肝豆狀核變性ATP7B基因突變的研究進展

黃 艷，劉志峰

(南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院消化科，南京 210008)

肝豆狀核變性又稱Wilson病，是一種以銅代謝障礙為特征的常染色體單基因隱性遺傳疾病，病變主要累及肝臟、腦、腎臟和角膜等部位，引起進行性加重的肝硬化、基底節(jié)損害、腎臟損害及角膜色素環(huán)等[1]。肝豆狀核變性由ATP7B基因突變引起，該基因編碼銅轉運P型ATP酶(copper-transporting P-type ATPase,ATP7B)。ATP7B是一種表達在多器官的膜蛋白，主要功能是促進銅隨血液及膽汁排泄。當ATP7B基因發(fā)生突變時，ATP7B在細胞內的定位發(fā)生改變，其轉運銅能力下降，引起血清銅藍蛋白合成減少、膽管排銅受阻。過量的銅蓄積在體內，引起細胞壞死和器官損害，后期嚴重影響患者的生活質量，最終可引起死亡。目前，肝豆狀核變性的診斷主要依靠典型的臨床表現(xiàn)、實驗室檢查及基因檢測，治療包括青霉胺、鋅制劑和肝移植等。早期診斷和早期干預對于延緩疾病的進展和預防不可逆的后遺癥至關重要。目前，肝豆狀核變性的全球患病率大約為1/3萬，在隔離人群(如撒丁島)中，患病率可達1/1萬[2-3]，中國香港漢族患病率高達1/5 400[4]。目前對于ATP7B基因突變導致肝豆狀核變性的具體分子機制尚不完全清楚?，F(xiàn)就肝豆狀核變性ATP7B基因突變的研究進展進行綜述。

1 ATP7B分子結構、定位及銅運輸功能

1.1ATP7B蛋白分子結構ATP7B基因位于第13號染色體長臂(13q14.3～q21.1)，全長約85 kb，包含21個外顯子和20個內含子，編碼一種由1 465個氨基酸組成的ATP7B。ATP7B屬于跨膜蛋白，含6個N端金屬結合域(N-terminal metal-binding domain,MBD)，每個金屬結合域都含一段高度保守重復序列蛋氨酸-X-半胱氨酸-X-X-半胱氨酸，8個跨膜通道(transmembrane domain,TM-區(qū))，1個ATP結合區(qū)(nucleotide-binding domain,N-區(qū))，1個磷酸化區(qū)(phosphorylation domain,P-區(qū))，1個磷酸酶區(qū)(phosphatase domain,A-區(qū))[5-6]。MBD與銅有高親和力，與抗氧化蛋白1(antioxidant-1,Atox-1)相互作用下接受來自細胞質的銅離子，并促進銅釋放到跨膜孔道中[7]。MBD1～4主要調控其自身間的相互作用，MBD5～6是銅結合位點，能影響ATP7B蛋白的活性及催化能力[8]。半胱氨酸-脯氨酸-半胱氨酸序列位于第6跨膜通道，可選擇性通過金屬銅離子[6]。

如果ATP7B基因突變的殘基是與ATP或銅的結合的關鍵位點，可能會引起ATP7B功能的完全喪失；如果突變只是影響對底物的親和力、減緩構象轉變或影響蛋白質的定位，ATP7B可能保留部分轉運功能[9]。

1.2ATP7B定位及銅運輸功能 ATP7B是一種高度表達在肝細胞反式高爾基體網絡的跨膜蛋白。銅主要在十二指腸吸收，通過高親和力銅轉運蛋白1參與肝腸循環(huán)。到達肝細胞后，銅和金屬分子伴侶Atox-1結合并形成復合物，然后與ATP7B以蛋白-蛋白的形式相互作用。銅在ATP7B作用下被轉運至反式高爾基體網絡，并與相關的酶結合，形成血清銅藍蛋白，隨血液代謝；當肝細胞內的銅離子水平升高至一定程度時，ATP7B從反式高爾基體網絡轉運至溶酶體，將過量的銅運輸?shù)侥遗?，銅經胞吐作用隨膽汁排泄[10]。在這一過程中，ATP7B借助ATP水解釋放的能量磷酸化，隨后脫磷酸化釋放銅跨膜所需的能量。因此，ATP7B依賴性膽汁銅排泄是維持銅代謝平衡的主要方式。

2ATP7B基因突變類型及特點

肝豆狀核變性ATP7B基因突變類型多樣，目前人類基因突變數(shù)據(jù)庫已收錄780種ATP7B基因突變，包括491種錯義/無義突變、65種剪切位點突變、187種小缺失/插入突變、12種大片段缺失。突變可能發(fā)生在基因的任何位置，包括外顯子、內含子，甚至是啟動子區(qū)域。

ATP7B基因突變在不同種族和地域中存在遺傳異質性。歐洲人群最常見的突變類型是14號外顯子上的H1069Q突變，在意大利、瑞典和羅馬尼亞等地多見，等位基因頻率為30%～70%[11-12]，臨床主要以錐體外系癥狀為主，如震顫、肌張力障礙、精神癥狀等。亞洲人群最常見的突變類型是8號外顯子上的錯義突變R778L，以中國、韓國和日本最多見，其等位基因頻率為17.3%～60%[4,13]，臨床以肝臟方面癥狀為主，如肝功能異常、肝硬化、肝脾大等；其余常見的還有P992L、Q1399R等。

不同區(qū)域發(fā)生突變的概率不同。①MBD區(qū)(與1～6號外顯子相關)：目前已報道位于該區(qū)的錯義突變有18種，如位于MBD1的G85V，該突變抑制ATP7B與Atox-1的相互作用，影響蛋白和銅的結合[14]；②半胱氨酸-脯氨酸-半胱氨酸跨膜轉運區(qū)(與7～10、12、13號外顯子相關)：目前報道有103種突變，如R778L、G937S，該區(qū)突變主要通過改變蛋白的定位影響其功能[14]；③A-區(qū)(與11號外顯子相關)：目前發(fā)現(xiàn)有22種突變，該區(qū)域突變可導致ATP7B超磷酸化，引起催化活性的喪失[14]；④P-區(qū)(與14～16號外顯子相關)：有47種突變，如I1148T；⑤N-區(qū)(與17～18號外顯子相關)：有超過55種突變，該區(qū)突變和P-區(qū)一起影響蛋白和ATP的結合，造成功能缺失[14-15]。但即使突變替換的氨基酸發(fā)生在同一區(qū)域，其編碼的蛋白功能改變也不完全相同。

3ATP7B基因突變的致病機制

目前，ATP7B基因突變功能研究以錯義突變?yōu)橹鳎蛔冎饕ㄟ^影響蛋白的合成、折疊、定位及降解等過程引起ATP7B蛋白轉運功能的減弱或缺失，最終引起銅的沉積。ATP7B基因突變可抑制法尼酯X受體/短異二聚體伴侶通路，引起膽汁酸生成增加，肝功能受損，導致膽汁淤積。銅代謝的主要途徑是膽汁，發(fā)生膽汁淤積時，進一步影響銅的代謝，從而引起惡性循環(huán)[16]。

3.1ATP7B基因突變影響mRNA轉錄 前體mRNA的選擇性剪接是真核生物增加蛋白質多樣性的重要手段，對于基因表達非常重要，包括5′和3′端剪接等。剪接受順式作用元件和反式作用因子的調控，如剪接增強子、沉默子等。ATP7B基因中大約有10%的致病突變發(fā)生在外顯子和內含子連接處的保守剪接位點。研究發(fā)現(xiàn)，肝豆狀核變性患兒攜帶ATP7B基因錯義突變R919G，該突變位于外顯子剪接調控元件區(qū)，引起外顯子跳躍及氨基酸改變[17]。體內外實驗表明R919G出現(xiàn)外顯子跳躍，引起剪接增強子破壞、沉默子出現(xiàn)，從而影響外顯子12的剪接，引起蛋白功能的缺失[17]。因此，ATP7B基因點突變可能引起嚴重的mRNA異常剪接，而不是對編碼潛能的直接影響。

c.1707+5G>A突變位于5′剪接位點，影響前體mRNA的剪接。Liu等[18]利用剪接異常體外功能驗證實驗(minigene技術)對該突變進行分析，發(fā)現(xiàn)c.1707+5G>A轉錄產物出現(xiàn)外顯子4缺失，其擴增長度為293 bp，較野生型的457 bp明顯縮短；其mRNA表達水平較野生型明顯下降。外顯子4跳躍引起終止密碼子提前出現(xiàn)，導致ATP7B蛋白合成提前終止，銅離子通道失活。無義介導的mRNA降解途徑是真核細胞中重要的RNA監(jiān)控機制，可識別并降解開放閱讀框中含有提前終止密碼子的mRNA，消除異常的剪接形式，避免因截短的蛋白產物積累對細胞造成毒害。

3.2ATP7B基因突變導致ATP7B蛋白結構改變 S653Y突變位點位于一段高度保守區(qū)域：G621-S668，在MBD6和TM1之間。該突變不會影響蛋白的定位及其折疊結構，能正常運輸銅至反式高爾基體網絡，不影響血清銅藍蛋白的形成；但當細胞內的銅水平升高至一定閾值時，ATP7B仍位于高爾基體內，無法攜銅轉運至細胞膜。Braiterman等[19]研究發(fā)現(xiàn)S653Y突變引起跨膜段TM1內的局部變形，導致跨膜區(qū)TM1和TM2的相互作用改變，從而影響ATP7B從反式高爾基體網絡轉運至溶酶體的過程。

突變位點在MBD4的G386V和G386D，與野生型相比，其蛋白結構的熱穩(wěn)定性降低、活動性增強。在10 ℃以下時，大部分MBD4突變體蛋白很穩(wěn)定，即能正確折疊并且能結合銅，但G386V和G386D不能得到有效折疊。二級結構分析顯示：G386V蛋白喪失部分α-螺旋，β-折疊含量增多；而G386D突變蛋白失去β-折疊結構。與野生型相比，這兩種突變蛋白的結構對稱性增強[20]。熱穩(wěn)定性研究表明，這兩種突變蛋白去折疊的熱溫度中點在40～50 ℃，較野生型的75 ℃明顯下降，提示其蛋白穩(wěn)定性降低[20]。MBD結構的不穩(wěn)定性直接或間接影響ATP7B各結構域的相互聯(lián)系，進而影響ATP7B和Atox-1的作用，增加與COMMD-1的相互作用[20]。COMMD-1是一個負性調節(jié)蛋白穩(wěn)定性的因子，可以誘導ATP7B的降解及降低銅轉運活性。

3.3ATP7B基因突變引起ATP7B蛋白定位異常及表達量減少 ATP7B是定位于反式高爾基體的膜蛋白，主要利用水解ATP釋放的能量，將銅排出體外，維持體內銅離子的平衡；突變型ATP7B可滯留在內質網，無法攜銅轉運，引起銅在肝臟、腦等部位沉積。Huster等[9]對25種突變型ATP7B蛋白的銅轉運功能進行研究，發(fā)現(xiàn)其中大部分突變蛋白的銅轉運速率降低、承載銅離子數(shù)量減少；其中有16種突變蛋白的銅轉運能力僅有野生型的5%～10%，甚至更低，包括D1027A、H1069Q、P840L等；有8種突變保留部分轉運能力，如位于A-區(qū)的A874V、I857T；而只有M645R突變表現(xiàn)出銅過載現(xiàn)象。研究者將野生型及突變型ATP7B基因質粒轉染至HEK293T和Sf9細胞，利用免疫熒光技術檢測ATP7B蛋白在細胞中的定位，結果顯示R969Q(突變位點在MBD區(qū))蛋白定位在反式高爾基體網絡，與野生型一致；L1083F(突變位點在N-區(qū))和A874V(突變位點在A-區(qū))蛋白定位于內質網，定位改變；這三者突變型蛋白表達量較野生型均有明顯減少。Guttmann等[21]對L168P和S1423N研究發(fā)現(xiàn)前者蛋白表達量為野生型的(34.3±8)%，后者為(66.0±8)%。轉運實驗表明，L168P呈現(xiàn)出銅依賴性，S1423N則對銅水平升高無任何反應。ATP7B突變蛋白的錯誤定位及表達量減少均可導致其轉運銅能力下降。

3.4ATP7B基因突變加快ATP7B蛋白的降解 由p38和c-Jun氨基端激酶(c-Jun N-terminal kinase，JNK)介導的促分裂原活化的蛋白激酶信號通路可影響蛋白的穩(wěn)定性(如囊性纖維化跨膜轉導調節(jié)因子[22])及調節(jié)內質網相關蛋白降解途徑。內質網相關蛋白降解途徑可保證正確折疊的蛋白質輸出，對錯誤折疊的蛋白質進行鑒別、分類和降解，以此清除細胞內無功能的蛋白。Chesi等[23]研究發(fā)現(xiàn)，在過表達H1069Q突變的細胞中，p38和JNK表達明顯升高。被激活的促分裂原活化的蛋白激酶信號通路誘導錯誤折疊的H1069Q蛋白滯留在內質網，并且通過內質網相關蛋白降解途徑加快了突變蛋白的降解速度；同時由于細胞內銅離子的蓄積，活性氧離子水平增加，進一步影響內質網的穩(wěn)態(tài)環(huán)境，形成惡性循環(huán)。上述研究結果提示，p38和JNK抑制劑可以通過對轉錄因子的調節(jié)，糾正H1069Q、D765N、L776V和R778L突變型蛋白的錯誤定位，提高ATP7B蛋白在反式高爾基體網絡的表達及其轉運能力；減少蛋白的降解，促進銅的代謝，降低細胞內銅離子的水平；但對于A874V和L1083F突變沒有明顯糾正作用。

3.5分子伴侶類藥物可糾正突變型ATP7B蛋白的錯誤折疊 α晶狀體蛋白B鏈(α-crystallin B chain,CRYAB)是胞質分子伴侶，屬于小熱激蛋白類，可以與跨膜蛋白結合，抑制多聚體復合物的形成，促進突變型蛋白正確折疊。研究顯示，CRYAB可以與ATP7B-H1069Q在內質網處相互作用，抑制突變蛋白中大段寡聚合物的形成[24]。免疫熒光結果提示，在與CRYAB共轉染下，超過60%的H1069Q蛋白恢復其正常定位。當細胞內銅水平升高時，CRYAB可以促進H1069Q重新分布于高爾基體囊泡，但對于H1069Q蛋白攜銅排出體外的能力無明顯提高。

姜黃素是一種內質網的鈣離子ATP酶抑制劑，對膜定位有糾正作用。4-苯丁酸鈉可以通過幫助突變蛋白正確折疊，利用泛素-蛋白酶體途徑降解錯誤折疊蛋白，減少蛋白質在內質網的沉積，并且通過穩(wěn)定蛋白構象促進突變蛋白的轉運。van den Berghe等[25]報道，在30 ℃環(huán)境下或使用4-苯丁酸鈉和姜黃素干預，G85V、R778L和H1069Q等突變型蛋白的錯誤折疊可被部分糾正，引起膜蛋白表達增加，并隨藥物濃度升高而升高，其異常定位可被糾正。

4 小 結

肝豆狀核變性是一種常染色體隱性遺傳疾病，臨床表現(xiàn)多樣，受基因、年齡、飲食、脂質代謝、種族等多種因素影響，給疾病的診斷和治療增加難度。ATP7B基因突變引起編碼蛋白錯誤折疊，導致ATP7B滯留在內質網、其催化及轉運活性功能減弱或喪失，引起銅離子在肝臟、腦等部位沉積。關于銅介導的組織損傷機制目前仍不完全清晰。過量的銅蓄積在組織內可能會引起一系列氧化應激反應，破壞線粒體的結構和完整性，導致細胞損傷及凋亡。銅誘導的活性氧類水平增加和脂質過氧化均可造成線粒體的損失[26]。同時，銅離子的積聚會引起肝細胞內鋅的重新分布而損傷肝細胞[27]。

目前，肝豆狀核變性的治療包括藥物治療、手術治療、基因和細胞治療、康復治療等。在我國，由于D-青霉胺經濟有效，是治療肝豆狀核變性的經典藥物之一；但是對于有嚴重神經系統(tǒng)癥狀，特別是伴有肌肉僵硬的患者D-青霉胺不宜被使用[28-29]。研究顯示，某些分子伴侶類藥物(如4-苯丁酸)及p38和JNK抑制劑可以糾正突變蛋白的錯誤定位，恢復蛋白的轉運功能；小分子物質DPM-1001能有效降低肝豆狀核變性小鼠模型中肝臟及腦部的銅水平[30]。個體化的細胞和(或)基因治療是目前的研究熱點，其根本目的是恢復ATP7B介導的肝膽管排泄銅的功能[31]，可能是未來最有前景的治療方法。