HopQ與人CEACAM1相互作用的研究進展

馬 凱，王 鴿，孫建兵，汪亞輝，劉宏斌，惠 玲

(1.寧夏醫(yī)科大學研究生院,銀川 750004； 2.解放軍聯(lián)勤保障部隊第940醫(yī)院普外科，蘭州 730050；3.甘肅省干細胞與基因藥物重點實驗室，蘭州 730050)

幽門螺桿菌(Helicobacter pylori，Hp)是可以長期定植在人胃上皮細胞的特異性微需氧、革蘭陰性、螺旋形菌，被世界衛(wèi)生組織明確列為對人類有致癌作用的原核生物，是引起胃炎、消化道潰瘍、胃黏膜相關淋巴樣組織淋巴瘤和胃癌的主要原因之一[1-2]。Hp能產(chǎn)生多種細胞毒素和毒力因子，部分Hp攜帶細胞毒素相關基因致病性島(cytotoxin associated gene pathogenicity island,cag-PAI)。細胞毒素相關蛋白A(cytotoxin associated gene A,CagA)基因是cag-PAI的一部分，由27～31個基因組成，編碼的CagA蛋白作為Hp的重要毒力因子與多種疾病的發(fā)生、發(fā)展有關[3-4]。目前研究表明，Hp的外膜黏附蛋白Hp外膜蛋白(Helicobacter pylori outer membrane protein,Hop)Q在致癌蛋白CagA進入宿主細胞的過程中發(fā)揮著重要作用，而這一過程需要癌胚抗原相關細胞黏附分子1(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 1，CEACAM1)的介導，CEACAM1具有復雜的生物學功能，在腫瘤的進展中起重要作用?，F(xiàn)就HopQ與CEACAM1的特點及通過何種相互作用促進CagA移位到宿主細胞內(nèi)的相關研究進行綜述。

1 HopQ基本特征

1.1HopQ的發(fā)現(xiàn)與等位基因 Hop家族基因組含有約30個同源性Hop基因如BabA(HopS)、SabA(HopP)、 OipA(HopH)、AlpAB(HopB和HopC)等，編碼細菌外膜蛋白。2000年，Alm等[5]發(fā)現(xiàn)，Hp omp27 編碼一種新的Hp外膜蛋白，并將其命名為HopQ。HopQ被認為是參與細胞黏附的蛋白之一，并與細菌毒力有關。隨后，Cao和Cover[6]對比Hp各菌株后發(fā)現(xiàn)，Hp HopQ 存在一對核苷酸序列高度相似的等位基因，HopQⅠ和HopQⅡ。這兩個等位基因存在地區(qū)特異性，從亞洲國家(韓國、日本、泰國)患者胃組織中分離出來的Hp幾乎都是HopQⅠ型[7]；在美國和哥倫比亞，雖然HopQⅠ型也占主導地位，但HopQⅠ基因的表達率明顯低于亞洲國家，HopQⅡ陽性菌株較多[8-9]；在法國和意大利兩者均高表達[10]；而在伊朗地區(qū)，以HopQⅡ為主，且陽性率高于以上地區(qū)[11-12]。不同地區(qū)Hp表達的差異導致不同地區(qū)的人感染后表現(xiàn)出不同的臨床癥狀[13]。

1.2HopQ的生物學特征 Hp HopQ基因組可以頻繁發(fā)生種內(nèi)重組，但HopQⅠ和HopQⅡ這2個等位基因可以保持相對完整性，其在氨基酸組成上有70%的同源性，但這兩個蛋白質(zhì)具有不同的功能[6]。Loh等[14]對比了4株含HopQⅠ的菌株與野生型菌株發(fā)現(xiàn)，HopQⅠ對胃上皮細胞具有黏附作用，這種菌種差異可能與HopQⅠ促進CagA向宿主細胞轉(zhuǎn)運的能力有關。Belogolova等[15]發(fā)現(xiàn)，HopQ是一種非cag-PAI 編碼的Ⅳ型分泌系統(tǒng)(type Ⅳ secretion system,T4SS)輔助因子，HopQ的缺失降低了T4SS依賴的核因子κB活化、促分裂原活化的蛋白激酶信號轉(zhuǎn)導的誘導以及白細胞介素-8在宿主細胞中的分泌，但不影響宿主細胞的運動性和附著細菌的數(shù)量。Busch等[16]研究表明，HopQ與免疫細胞直接接觸不僅破壞了其激活能力，還破壞了遷移能力，進而調(diào)節(jié)宿主免疫，造成免疫逃逸。目前研究表明，HopQ不但參與細胞黏附，還與Hp的毒力有關。攜帶HopQⅠ、CagA+、vacA s1基因的Hp能增加患慢性胃炎、消化性潰瘍以及胃癌的風險[5-6]。還有研究報道，HopQⅠ、CagA、CagE、vacA s1、babA2、opiA的共表達能引起胃黏膜相關淋巴組織淋巴瘤[10]。伊朗地區(qū)的研究表明，HopQⅡ與胃癌顯著相關，而HopQⅠ與病變類型無明顯相關性，但也僅限于此地區(qū)[11]。HopQ毒力的作用目前還不明確，需要進一步研究。

2 CEACAM1基本特征

2.1CEACAM1的結(jié)構(gòu) CEACAM1曾稱為CD66a，是癌胚抗原家族免疫球蛋白超家族的一員，是一種跨膜糖蛋白[17]。CEACAM1基因是其家族中最保守的，位于染色體19q13[18]，由9個外顯子組成，根據(jù)剪接模式的不同可分成11個亞型，其中8個亞型的結(jié)構(gòu)由1個細胞外N端IgV樣結(jié)構(gòu)域、0～3個IgC2樣結(jié)構(gòu)域、1個保守的跨膜區(qū)域、1個胞質(zhì)內(nèi)短鏈區(qū)域(CEACAM1-S)和長鏈區(qū)域(CEACAM1-L)組成。CEACAM1-L的胞質(zhì)區(qū)含有免疫受體酪氨酸抑制基序，被磷酸化后可參與信號轉(zhuǎn)導和蛋白質(zhì)間的相互作用。CEACAM1-S雖缺乏磷酸化位點，但可直接與原肌球蛋白、鈣調(diào)蛋白以及肌動蛋白相連[19]。在細胞中，CEACAM1-L與CEACAM1-S的比例可根據(jù)所受刺激和細胞功能而發(fā)生動態(tài)變化。另外3個亞型僅由胞外結(jié)構(gòu)域組成，不含有胞內(nèi)段和跨膜區(qū)結(jié)構(gòu)域。CEACAM1廣泛表達于上皮細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞、內(nèi)皮細胞以及各種腫瘤細胞中。

2.2CEACAM1的生物學功能 CEACAM1是CEACAMs家族中組織分布最廣泛的一個，具有復雜的生物學作用。CEACAM1存在2種形式：一種是以細胞外分泌的形式存在于體液中；另一種是以跨膜形式存在于細胞上。前者可作為腫瘤標志物對腫瘤進行篩查，后者主要以二聚體的形式通過嗜同種(CEACAM1-CEACAM1)或與CEACAM5發(fā)生嗜異種(CEACAM1-CEACAM5)作用而表達在靶細胞上。CEACAM1的生物學功能主要包括介導細胞間黏附、促進血管和淋巴管生成[20]、調(diào)控免疫[21]、參與腫瘤病理過程。CEACAM1還可以直接或間接參與細胞間信號轉(zhuǎn)導，抑制淋巴細胞激活，在腫瘤細胞的發(fā)生、發(fā)展、復發(fā)以及轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。CEACAM1在不同腫瘤中的表達水平也不同，在一些腫瘤中表達下調(diào)，如肝癌、膀胱癌、結(jié)直腸癌、前列腺癌、乳腺癌；但在甲狀腺癌、胰腺癌、惡性黑色素瘤、非小細胞肺癌中表達上調(diào)。研究表明，CEACAM1在胃癌中高表達，提示其參與胃癌的發(fā)病過程[22]。CEACAM1作為一種新的腫瘤相關基因，在不同腫瘤中表現(xiàn)出抑癌或促癌作用，并且在腫瘤免疫細胞的調(diào)控中也發(fā)揮重要作用，其可能成為研究的新領域。

3 HopQ與CEACAM1的相互作用

3.1HopQ和CEACAM1結(jié)合機制 Hp毒力菌株攜帶1個cag-PAI，編碼1個T4SS，類似于菌毛結(jié)構(gòu)的蛋白復合物，其能夠?qū)⑿鞍證agA注入真核細胞[23-25]。CagA進入細胞后通過磷酸化或非磷酸化的方式調(diào)控胃上皮細胞[26]，主要包括抑制先天防御機制[27]、細胞極性和遷移變化[16,28]以及致癌事件[29-30]。而HopQ與CEACAM1的相互識別在這一過程中發(fā)揮重要作用。近年來，人們用Hp感染整合素敲除的胃上皮細胞發(fā)現(xiàn)，細胞表面的β1整合素異二聚體(α1β1、α2β1或α5β1)和任何其他αβ整合素異二聚體對CagA的易位都不是必需的[31-32]。相比之下，盡管敲除細菌整合素使Hp與胃上皮細胞的結(jié)合能力僅降低到50%，但是Hp中HopQ的缺失或同時敲除細胞中的受體CEACAMs家族蛋白則幾乎不會發(fā)生CagA注射。這說明人胃上皮細胞上的細胞表面整合素與Cag-T4SS 介導的相互作用對CagA易位并不重要，但Hp與CEACAM受體的相互作用促進了Cag-T4SS易位[31]。Feige等[32]敲除整合素α5β1和整合素連接酶后得到相同的結(jié)果。K?niger等[33]和Javaheri等[34]研究發(fā)現(xiàn)，HopQ蛋白是一種真正的Hp黏附素，HopQ作為Hp表面黏附蛋白可特異性作用于CEACAM家族蛋白，并且HopQ-CEACAM1的結(jié)合是依賴于蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)而非聚糖依賴性相互作用。HopQ結(jié)合人CEACAM1蛋白氨基端的IgV樣結(jié)構(gòu)域，從而使主要致病因子CagA易位到宿主細胞，這種結(jié)合具有非常高的親和力。研究HopQ的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，HopQ的外域采用3+4螺旋拓撲結(jié)構(gòu)，其中反向的β發(fā)夾結(jié)構(gòu)(HopQ-ID)對癌胚抗原相關黏附蛋白的結(jié)合非常重要，去除β發(fā)夾導致其與HopQ-CEACAM1的結(jié)合親和力降低約90%[33]。從這個區(qū)域衍生的競爭性肽鏈能抑制HopQ介導的CagA毒力途徑的激活，如基因或抗體介導的沉默HopQ功能所示[34]。這一發(fā)現(xiàn)表明，HopQ-CEACAM1的相互作用是一個潛在的治療Hp相關疾病的新靶點。

進一步研究發(fā)現(xiàn)，CEACAM1通過N端IgV域的相互作用與其自身或其他CEACAMs形成同二聚體或異二聚體[35]。從HopQ-CEACAM1晶體結(jié)構(gòu)來看，HopQ利用CEACAM1的二聚體表面結(jié)合CEACAM1，從而阻止CEACAM1的二聚化，HopQ使用一種耦合的折疊結(jié)合機制結(jié)合識別CEACAM1的二聚界面[35]。它們之間的結(jié)合是蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)結(jié)合，其他形式的結(jié)合效果不是很顯著，但也起到一定的作用，如糖基化，這一點與之前的研究不一致[33]。為了更詳細地了解CEACAM1二聚體和HopQ-CEACAM1復合物界面結(jié)合能的分布[35]，對結(jié)合界面兩側(cè)進行一次全面的丙氨酸誘變掃描分析，結(jié)果未發(fā)現(xiàn)明顯的能量熱點，僅觀察到結(jié)合減少了30%～50%，這表明結(jié)合能量分散在許多殘基上。HopQ-CEACAM1復合物形成后，總共有2 020 ?2的表面積被掩埋，較CEACAM1同二聚體多400 ?2[36]。HopQ外側(cè)域中有四個環(huán)與CEACAM1分子接觸：α3-β1環(huán)(殘基102-111)、β2-α4環(huán)(殘基134-161)、α5-α6環(huán)(殘基240-244)、α7-α8環(huán)(殘基363-385)，其中β2-α4環(huán)占據(jù)了HopQ-CEACAM1復合物接觸表面積的60%左右，β2-α4環(huán)的β發(fā)卡序列通過主鏈氫鍵與CEACAM1殘基95-97連接。CEACAM1與HopQ的β2-α4環(huán)之間形成的氫鍵大部分來自主鏈原子，14個氫鍵中只有6個來自側(cè)鏈原子。β2-α4環(huán)的小α螺旋和環(huán)上其他殘基伴隨著β發(fā)卡通過CEACAM1 N端的IgV形成類似β拉鏈結(jié)構(gòu)的表面，并在兩者之間形成廣泛的范德華力和氫鍵。α7-α8環(huán)的作用方式與β2-α4相同，只是作用范圍及作用力較前者小，其余兩個HopQ環(huán)與CEACAM1形成相互作用是最小的[35,37]。

3.2HopQ亞型和CEACAM1二聚體的順、反式結(jié)構(gòu)對結(jié)合的影響 為探索HopQ亞型與CEACAM1的關系，Moonens等[37]比較了HopQⅠ和HopQⅡ與CEACAM1接觸面的三維結(jié)構(gòu)，結(jié)果在CEACAM1中未觀察到明顯的構(gòu)象變化；而Ⅰ型和Ⅱ型HopQ比較發(fā)現(xiàn)結(jié)合界面區(qū)域發(fā)生了顯著變化，其中包括接觸面殘基數(shù)變化、氨基酸的替換以及氫鍵變化等，這些變化導致HopQⅡ-CEACAM1絡合物與HopQⅠ-CEACAM1絡合物相比總共損失了7個氫鍵，但親和力高出大約6倍。說明HopQⅡ具有更強的黏附能力。

不僅HopQ亞型影響結(jié)合，CEACAM1二聚體的順、反式結(jié)構(gòu)也影響結(jié)合。為驗證CEACAM1制劑的寡聚狀態(tài)，研究者對可溶性的CEACAM1進行了X射線小角散射測量。將實驗散射數(shù)據(jù)與單體、順式或反式二聚體CEACAM1的理論散射曲線進行比較發(fā)現(xiàn)，CEACAM1的N-結(jié)構(gòu)域是以反式二聚體的形式存在的，與晶體HopQ-CEACAM1配合物一致，兩種蛋白質(zhì)的溶液散射曲線顯示它們以1∶1的化學計量配合物存在，說明CEACAM1在溶液中作為反式二聚體存在[38]，并且在HopQ的存在下，CEACAM1二聚體丟失有利于HopQ-CEACAM1復合物的形成[37-38]。以上發(fā)現(xiàn)表明，CEACAM1反式二聚體與單體形式快速平衡，或者HopQ可以在其結(jié)合過程中破壞CEACAM1反式二聚體。之后的細胞實驗得到相同的結(jié)果[37]。綜上表明，HopQ依賴性黏附誘導宿主CEACAM1的二聚體到單體轉(zhuǎn)化。

4 HopQ-CEACAM1復合物對CagA易位的影響

Hp細胞毒素CagA易位到宿主細胞是細菌感染的標志，也是包括胃癌在內(nèi)的嚴重胃病的主要危險因素。慢性感染時，CEACAM1的表達上調(diào)，Hp通過促進受體細胞形成足夠的受體豐度發(fā)揮作用[34]。近年來，一些CEACAMs作為Hp外膜黏附素HopQ的受體，參與CagA宿主細胞的注射過程。Hp結(jié)合誘導CEACAM1介導的信號轉(zhuǎn)導，HopQ-CEACAM1相互作用促進了毒力因子CagA通過Cag-T4SS易位進入宿主細胞，并增強促炎癥介質(zhì)(如白細胞介素-8)的釋放[15,39]。然而，研究表明這可能不是一種信號轉(zhuǎn)導現(xiàn)象，因為具有不同細胞質(zhì)信號轉(zhuǎn)導結(jié)構(gòu)域的幾個CEACAMs允許CagA易位，并且HopQ無已知的信號轉(zhuǎn)導特性，這可能主要是由于HopQ-CEACAMs相互作用的相對高度的親合性造成的[35]。HopQ-CEACAM1相互作用在半納米級范圍內(nèi)為CagA的轉(zhuǎn)運提供了足夠的“停留時間”。雖然目前研究已經(jīng)全面描述了HopQ-CEACAM1相互作用的分子基礎，但這些相互作用觸發(fā)或允許CagA易位的機制目前尚不清楚。HopQ-CEACAM1相互作用有助于Hp的胃定植或誘導病理改變，但這種相互作用在體內(nèi)的確切作用和功能后果仍有待確定。

5 小 結(jié)

Hp特異性地定植于人胃上皮細胞，是引起潰瘍病和胃癌的主要原因，其致病機制非常復雜。HopQ作為Hp的黏附蛋白，也具有一定的毒力作用。CEACAM1作為HopQ的蛋白質(zhì)受體，在Hp感染過程中發(fā)揮重要作用，HopQ可以誘導反式二聚化的CEACAM1解聚，然后以1∶1單體的形式相結(jié)合，HopQⅡ 對CEACAM1的親和力是明顯大于HopQⅠ。它們之間的結(jié)合促進了致癌蛋白CagA向宿主細胞的易位，但易位的具體分子機制目前還不清楚，有待進一步探索。

Hp的黏附和CagA的易位有可能成為疾病治療的靶點，其抑制劑可以在多個水平上作為抗癌劑(即作為抗黏合劑和抗腫瘤蛋白易位劑)。研究發(fā)現(xiàn)，人工合成的CEACAM1抑制劑較野生型細胞表面表達的CEACAM1具有更高的親和力和特異性結(jié)合HopQ[35]。此外，如果將它們與抗微生物劑相結(jié)合，這種高親和力的CEACAM1抑制劑可以起到窄譜抗生素的作用以殺死Hp，同時減輕對腸道微生物群中共生細菌的損害。