)的論文，肯定了獨(dú)立驗(yàn)證的必要和價(jià)值。

4 結(jié) 語

代謝組學(xué)研究為對疾病發(fā)生機(jī)制、藥物治療作用提出了各種假設(shè)，為深入了解目標(biāo)人群的治療過程開辟了新的研究領(lǐng)域。作為系統(tǒng)生物學(xué)的組成部分，代謝組的變化與基因組、轉(zhuǎn)錄組和蛋白組變化密切相關(guān)［39］。系統(tǒng)生物學(xué)方法的發(fā)展和各組學(xué)生物標(biāo)志物整合模式將為聯(lián)系復(fù)雜的代謝調(diào)節(jié)與多因素疾病的病因以及為疾病的精準(zhǔn)治療提供新的機(jī)會(huì)，并促進(jìn)系統(tǒng)生物學(xué)在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的進(jìn)步。精準(zhǔn)化藥物治療及其管理的目的是通過驗(yàn)證新的“組學(xué)”技術(shù)整合不同類型數(shù)據(jù)的新方法，最終到達(dá)提高患者群體診斷精度、廣度的目的。精準(zhǔn)化藥物治療的基石和最終驗(yàn)證將是大型的國家隊(duì)列研究，對來自各種來源（如組織學(xué)、DNA、蛋白質(zhì)和RNA、代謝物）的大量數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，以確定疾病風(fēng)險(xiǎn)、治療反應(yīng)和/或預(yù)后的最佳預(yù)測因子。面對如此龐大的數(shù)據(jù)，可以肯定的是，機(jī)器學(xué)習(xí)可以用來挖掘和不斷改進(jìn)算法，以計(jì)算患者的診斷，藥物治療反應(yīng)和預(yù)后等，形成標(biāo)志物組。隨著研究的深入，所建立的算法可以應(yīng)用于普通人群，開展疾病篩查，以確保臨床表征隱性或者亞臨床癥狀患者得到適當(dāng)?shù)淖o(hù)理，真正邁向精準(zhǔn)化藥物治療的路徑。