內(nèi)源性代謝物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)及其在精準(zhǔn)靶向腫瘤治療中的應(yīng)用前景

葉 慧,郝海平

0 引 言

腫瘤中代謝物水平與正常細(xì)胞相比存在顯著差異。越來(lái)越多的研究表明，致癌信號(hào)通路與代謝活動(dòng)之間存在緊密聯(lián)系［1-2］，代謝重編程在癌癥中的重要性正日益得到承認(rèn)。代謝重編程使腫瘤細(xì)胞高度依賴于特定代謝通路、代謝酶，而代謝物除了作為代謝轉(zhuǎn)化中的中間體，也可通過直接或間接作用進(jìn)一步觸發(fā)腫瘤細(xì)胞的多種信號(hào)通路，對(duì)蛋白網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行調(diào)控。研究表明，代謝物在細(xì)胞內(nèi)往往存在多個(gè)作用靶標(biāo)，而同一靶蛋白同時(shí)也可受到多種代謝物的共同調(diào)節(jié)［3］。因此，在復(fù)雜的腫瘤代謝網(wǎng)絡(luò)中明確功能性代謝物的作用靶標(biāo)與調(diào)節(jié)機(jī)制成為腫瘤靶向治療的新途徑。隨著質(zhì)譜技術(shù)的發(fā)展，其在小分子靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)領(lǐng)域顯示出卓越的優(yōu)勢(shì)。目前，基于質(zhì)譜的小分子藥物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)方法按照是否對(duì)小分子進(jìn)行官能基團(tuán)的修飾這一標(biāo)準(zhǔn)可分為非修飾及修飾的靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)方法。也有研究者將這些方法應(yīng)用于內(nèi)源性代謝物的靶蛋白發(fā)現(xiàn)的研究中［4-5］。為促進(jìn)內(nèi)源性代謝物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)在腫瘤靶向治療策略開發(fā)中的研究，本文將對(duì)腫瘤內(nèi)代謝紊亂的特點(diǎn)，代謝調(diào)節(jié)對(duì)腫瘤的影響及現(xiàn)有基于質(zhì)譜的內(nèi)源性代謝物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)方法進(jìn)行闡述，以突出內(nèi)源性代謝物在腫瘤治療中的關(guān)鍵作用，為腫瘤治療提供新方向。

1 代謝調(diào)控治療腫瘤

在正常生理?xiàng)l件下，細(xì)胞的能量來(lái)源于葡萄糖的氧化分解，而在缺乏氧氣的生理?xiàng)l件下，細(xì)胞的能量來(lái)源會(huì)切換至葡萄糖的糖酵解通路。早在20世紀(jì)初時(shí)，Warburg［6］研究發(fā)現(xiàn)，即使處于氧氣足夠的環(huán)境之中，腫瘤細(xì)胞依然選擇以糖酵解的方式為生長(zhǎng)提供能量，即著名的Warburg效應(yīng)。谷氨酰胺分解是腫瘤細(xì)胞第二大能量來(lái)源方式，其催化、脫氫過程中的中間產(chǎn)物可參與三羧酸底物循環(huán)，從而為腫瘤細(xì)胞供能［7］。此外，腫瘤細(xì)胞為了維持自身增殖所需的高能量，也會(huì)增強(qiáng)脂質(zhì)代謝通路［8］。這種腫瘤代謝模式的重編程現(xiàn)象的終極目的是為了滿足腫瘤快速生長(zhǎng)和增殖過程中所需要的大量能量和生物合成原料［6］。

基于腫瘤與正常組織相比的代謝差異，研究人員嘗試靶向腫瘤細(xì)胞內(nèi)能量代謝通路，以期通過阻斷供能通路產(chǎn)生抗腫瘤作用，實(shí)現(xiàn)腫瘤靶向治療。如Wang等［9］針對(duì)絲氨酸合成通路中磷酸甘油脫氫酶（phosphoglycerate dehydrogenase，PHGDH）進(jìn)行結(jié)構(gòu)及其功能研究，通過設(shè)計(jì)小分子肽抑制劑靶向調(diào)控腫瘤代謝中的絲氨酸合成通路以治療腫瘤。目前已有PHGDH的靶向制劑NCT-502和NCT-503能夠通過靶向絲氨酸合成通路對(duì)抗腫瘤［10］。基于通過精準(zhǔn)靶向腫瘤中異?；钴S的糖代謝、NAD+合成、谷氨酰胺代謝、脂肪酸合成等腫瘤代謝通路來(lái)抑制腫瘤生長(zhǎng)的策略，目前已有多種代謝酶抑制劑/激活劑類藥物正處于臨床或臨床前研究階段［11-12］。

除經(jīng)典的糖酵解、谷氨酸代謝通路，研究發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞內(nèi)某些內(nèi)源性代謝物能夠通過結(jié)合并非其上下游合成/代謝酶等新靶標(biāo)調(diào)控其活性，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和免疫調(diào)節(jié)中發(fā)揮作用［4］。如2-羥基戊二酸（2HG）是異檸檬酸脫氫酶（isocitrate dehydrogenase，IDH）突變的產(chǎn)物，在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中由于IDH酶的突變產(chǎn)生蓄積。Evans和Griner［13］研究發(fā)現(xiàn)，2HG可以通過競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合α-酮戊二酸依賴的酶，導(dǎo)致包括組蛋白去甲基化酶、甲基胞核嘧啶雙氧化酶和脯氨酸羥化酶等活性失調(diào)，進(jìn)而導(dǎo)致腫瘤發(fā)生全基因組組蛋白和DNA甲基化改變。目前，針對(duì)介導(dǎo)2HG代謝物生成的IDH酶突變體開發(fā)的Enasidenib已獲批用于治療急性髓性白血病。這提示我們研究腫瘤中異常表達(dá)的致癌代謝物2-HG及其作用靶標(biāo)為腫瘤治療提供了新的策略和途徑。

在免疫調(diào)節(jié)方面，Kornberg等［14］曾發(fā)現(xiàn)富馬酸二甲酯可以催化糖酵解代謝酶GAPDH琥珀?；蛊涫Щ睿瑥亩抡{(diào)活化的髓細(xì)胞和淋巴細(xì)胞中的有氧糖酵解，介導(dǎo)其抗炎作用，揭示了富馬酸二甲酯對(duì)免疫調(diào)節(jié)的機(jī)制作用。Galván-Pe?a等［15］學(xué)者研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性代謝物丙二酰輔酶A在LPS刺激的巨噬細(xì)胞中催化GAPDH丙二?；?，釋放與GAPDH結(jié)合的TNFαmRNA，促進(jìn)TNFα翻譯，進(jìn)一步加重炎癥。Geiger等［16］學(xué)者發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性代謝物L(fēng)-精氨酸參與調(diào)節(jié)T細(xì)胞代謝。激活的T細(xì)胞中L-精氨酸含量的提升可誘導(dǎo)細(xì)胞代謝方式從糖酵解轉(zhuǎn)變?yōu)檠趸姿峄龠M(jìn)T細(xì)胞存活。進(jìn)一步，該研究在體外和體內(nèi)模型均證實(shí)了T細(xì)胞內(nèi)的精氨酸濃度直接影響了其代謝適應(yīng)性與存活能力，進(jìn)而發(fā)揮抗腫瘤活性，在體抑制腫瘤的生長(zhǎng)。因此，對(duì)于免疫細(xì)胞的代謝物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)為通過激活腫瘤患者的免疫系統(tǒng)發(fā)揮抗腫瘤活性的治療策略提供了新的可能。

上述研究均表明，通過調(diào)控腫瘤及免疫細(xì)胞代謝對(duì)抗腫瘤的研究策略對(duì)于抗腫瘤藥物研發(fā)具有巨大的科學(xué)和轉(zhuǎn)化價(jià)值。然而，大多數(shù)在腫瘤中異常表達(dá)的功能性代謝物的作用靶標(biāo)及對(duì)機(jī)體的調(diào)控機(jī)制尚不明確，對(duì)其直接作用靶標(biāo)認(rèn)識(shí)的缺失阻礙了通過調(diào)控腫瘤和免疫代謝進(jìn)行抗腫瘤藥物研發(fā)的深入，提示我們針對(duì)內(nèi)源性代謝物的體內(nèi)作用靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)技術(shù)亟待突破。

2 內(nèi)源性代謝物靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)方法

腫瘤細(xì)胞會(huì)通過代謝模式的改變來(lái)適應(yīng)自身增殖的需要。鑒于闡明致癌信號(hào)通路與代謝活動(dòng)之間復(fù)雜的相互作用機(jī)制在抗腫瘤藥物研發(fā)中的重要作用，建立調(diào)控腫瘤代謝的關(guān)鍵內(nèi)源性代謝物的靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)方法將成為腫瘤精準(zhǔn)治療研究的關(guān)鍵技術(shù)和突破口。

2.1非修飾方法尋找內(nèi)源性代謝物靶標(biāo)藥物親和致靶點(diǎn)穩(wěn)定性（drug affinity responsive target stability，DARTS）是不對(duì)目標(biāo)化合物進(jìn)行修飾的靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)策略中經(jīng)典的方法之一。2009年，Lomenick等［17］基于小分子與靶蛋白的親和作用增加靶蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性，從而抵抗蛋白酶水解這一原理，基于凝膠電泳、染色和質(zhì)譜鑒定識(shí)別出目標(biāo)小分子的作用靶點(diǎn)。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于不僅不需要標(biāo)記和修飾目標(biāo)分子，還能廣泛應(yīng)用于各種天然狀態(tài)的生物體系。2017年，Li等［18］采用DARTS方法，運(yùn)用代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)了內(nèi)源性小分子代謝物丁酸的靶蛋白丙酮酸激酶，闡明丁酸通過誘導(dǎo)結(jié)腸癌細(xì)胞的代謝重排，限制其增殖所需的生物原料的獲得，最終抑制結(jié)腸癌細(xì)胞增殖的代謝調(diào)控機(jī)制。盡管應(yīng)用廣泛、操作簡(jiǎn)便，但DARTS方法有自身的局限性，包括不適合用于發(fā)現(xiàn)與目標(biāo)分子的結(jié)合親和力較弱的靶蛋白，以及無(wú)法用于發(fā)現(xiàn)與靶分子結(jié)合后構(gòu)象沒有發(fā)生顯著性變化的靶標(biāo)等問題。

細(xì)胞熱轉(zhuǎn)變分析（Cellular Thermal Shift Assay，CETSA）是基于目標(biāo)小分子與靶蛋白結(jié)合后靶蛋白的熱穩(wěn)定性增加，借助定量質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)和識(shí)別目標(biāo)分子結(jié)合的靶蛋白。該技術(shù)能在天然的細(xì)胞環(huán)境中進(jìn)行，也無(wú)需對(duì)目標(biāo)分子和蛋白進(jìn)行任何修飾以及標(biāo)記。目前已證實(shí)該技術(shù)能識(shí)別許多已知的抗癌試劑的靶點(diǎn)，如在細(xì)胞裂解液、完整細(xì)胞或組織樣本中均鑒定出甲氨喋呤、雷替曲塞、TNP-470的作用靶標(biāo)。在內(nèi)源性代謝物方面，Hashimoto等［19］驗(yàn)證了內(nèi)源性小分子L-乳酸可以與跨膜蛋白SLC16A1結(jié)合并起到穩(wěn)定蛋白構(gòu)象的作用。然而，CETSA方法不適用于高度不均勻的蛋白質(zhì)或蛋白質(zhì)配體結(jié)合域的結(jié)構(gòu)展開，并不會(huì)誘導(dǎo)蛋白的聚集和變性的情況，如DNA和伴侶蛋白質(zhì)的結(jié)合［20-21］。

蛋白有限水解質(zhì)譜（Limited Proteolysis-Mass Spectrometry，LiP-MS）通過在復(fù)雜生物體系中識(shí)別由于配體結(jié)合引起蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變，導(dǎo)致限制性酶切程度的變化，從而識(shí)別出藥物結(jié)合的靶蛋白及其作用位點(diǎn)。該方法的優(yōu)點(diǎn)在于當(dāng)與靶向蛋白組學(xué)測(cè)量工具串聯(lián)使用時(shí)，可在蛋白質(zhì)組層面實(shí)現(xiàn)高靈敏度、可重復(fù)性、高通量的靶點(diǎn)篩選，且不需要對(duì)配體進(jìn)行化學(xué)修飾［22］。Feng等［3］通過LiP技術(shù)發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性代謝物FBP可以通過結(jié)合Cdc19蛋白改變其構(gòu)象并進(jìn)一步激活其代謝酶活性，此外還鑒定出內(nèi)源性代謝物FBP新的靶蛋白Fas1/2，并在體外實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證了FBP對(duì)其酶活的影響。然而，LiP-MS對(duì)靶標(biāo)的檢測(cè)受靶蛋白豐度的影響，當(dāng)靶蛋白以較低的豐度存在于復(fù)雜的生物基質(zhì)中，LiP-MS對(duì)靶標(biāo)的檢測(cè)存在難度［20］。此外，限制性酶切質(zhì)譜方法提供的結(jié)構(gòu)信息有限，且在對(duì)細(xì)胞中蛋白的處理過程中可能會(huì)引起靶蛋白的結(jié)構(gòu)改變，從而產(chǎn)生假陽(yáng)性結(jié)果的可能性難以完全規(guī)避［23］。

與上述方法相比，非變性質(zhì)譜技術(shù)是一種非標(biāo)記的分析技術(shù)，其特點(diǎn)在于能夠直接觀測(cè)到目標(biāo)分子與靶蛋白的結(jié)合。該技術(shù)利用電噴霧電離將非共價(jià)復(fù)合物從溶液中轉(zhuǎn)移到氣相中，再通過測(cè)量配體和蛋白復(fù)合物的信號(hào)，并結(jié)合計(jì)量數(shù)獲取目標(biāo)分子與靶蛋白結(jié)合的親和力［24-25］。Gan等［26］通過非變性質(zhì)譜技術(shù)發(fā)現(xiàn)細(xì)胞裂解液中PHGDH可與4個(gè)NAD+分子結(jié)合，氧化還原酶CBR3蛋白也存在與NADPH結(jié)合的形式，發(fā)現(xiàn)了NADPH的新結(jié)合靶點(diǎn)。此外，Zheng等［27］還基于非變性質(zhì)譜技術(shù)，開發(fā)了原態(tài)-變性交換質(zhì)譜（Native-Denatured Exchange-Mass Spectrometry，NDX-MS）的方法，實(shí)現(xiàn)進(jìn)一步區(qū)分特異性和非特異性的相互作用，以期發(fā)現(xiàn)小分子的特異性結(jié)合蛋白［28］。但該方法對(duì)儀器的要求較高，對(duì)樣品的純度以及同質(zhì)性方面的要求也對(duì)其廣泛應(yīng)用于靶標(biāo)篩選有所限制。

2.2基于修飾目標(biāo)分子的方法尋找內(nèi)源性代謝物靶標(biāo)親和純化色譜是用于識(shí)別蛋白質(zhì)和配體相互作用最為經(jīng)典并廣泛使用的方法之一。傳統(tǒng)的親和層析是將感興趣的目標(biāo)藥物或小分子配體通過可衍生化的官能團(tuán)固定在固相基質(zhì)上，將修飾后的固相介質(zhì)與細(xì)胞裂解液孵育，使得藥物或小分子選擇性的與靶蛋白結(jié)合，用洗脫液除去不與目標(biāo)小分子結(jié)合的蛋白，利用變性劑或競(jìng)爭(zhēng)性的游離藥物洗脫靶蛋白，進(jìn)而用質(zhì)譜鑒定靶標(biāo)［29-30］。該方法成功運(yùn)用于多種小分子的靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)研究。Trzoss等［31］發(fā)現(xiàn)天然產(chǎn)物半醌對(duì)黑色素瘤細(xì)胞系具有選擇性細(xì)胞毒作用，通過親和純化色譜方法鑒定出其結(jié)合的靶蛋白為皮離蛋白。該作用靶標(biāo)的明確為開發(fā)治療黑素瘤提供了新思路，而使用皮離蛋白作為開發(fā)靶向療法的生物標(biāo)志物則可以加速個(gè)性化治療的發(fā)展。但由于該策略的開始依賴于對(duì)目標(biāo)化合物的修飾，而對(duì)目標(biāo)小分子的修飾有可能會(huì)干擾其與靶蛋白的相互作用，故也存在局限。

基于親和力的蛋白質(zhì)分析（Affinity-based protein profiling，ABPP）是目前用于藥物靶標(biāo)鑒定的前沿化學(xué)蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)。它主要通過開發(fā)基于小分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行化學(xué)修飾，如與熒光基團(tuán)、親和基團(tuán)的連接而成的探針。該類探針能夠在細(xì)胞環(huán)境直接與潛在的靶蛋白共價(jià)結(jié)合，或基于光交聯(lián)反應(yīng)與靶蛋白產(chǎn)生共價(jià)結(jié)合，通過親和富集或通過凝膠電泳對(duì)與目標(biāo)小分子產(chǎn)生結(jié)合的蛋白進(jìn)行鑒定，即可獲取目標(biāo)分子的靶標(biāo)信息。該類親和探針在鑒定低豐度靶標(biāo)方面有優(yōu)異的能力，并能獲取在細(xì)胞及組織內(nèi)與目標(biāo)分子產(chǎn)生原位親和作用的靶蛋白信息。Hulce等［32］通過使用光親和性甾醇類探針結(jié)合定量質(zhì)譜方法，在HeLa細(xì)胞中鑒定出超過250種膽固醇的結(jié)合蛋白，并驗(yàn)證出其中7個(gè)代表性蛋白與膽固醇之間的相互作用。Moraru等［33］通過合成了糖代謝的副產(chǎn)物丙酮醛（methylglyoxal，MGO）探針，發(fā)現(xiàn)MGO的靶標(biāo)為脂肪酸合成酶，闡明了由于MGO生成增加或是MGO解毒機(jī)制受阻引起的MGO水平上升抑制胰島素信號(hào)誘導(dǎo)2型糖尿病的發(fā)病機(jī)制。

3 代謝物作用靶標(biāo)的發(fā)現(xiàn)在開發(fā)腫瘤精準(zhǔn)治療新策略中的前景

由于疾病的異質(zhì)性和患者的個(gè)體差異不同，腫瘤個(gè)體對(duì)藥物的敏感性和耐藥性也存在顯著差異。為向患者提供副作用小而又最為有效的治療，腫瘤精準(zhǔn)治療的概念應(yīng)運(yùn)而生。鑒于腫瘤細(xì)胞內(nèi)明顯的代謝重編程與腫瘤惡性程度、浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移能力等特點(diǎn)密切相關(guān)，靶向腫瘤中異常活躍的代謝通路成為精準(zhǔn)抗腫瘤藥物的新靶點(diǎn)［34］。另一方面，在給予傳統(tǒng)化療藥物的同時(shí)，共同給予代謝酶抑制劑/激活劑類小分子調(diào)節(jié)腫瘤代謝狀態(tài)能夠顯著增強(qiáng)抗腫瘤藥效，如抗腫瘤藥物mTOR通路抑制劑雷帕霉素與糖酵解通路阻斷劑3-BrOP的聯(lián)用能夠顯著增強(qiáng)其對(duì)淋巴瘤與白血病細(xì)胞的殺傷能力［35］；降低葡萄糖水平能夠增加多種腫瘤細(xì)胞系對(duì)5-FU和順鉑的藥物耐藥性［36］；L1210細(xì)胞中二氫葉酸水平的升高能夠逆轉(zhuǎn)甲氨喋呤對(duì)二氫葉酸還原酶的抑制作用等［37］。但這種代謝水平變化增敏化療藥物的機(jī)制尚不完全明確。

因此，在“談癌色變”的今天，深入探究腫瘤細(xì)胞中代謝重編程現(xiàn)象導(dǎo)致的內(nèi)源性代謝物失衡，并基于修飾和非修飾蛋白組學(xué)進(jìn)行代謝物的靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)研究，以探尋代謝物平衡失調(diào)與腫瘤發(fā)生、發(fā)展相關(guān)聯(lián)的機(jī)制，進(jìn)而根據(jù)腫瘤內(nèi)源性代謝物在體內(nèi)的作用靶標(biāo)，促進(jìn)基于代謝靶標(biāo)的新藥研發(fā)或開發(fā)與傳統(tǒng)化療藥物共同給藥的新模式這一研究方向具有重要的科學(xué)和轉(zhuǎn)化價(jià)值，為臨床腫瘤患者的個(gè)性化精準(zhǔn)治療提供了新的視角。