牙周炎動(dòng)物模型的研究進(jìn)展

孔 晨，李永麗，李思佳，孫慧穎，任紀(jì)巍，王 雷

(吉林大學(xué)口腔醫(yī)院牙周科， 長(zhǎng)春 130021)

牙周炎是一種常見的牙齒周圍組織即牙齦、牙槽骨、牙周膜和牙骨質(zhì)破壞的慢性感染性疾病，目前普遍認(rèn)為菌斑微生物及其產(chǎn)物在局部的堆積和浸潤(rùn)是牙周炎發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵因子，而機(jī)體對(duì)此的應(yīng)答反應(yīng)則是決定牙周炎發(fā)生與否、發(fā)病速度、病變程度以及范圍的重要因素[1]。研究表明，牙周炎不僅導(dǎo)致牙齦出血、牙槽骨吸收、牙齒松動(dòng)和脫落、牙周袋形成等局部病理變化，也與一些全身性疾病，如糖尿病、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、心血管疾病、不良妊娠等密切相關(guān)[2]。近年來(lái)，隨著醫(yī)學(xué)知識(shí)的普及和人們對(duì)口腔健康重視程度的加深，牙周炎作為一項(xiàng)發(fā)病率極高且影響廣泛的口腔疾病，其防治工作迫在眉睫。建立正確合理的動(dòng)物模型，有利于深入研究影響牙周炎發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵因素，為疾病的控制、藥物研發(fā)提供思路，從而開展積極有效的臨床防治工作?，F(xiàn)就實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的選擇、建模方法與機(jī)制，以及實(shí)驗(yàn)中常見的影響因素予以綜述。

1 動(dòng)物選擇

1.1靈長(zhǎng)類 靈長(zhǎng)類動(dòng)物的口腔結(jié)構(gòu)與人相似，其中猴與人的牙式相同，除尖牙較大，剩余牙齒的形態(tài)均與人牙相近，牙根形態(tài)及分叉情況也與人基本一致，因此建立的牙周炎模型與人相似度最高。靈長(zhǎng)類動(dòng)物具有天然存在的牙菌斑、牙結(jié)石和口腔微生物病原體，牙周炎易感性高，一般在選定臼齒周圍的鄰間區(qū)域的頂端放置牙菌斑積聚裝置如正畸彈性結(jié)扎絲，以促進(jìn)斑塊形成、加速炎癥進(jìn)程[3]。使用恒河猴建立牙周炎模型應(yīng)用的最為廣泛，食蟹猴、獼猴、狒狒也有較多采用，但因?qū)儆谧匀槐Ｗo(hù)動(dòng)物，購(gòu)買途徑少且繁殖較慢，易感染結(jié)核，在大規(guī)模實(shí)驗(yàn)研究中的應(yīng)用受到較大的限制[4]。

1.2犬 犬的牙周組織結(jié)構(gòu)以及牙周炎的病理學(xué)特點(diǎn)均與人相似，牙面常有牙石沉積，齦下菌斑的構(gòu)成也與人類相似，其為研究自然發(fā)生的牙齦炎和牙周炎提供了合適的模型。Beagle犬作為牙周炎動(dòng)物模型的造模動(dòng)物被外國(guó)學(xué)者廣泛采用，1965年Egelberg[5]通過(guò)在Beagle犬牙頸部齦緣結(jié)扎并輔以牙周炎食譜成功建立了實(shí)驗(yàn)性牙周炎模型。一般選擇全身發(fā)育良好，年齡1歲左右，體重12～15 kg的犬建立牙周炎模型。犬的患病率和病變程度隨年齡的增長(zhǎng)而增加，不同品種之間差異明顯，這種在易感性和耐受性方面的差異來(lái)源于感染的性質(zhì)和遺傳因素而非飲食[6]。另一方面，犬的攻擊性強(qiáng)、不易飼養(yǎng)、牙周病變程度和部位不均勻等特點(diǎn)也造成了該模型應(yīng)用的局限性[7]。

1.3大鼠 大鼠每個(gè)象限有1個(gè)門齒和3個(gè)臼齒，一般通過(guò)在臼齒周圍的齦溝中放置結(jié)扎線或接種牙周病原體引起牙周病[8]。牙周炎模型構(gòu)建時(shí)多采用2～4月齡的SD大鼠和Wistar大鼠，后者性情更為溫順。因大鼠繁殖率較高，飼養(yǎng)成本較低，因此有足夠的數(shù)量進(jìn)行研究和統(tǒng)計(jì)分析，又因其生命周期短，適應(yīng)能力及抗病能力強(qiáng)，可快速誘發(fā)疾病，是目前應(yīng)用最廣泛的動(dòng)物，尤其適用于測(cè)試各種藥劑緩解炎癥的功效[9]。但大鼠牙周病發(fā)病率遠(yuǎn)低于人，且牙齒小，對(duì)操作和觀察有一定影響，同時(shí)因大鼠的牙齒能持續(xù)不斷的生長(zhǎng)，只適合短時(shí)程的實(shí)驗(yàn)研究。

1.4兔 兔口腔內(nèi)存在多種病原微生物，菌群分布與致人牙周病的菌群相似，可較準(zhǔn)確地模擬人類口腔疾病狀態(tài)[10]。除在牙齒周圍進(jìn)行可重復(fù)的牙周炎癥研究外，兔的主要優(yōu)點(diǎn)是單獨(dú)結(jié)扎不會(huì)引起軟組織或硬組織破壞。因此，與大鼠和小鼠相比，其可用于測(cè)試人類牙周病病原體的特定影響。結(jié)扎放置通過(guò)將共生菌群轉(zhuǎn)化為口腔致病菌群而誘導(dǎo)牙周病。目前兔較少用于構(gòu)建牙周炎模型，主要用于測(cè)試生物材料或治療種植體周圍炎，兔也是測(cè)試骨愈合及其他非牙齒炎癥如心血管疾病的適用模型[11]。

1.5小型豬 自20世紀(jì)50年代以來(lái)，各種微型豬已廣泛用于生物醫(yī)學(xué)研究、人工器官研究以及作為皮膚傷口愈合模型。由于豬在大體解剖學(xué)和生理學(xué)上與人類相似，一些小型豬可通過(guò)類似的過(guò)程罹患人類疾病如糖尿病，與其他大型物種相比具有經(jīng)濟(jì)優(yōu)勢(shì)，是全身性疾病的優(yōu)秀模型[12]。小型豬與人一樣有乳牙和恒牙，牙齒大小、牙周組織都與人相近。研究表明，6個(gè)月后的小型豬經(jīng)常自發(fā)不同程度的牙齦炎，疾病進(jìn)展模式與人類相同:牙齦腫脹，菌斑積聚，牙結(jié)石形成以及探診出血，并在組織學(xué)上伴有炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)和血管舒張，16個(gè)月時(shí)即可能發(fā)展為嚴(yán)重的牙周炎癥[13]。雖然目前因?yàn)閮r(jià)格、飼養(yǎng)問(wèn)題而應(yīng)用較少，但其有望成為自發(fā)性牙周炎的理想實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ汀?/p>

1.6其他動(dòng)物 小鼠和大鼠同屬于嚙齒動(dòng)物，每個(gè)象限中有3個(gè)臼齒和1個(gè)無(wú)根切牙。由于小鼠牙齒細(xì)小，且每只只能提供微量的牙齦組織，因此實(shí)驗(yàn)時(shí)需要擴(kuò)大樣本量。年輕小鼠如果存在吞噬細(xì)胞遺傳缺陷，其控制原生菌的能力會(huì)受到影響，可能會(huì)發(fā)生由自身微生物群引起的牙周炎，是研究口腔病原微生物對(duì)牙周組織影響及宿主反應(yīng)的優(yōu)勢(shì)模型[14]。倉(cāng)鼠的牙齒也與大鼠類似，牙周炎無(wú)自發(fā)性，頰囊內(nèi)襯有復(fù)層鱗狀上皮，可用于口腔癌的研究[15]。羊具有自發(fā)性牙周炎的臨床特征和血清學(xué)特點(diǎn)，口腔微生物情況與人牙周炎極相似，但因其空間需求大、成本高、難控制，一般較少使用。雪貂會(huì)自然發(fā)生與人類相似的牙結(jié)石和牙周病，是研究牙結(jié)石的適宜模型，但其易從標(biāo)準(zhǔn)籠中脫出，需要特殊管理。

綜上，建立動(dòng)物牙周炎模型時(shí)，大鼠、犬、小型豬以及猴的使用率最高，所選用的動(dòng)物各有優(yōu)缺點(diǎn)，其中大鼠以價(jià)格低廉、操作簡(jiǎn)單、易于飼養(yǎng)、成活率高等優(yōu)點(diǎn)而應(yīng)用的最為廣泛。動(dòng)物模型的構(gòu)建基礎(chǔ)是選擇合適的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，所選動(dòng)物應(yīng)具備形體適宜、飼養(yǎng)方便等基本要求，并能較好地模擬人類牙周病的變化過(guò)程。

2 建模方法

2.1結(jié)扎線法 結(jié)扎線法誘導(dǎo)大鼠牙周骨丟失首次描述于1966年，目前單純利用該法構(gòu)建動(dòng)物牙周炎模型的技術(shù)已相當(dāng)成熟，在各種牙周病的研究中均得到廣泛使用。常用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物是大鼠和小鼠，結(jié)扎材料有尼龍線、細(xì)絲線、橡皮圈、正畸用鋼絲等，一般結(jié)扎在實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的牙頸部或齦溝內(nèi)，主要通過(guò)結(jié)扎部位牙石和菌斑的積累刺激炎癥產(chǎn)生。此外，結(jié)扎時(shí)需要對(duì)牙頸部的牙齦組織進(jìn)行輕度剝離，從而對(duì)牙齦牙周組織造成機(jī)械損傷，進(jìn)一步導(dǎo)致牙周結(jié)締組織破壞和牙槽骨丟失，從而實(shí)現(xiàn)動(dòng)物牙周炎模型的建立。

唐彩金等[16]采用10%的水合氯醛(4 mL/kg)腹腔注射對(duì)SD大鼠進(jìn)行麻醉，然后用尖頭探針將第二磨牙的牙齦分離，用縫線在齦溝內(nèi)結(jié)扎，15 d后進(jìn)行組織學(xué)觀察，確定建模成功。崔迪等[17]用同樣的方法對(duì)9周齡的C57BL/6雄性小鼠的上頜第二磨牙進(jìn)行結(jié)扎，28 d后牙槽骨吸收明顯。近年來(lái)大量研究顯示，采用單純結(jié)扎法通常在1～4周內(nèi)實(shí)驗(yàn)牙即出現(xiàn)明顯的牙齦紅腫、牙周袋形成、探診出血、菌斑堆積和牙槽骨吸收現(xiàn)象，且腭側(cè)結(jié)扎引起的骨丟失較頰側(cè)更為可靠[18-21]。此法不僅適用于大鼠，也基本適用于猴，但其建模周期更長(zhǎng)。Kstopoulos和Karring[22]利用正畸用彈性橡皮圈結(jié)扎猴的上頜第一前磨牙、第一磨牙以及下頜側(cè)切牙的牙頸部，2～3個(gè)月后才有明顯的牙周組織破壞及牙槽骨喪失。目前，結(jié)扎線法因操作簡(jiǎn)單、耗時(shí)較短而被廣泛采用，其中以正畸不銹鋼絲結(jié)扎的效果最好，成功率更高。在建模過(guò)程中要定期檢查結(jié)扎材料是否脫落，或根據(jù)需要進(jìn)行更換。

2.2高糖黏性食料喂飼 調(diào)整動(dòng)物飲食，制定特定的牙周炎食譜也是建立牙周炎模型的一種方法。一方面，黏性軟食在牙齒局部的黏附和嵌塞不利于牙的自潔，可加劇菌斑的附著和累積。另一方面，高糖飲食導(dǎo)致的糖尿病等疾病也對(duì)牙周炎有影響[23]。高血糖通過(guò)削弱牙齦的免疫力，一定程度上降低了牙周組織的抗感染能力，進(jìn)而引發(fā)炎癥。高糖黏性食料喂飼最早由國(guó)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)并驗(yàn)證。采用高糖低蛋白飼料飼養(yǎng)時(shí)，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物會(huì)有牙周袋產(chǎn)生、牙槽骨吸收和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)等病理變化，但單獨(dú)使用此法建模效果一般，且耗時(shí)較長(zhǎng)。國(guó)外學(xué)者給予6周齡的雄性金黃地鼠高糖食譜(100 g食物含蔗糖56 g、全脂奶粉28 g、全麥粉6 g、酵母粉4 g、食鹽2 g、新鮮蔬菜4 g)，12周后才確定模型成功[24]。Zhu和Nikolajczyk[25]與Sarda等[26]探討糖尿病與牙周組織病變的聯(lián)系時(shí)，兩者的相互作用和影響也得到了證明。現(xiàn)階段，高糖黏性食料喂飼常與其他手段聯(lián)合使用，輔助誘導(dǎo)動(dòng)物牙周炎的形成[27]，或用于伴糖尿病牙周炎動(dòng)物模型的研究[28]，以更好地模擬臨床上相應(yīng)患者的發(fā)病機(jī)制。

2.3接種細(xì)菌法 不良微生物及其產(chǎn)物的局部累積被普遍認(rèn)為是牙周炎發(fā)生的始動(dòng)因子，其通過(guò)直接破壞以及引發(fā)的宿主炎癥反應(yīng)導(dǎo)致大部分組織破壞。牙周炎的發(fā)生發(fā)展并非傳統(tǒng)認(rèn)為的是特定少數(shù)細(xì)菌導(dǎo)致的，而是不同細(xì)菌之間協(xié)同作用以增強(qiáng)對(duì)宿主防御的抵抗力、營(yíng)養(yǎng)物攝取能力以及在炎癥環(huán)境中存在的持久力[29-30]。造成口腔微生物-宿主生態(tài)失衡的至關(guān)重要的低豐度細(xì)菌如伴放線聚集桿菌、牙齦卟啉單胞菌、具核梭桿菌等目前被稱為關(guān)鍵病原體，如牙齦卟啉單胞菌可以干擾宿主免疫力，并使異常生物群落出現(xiàn)，其也是目前建立動(dòng)物牙周炎模型使用最為廣泛的菌種。一般為評(píng)估牙齦卟啉單胞菌在牙周組織中的侵襲性、評(píng)估特定牙齦卟啉單胞菌突變體定植以及引起骨丟失的能力多選擇靈長(zhǎng)類動(dòng)物、犬和小鼠模型[31]。

通過(guò)直接注射、局部涂抹或含菌食物嵌塞將致病菌接種至動(dòng)物口腔均能誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物產(chǎn)生牙周炎。研究表明，單一使用伴放線桿菌、牙齦卟啉單胞菌都能建立小鼠牙周炎模型，且多種因素感染較一種因素感染引起的牙槽骨吸收更為嚴(yán)重[32-34]。也有學(xué)者指出，以注射或涂抹的方式接種細(xì)菌與牙周病發(fā)生的始動(dòng)過(guò)程相悖；在食物中接種致病菌，進(jìn)而使致病菌停留在口腔，這一過(guò)程與自然的病菌感染過(guò)程更為相似[35]。研究發(fā)現(xiàn)，革蘭陰性菌細(xì)胞壁外膜中的脂多糖具有強(qiáng)毒性和抗原性，易引發(fā)牙周炎，因此也可直接采用脂多糖誘導(dǎo)動(dòng)物牙周炎產(chǎn)生[36]。甚至有研究認(rèn)為，定位注射細(xì)菌脂多糖可能是一種更直接和受控制建立牙周病模型的方法，因?yàn)樵摷膊∈怯梢阎难乐懿〔≡w誘導(dǎo)的，感染時(shí)間準(zhǔn)確，且對(duì)病原性刺激有更大的可控性[37-38]。

2.4植入牙石法 在一項(xiàng)針對(duì)牙周病患者的長(zhǎng)期調(diào)查中發(fā)現(xiàn)，牙石在引起成人牙周病的因素中排名第2，僅次于菌斑，提示利用牙結(jié)石誘發(fā)牙周炎癥的可能性[39]。牙結(jié)石對(duì)牙周組織持續(xù)刺激，導(dǎo)致炎癥反復(fù)發(fā)作，同時(shí)牙結(jié)石壓迫牙齦，影響血液循環(huán)，造成牙周組織病菌感染，引發(fā)牙齦炎癥及萎縮，形成牙周袋，導(dǎo)致食物殘?jiān)⒕吆脱朗雀锥逊e，從而形成惡性循環(huán)。該方法雖然已在部分實(shí)驗(yàn)動(dòng)物如兔、大鼠中得到了驗(yàn)證，但目前根據(jù)該方法建立牙周炎模型的研究少見，可能與其可控性小、病程與人自然發(fā)病過(guò)程相悖等有關(guān)。

2.5注射激素法 有觀點(diǎn)認(rèn)為，糖皮質(zhì)激素長(zhǎng)期高水平導(dǎo)致的糖皮質(zhì)激素受體過(guò)度激活可能會(huì)改變免疫系統(tǒng)反應(yīng)，提高牙周炎的易感性[40]，但目前尚無(wú)定論。周秀青等[41]對(duì)SD大鼠進(jìn)行醋酸潑尼松龍肌內(nèi)注射，用藥第3日大鼠即出現(xiàn)食欲下降、倦怠少動(dòng)等表現(xiàn)，后牙槽骨逐步呈現(xiàn)骨質(zhì)疏松性改變，驗(yàn)證了肌內(nèi)注射糖皮質(zhì)激素構(gòu)建牙周炎模型的可行性。但也有學(xué)者報(bào)道，單純糖皮質(zhì)激素失調(diào)不會(huì)引起明顯的牙周炎癥，只會(huì)加重牙周炎的程度[42]。目前這種方法尚不成熟、重復(fù)性低，對(duì)牙周炎的影響程度和機(jī)制還亟待進(jìn)一步研究，但可用于探究應(yīng)激時(shí)全身激素水平變化對(duì)牙周炎的影響。

2.6綜合方法構(gòu)建模型 單一方法構(gòu)建模型雖然操作簡(jiǎn)便，但并不能很好地模擬人發(fā)病過(guò)程中諸多因素的相互作用，與真實(shí)情況存在較大差異，實(shí)驗(yàn)周期一般較長(zhǎng)，可控性也相對(duì)差。隨著動(dòng)物牙周炎模型的日趨成熟，越來(lái)越多的學(xué)者青睞于多種方法聯(lián)合應(yīng)用建模，以達(dá)到不同的實(shí)驗(yàn)?zāi)康?。一?xiàng)對(duì)比實(shí)驗(yàn)證明，兩種或兩種以上因素的聯(lián)合刺激有助于縮短實(shí)驗(yàn)周期，提高建模效率[43]。常見的方法有結(jié)扎線法配合高糖喂養(yǎng)、細(xì)菌接種配合高糖喂養(yǎng)、細(xì)菌感染合并結(jié)扎絲線、黏結(jié)牙石加細(xì)菌接種等，通常以一種因素的作用為主，其他因素輔助加重和加快牙周炎癥進(jìn)程[44-46]。在此過(guò)程中，各種因素不僅相互促進(jìn)，而且在一定程度上彌補(bǔ)了彼此的局限性。如細(xì)菌接種雖然作為始動(dòng)因素對(duì)局部組織的刺激作用很強(qiáng)，但忽略了全身因素的影響，結(jié)扎和牙石同樣只適于局部直接研究。激素水平和血糖水平的改變能夠反映臨床上部分患者的發(fā)病過(guò)程，使實(shí)驗(yàn)?zāi)康母鞔_，實(shí)驗(yàn)結(jié)果更有參考價(jià)值。此外也有一些學(xué)者采用特殊方法建立模型，如剝離大鼠下頜第一磨牙牙周與牙根面后，每3天緩慢灌注0.2 mL凝膠至齦下，配合高糖飼料喂養(yǎng)，由于凝膠培養(yǎng)基為厭氧菌提供了適宜的生存環(huán)境，可以促使厭氧菌快速增殖，與僅剝離牙齦和糖飼料喂養(yǎng)的大鼠相比，該組大鼠炎癥發(fā)展更快，且可累及全側(cè)甚至對(duì)側(cè)牙周組織[47]。此方法刺激胃部，可產(chǎn)生胃火型牙周炎，彌補(bǔ)了該型牙周炎的空白，對(duì)中醫(yī)藥的研究有重要意義。

綜上，牙周炎動(dòng)物模型的建立可采用不同方法，若采用某種單一方法進(jìn)行牙周炎動(dòng)物模型的構(gòu)建會(huì)導(dǎo)致病變局限，忽略了全身性因素的影響，而多個(gè)因素同時(shí)運(yùn)用，有利于建立快速、穩(wěn)定的牙周炎模型。然而無(wú)論哪種模型都無(wú)法完全復(fù)制人類牙周炎發(fā)生和發(fā)展的所有方面，如接種細(xì)菌時(shí)使用的只是存在于任何牙菌斑生物膜中的至少150種微生物類型中的一種或兩種；應(yīng)激時(shí)全身激素水平的變化和實(shí)驗(yàn)中局部注射激素對(duì)牙周炎癥的影響也有區(qū)別；在選擇建模方法時(shí)，除考慮可操作性、成功率、建模周期等外，還應(yīng)注意不同實(shí)驗(yàn)?zāi)康膶?duì)實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷男枨?，以及一些常見因素如性別、年齡、麻醉藥品對(duì)實(shí)驗(yàn)的影響等。

3 影響因素

評(píng)估檢測(cè)牙周炎模型時(shí)發(fā)現(xiàn)，雌性小鼠牙齦炎癥介質(zhì)的表達(dá)水平和牙槽骨缺失程度明顯高于雄性小鼠[48]。但在實(shí)際臨床工作中，男性較女性更易患牙周炎，這可能與男性吸煙以及不良口腔衛(wèi)生習(xí)慣致牙結(jié)石增多和牙周組織破壞有關(guān)。有研究表明，尼古丁會(huì)造成牙槽骨吸收、牙周袋形成，同時(shí)抑制牙周組織再生修復(fù)，并呈現(xiàn)劑量依賴性[49]。也有學(xué)者認(rèn)為，男性體內(nèi)的雄激素可以調(diào)節(jié)頜下蛋白酶的活性，促進(jìn)菌斑鈣化和牙石形成，讓男性較女性更易罹患破壞性牙周炎[50]。牙周炎的發(fā)病率隨著年齡的增長(zhǎng)而升高，但目前人們對(duì)牙周炎與年齡的相關(guān)性了解甚少。近年來(lái)也有研究證實(shí)了肥胖與牙周炎的關(guān)系[51]，因此建模時(shí)不能忽略性別、年齡、體重等因素對(duì)疾病的影響。由于建立動(dòng)物牙周炎模型需要反復(fù)麻醉，可能導(dǎo)致多種麻醉不良反應(yīng)，如體重下降、心肺功能抑制、內(nèi)臟病變等[52]，此外，動(dòng)物在應(yīng)激狀態(tài)下體內(nèi)激素的水平也會(huì)發(fā)生變化。

4 結(jié) 語(yǔ)

牙周炎的治療是當(dāng)前國(guó)內(nèi)外學(xué)者研究的熱點(diǎn)問(wèn)題，尋找合理有效的藥物至關(guān)重要，成功建立符合要求的牙周炎動(dòng)物模型是實(shí)驗(yàn)研究的關(guān)鍵。雖然動(dòng)物模型提供了大量重要數(shù)據(jù)，但其研究結(jié)果只能提供某種新型藥物安全性和潛在功效的初步信息，不能直接將這些結(jié)果等同于人類牙周炎的結(jié)果[53]。另外，全身因素導(dǎo)致的個(gè)體差異很難解釋，一些口腔衛(wèi)生習(xí)慣差的群體并未表現(xiàn)出牙周炎癥，而某些口腔菌斑較少的人卻患上嚴(yán)重的牙周炎。真正能夠模擬人類牙周病自然發(fā)病機(jī)制、實(shí)用且重復(fù)性高的模型還亟待進(jìn)一步探索和研發(fā)。