膜聯(lián)蛋白A3在惡性腫瘤中的研究進(jìn)展

王嬌嬌，閆克敏綜述，肖海娟審校

0 引 言

膜聯(lián)蛋白（Annexin）是一類由Ca2+參與調(diào)節(jié)的酸性磷脂和膜結(jié)合蛋白，主要在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)，約占細(xì)胞總蛋白量的1%～2%。Annexin家族共有5類，分別為A、B、C、D和E，脊椎（哺乳）動物的膜聯(lián)蛋白屬于A類。Annexin家族成員的作用涉及多種細(xì)胞功能，包括細(xì)胞增殖、分化與凋亡，膜-細(xì)胞骨架相互作用，內(nèi)吞、胞吐，膜蛋白活性調(diào)節(jié)，炎性反應(yīng)調(diào)控，抗凝血反應(yīng)，以及鈣通道活性和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等［1-2］。近年來研究發(fā)現(xiàn)Annexin家族在惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮多種作用，包括腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡、侵襲轉(zhuǎn)移以及血管生成和化療耐藥的形成，從而成為研究惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的高價值和熱點(diǎn)分子［3］。

膜聯(lián)蛋白A3（Annexin A3），又名脂蛋白3，胎盤抗凝血蛋白3，是Annexin家族中非常重要卻又研究較少的一個蛋白。越來越多的研究證據(jù)表明Annexin A3表達(dá)水平的改變與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展，侵襲和轉(zhuǎn)移以及抗藥性等方面關(guān)系密切，并且對惡性腫瘤的診斷和預(yù)后評估有著重要意義。本文就近期Annexin A3在惡性腫瘤的研究進(jìn)展作一綜述。

1 Annexin A3的結(jié)構(gòu)與功能

Annexin A3基因位于人4號染色體的q13-q22區(qū)域，有323個氨基酸，與其他膜聯(lián)蛋白的氨基酸同一性約為 50%［4］，分為 33 000和 36 000 兩個亞型。Annexin A3幾乎幾乎全部在髓系細(xì)胞系的分化細(xì)胞中表達(dá)，可占人嗜中性粒細(xì)胞總蛋白的1%［5］。Annexin A3的C-末端為保守區(qū)域，通常包含4個結(jié)構(gòu)高度相似的膜聯(lián)蛋白重復(fù)結(jié)構(gòu)域，每個結(jié)構(gòu)域約70個氨基酸，各自與包含5個α螺旋（A-E）的結(jié)構(gòu)域相對應(yīng)，該區(qū)域負(fù)責(zé)結(jié)合鈣離子和磷脂；N-末端則為高度可變區(qū)域，由20個氨基酸殘基組成，可與細(xì)胞質(zhì)蛋白形成復(fù)合物，賦予了其特殊的功能和性質(zhì)。Annexin A3與膜聯(lián)蛋白家族其他成員，特別是Annexin A5，具有很高程度的結(jié)構(gòu)同源性，但其的N端序列比Annexin A5的長。此外，研究發(fā)現(xiàn)Annexin A3含有2個色氨酸殘基：第1個位于N末端片段（W5），第2個位于IIIA-IIIB環(huán)（W190）的末端，這兩個氨基酸殘基均影響Annexin A3的鈣離子依賴度和膜磷脂結(jié)合能力，且二者作用相互關(guān)聯(lián)［6-7］。Park等［8］通過研究發(fā)現(xiàn)Annexin A3蛋白具有多種生物學(xué)功能，如細(xì)胞膜的轉(zhuǎn)運(yùn)、抗磷脂酶A2、細(xì)胞磷脂化、傳導(dǎo)有絲分裂信息、抗凝以及與細(xì)胞骨架蛋白相結(jié)合的功能。另外，多項研究發(fā)現(xiàn)Annexin A3蛋白功能還有介導(dǎo)白細(xì)胞的遷移和炎癥反應(yīng)，參與腦膠質(zhì)細(xì)胞乳酸接到的損傷以及通過激活HIF-1導(dǎo)致VEGF的增加促進(jìn)血管生成［9-10］，并發(fā)現(xiàn)其作用主要發(fā)生在血管形成的初始階段［11］。

2 Annexin A3與消化系統(tǒng)惡性腫瘤

2.1 Annexin A3與胃癌胃癌作為消化系統(tǒng)最高發(fā)的惡性腫瘤，其發(fā)生率位居我國第2位，死亡率居我國第3位［12］。研究發(fā)現(xiàn)，Annexin A3表達(dá)水平的異常與胃癌細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移、侵襲及化療耐藥密切相關(guān)。為了探究Annexin A3在胃癌臨床意義及生物學(xué)作用，Zhai等［13］對80例胃癌患者的Annexin A3表達(dá)水平進(jìn)行了評估，發(fā)現(xiàn)相較于正常的胃組織，Annexin A3在胃癌組織中表達(dá)增加，且與腫瘤體積和TNM分期有關(guān)，與患者預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。探討其機(jī)制，發(fā)現(xiàn)Annexin A3可通過上調(diào)Ki-67和Bcl-2的表達(dá)來調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖和凋亡。張大勇等［14］進(jìn)一步構(gòu)建了人Annexin A3的真核表達(dá)質(zhì)粒pYr-ads-4-Annexin A3，上調(diào)胃癌細(xì)胞中Annexin A3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞的增殖和克隆形成能力顯著增強(qiáng)，凋亡能力明顯減弱。另有研究表明，Annexin A3的高表達(dá)可促進(jìn)胃癌細(xì)胞的遷移和侵襲，而沉默Annexin A3 則抑制了這種作用［15-16］，有趣的是 Annexin A3可通過介導(dǎo)波形蛋白的表達(dá)水平來參與胃癌細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化的過程［16］。此外，Takahashi等［17］研究發(fā)現(xiàn)Annexin A3基因與氟嘧啶抗性相關(guān)，與EGFR的多態(tài)性組合可作為藥物反應(yīng)的預(yù)測因子，為胃癌患者提供最佳的化療方案。

2.2 Annexin A3與肝細(xì)胞癌原發(fā)性肝癌是全球第六大常見癌癥［18］，年齡標(biāo)準(zhǔn)化5年相對生存率僅為 10.1%［19］。 肝 細(xì) 胞 癌（hepatic cell carcinoma，HCC）最理想的治療手段為肝切除和肝移植［20］，但由于其診斷的遲發(fā)性，高復(fù)發(fā)率，高轉(zhuǎn)移率以及對化療的抗藥性，該病的預(yù)后很差。因此，確定適合于早期診斷和新治療靶點(diǎn)的新型分子標(biāo)志物，尋找新的治療方法對于改善HCC患者的預(yù)后非常有必要。Pan等［21］通過q-RT-PCR，蛋白印記法和免疫組織化學(xué)染色法確定Annexin A3在人類HCC基因和蛋白質(zhì)水平上頻繁且顯著過表達(dá)，明顯影響著HCC患者的預(yù)后。從功能研究來看，Annexin A3的過表達(dá)可促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖，遷移和侵襲，也可降低肝癌細(xì)胞對5-氟尿嘧啶和順鉑的敏感性，從而發(fā)揮致癌作用。

諸多證據(jù)表明HCC頻繁復(fù)發(fā)的一個重要原因在于常規(guī)治療后殘存的腫瘤干細(xì)胞（cancer stem cell，CSC）。Pan等［22］研究發(fā)現(xiàn) Annexin A3 優(yōu)先在HCC腫瘤干細(xì)胞/腫瘤起始細(xì)胞（CSC/CIC）群體中表達(dá)，是HCC CSC/CIC相關(guān)抗原，其促進(jìn)HCC進(jìn)展的作用可能是通過HIF1A/Notch途徑對CSCs/CICs的調(diào)控來實(shí)現(xiàn)。此外，用Annexin A3轉(zhuǎn)染的樹突狀細(xì)胞刺激的細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞能夠在體外和體內(nèi)優(yōu)先殺死HCC CSC/CIC。這種新的以T淋巴細(xì)胞為基礎(chǔ)，針對CSCs/CICs的免疫療法的開發(fā)將有效提高HCC患者的治療效果。Tong等［23］研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)源性和分泌性Annexin A3可通過c-Jun氨基末端激酶途徑促進(jìn)CD133+肝CSC驅(qū)動的HCC。隨后其團(tuán)隊開發(fā)的針對Annexin A3的特異性單克隆抗體（抗Annexin A3 mAb）能有效阻斷Annexin A3，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡顯著增加，同時還降低了HCC細(xì)胞遷移、侵襲、誘導(dǎo)血管生成和形成肝球的能力。

2.3 Annexin A3與結(jié)直腸癌結(jié)直腸癌是常見的消化系統(tǒng)道腫瘤之一，在對其潛在生物標(biāo)志物的研究過程中發(fā)現(xiàn)Annexin A3的異常表達(dá)在結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展、不良預(yù)后、侵襲轉(zhuǎn)移和化療耐方面發(fā)揮重要作用。Xie等［24］通過免疫組織化學(xué)的方法檢測60例結(jié)直腸癌組織中Annexin A3的表達(dá)情況及其與臨床病理因素的相關(guān)性，從而分析Annexin A3在人結(jié)直腸癌中的預(yù)后價值。研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)相較于正常胃組織，胃癌組織中Annexin A3高表達(dá)。此外，本研究首次表明Annexin A3與結(jié)直腸癌的進(jìn)展及不良存活呈明顯相關(guān)性，Annexin A3的過表達(dá)與腫瘤大小，Dukes分期及患者的低總體生存率顯著相關(guān)。同時研究發(fā)現(xiàn)Annexin A3與VEGF的調(diào)節(jié)因子HIF-1α的表達(dá)相關(guān)，表明Annexin A3可能通過調(diào)節(jié)HIF-1α參與腫瘤血管生成。

腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是結(jié)直腸癌患者死亡的關(guān)鍵，究其分子機(jī)制，Annexin A3參與其中，抑制Annexin A3的表達(dá)可有效抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲［25］。Yang等［26］開發(fā)了一種創(chuàng)新的免疫蛋白質(zhì)組學(xué)策略，使用癌癥患者自身的血清作為主要抗體來篩選與自體匹配的正常組織和癌組織中差異蛋白的反應(yīng)性，研究結(jié)果確定并驗證了Annexin A3可作為結(jié)直腸癌免疫原性標(biāo)志物。此外，朱利芹［27］構(gòu)建了人結(jié)直腸癌耐藥細(xì)胞株HT-29/L-OHP，檢測發(fā)現(xiàn)HT-29/L-OHP中Annexin A3無論在基因水平還是蛋白水平的表達(dá)均明顯高于親本細(xì)胞株HT-29，此結(jié)果表明Annexin A3的高表達(dá)可能與結(jié)直腸癌奧沙利鉑耐藥性的形成相關(guān)。

2.4 Annexin A3與膽囊癌膽囊癌起病隱匿，早期不易發(fā)現(xiàn)，惡性程度高，早期診斷主要靠影像學(xué)檢查，缺乏有效的分子生物學(xué)指標(biāo)，預(yù)后較差。談燚等［28］通過組織免疫化學(xué)法分別對50例原發(fā)性膽囊癌組織和38例慢性膽囊炎組織中Annexin A3的表達(dá)進(jìn)行了檢測，發(fā)現(xiàn)相較于膽囊良性疾病，Annexin A3在膽囊癌組織中的表達(dá)顯著增高。同時，該研究還發(fā)現(xiàn)Annexin A3具有較高的致癌活性，其高表達(dá)與膽囊癌的低分級、淋巴結(jié)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移以及術(shù)后生存期變短有著密切聯(lián)系。通過miRNA干擾膽囊癌中Annexin A3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)胃癌細(xì)胞增殖明顯受抑，凋亡明顯增加，但對細(xì)胞周期無明顯影響［29］。此外，Wang等［30］研究發(fā)現(xiàn)在膽囊癌高潛能轉(zhuǎn)移細(xì)胞株中Annexin A3呈高表達(dá)。以上研究均表明，Annexin A3在膽囊癌的演進(jìn)過程中發(fā)揮重要作用，調(diào)節(jié)其表達(dá)可調(diào)節(jié)腫瘤細(xì)胞的增殖、凋亡和轉(zhuǎn)移，可能成為膽囊癌治療的一個新的靶點(diǎn)。

2.5 Annexin A3與胰腺癌胰腺癌是常見的消化道惡性腫瘤之一，早期診斷困難，難以及早得到有效治療，故預(yù)后差［31］。Baine等［32］通過全基因組微陣列芯片分析了來自26例胰腺癌患者樣本和與其相對照的33例健康人群的樣本，發(fā)現(xiàn)有383個基因在二者之間有顯著的差異表達(dá)，其中Annexin A3在胰腺癌患者樣本中的表達(dá)水平是健康樣本的1.793倍。qRT-PCR進(jìn)一步驗證了上述結(jié)果，發(fā)現(xiàn)二者的表達(dá)差異為1.71倍。通過對Annexin A3與其他7個相關(guān)基因表達(dá)水平的聯(lián)合分析，發(fā)現(xiàn)辨別胰腺癌患者的準(zhǔn)確率為79%，靈敏度為83%，特異性為75%。由此可看出Annexin A3的表達(dá)水平與胰腺癌的發(fā)生密切相關(guān)，可作為胰腺癌診斷和治療的特異性指標(biāo)。

3 Annexin A3與其他惡性腫瘤

3.1 Annexin A3與肺腺癌人原發(fā)性肺腺癌（lung adenocarcinoma，AdC）是致死率最高的惡性腫瘤，預(yù)后差的主要原因來自于癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移。為了發(fā)現(xiàn)與AdC中淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后相關(guān)的新型潛在分子標(biāo)志物，Liu等［33］選取無淋巴道轉(zhuǎn)移肺腺癌和淋巴道轉(zhuǎn)移肺腺癌的組織作為研究對象，通過熒光差異雙向凝膠電泳和質(zhì)譜的方法確定了Annexin A3為兩種肺AdC中有差異表達(dá)蛋白。蛋白印記法、免疫組織化學(xué)驗證表明，與無淋巴道轉(zhuǎn)移肺腺癌組織相比，Annexin A3表達(dá)水平在淋巴道轉(zhuǎn)移肺腺癌組織中顯著增高。此外，統(tǒng)計學(xué)分析顯示Annexin A3的過表達(dá)與肺腺癌的晚期臨床分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)率以及總生存率均顯著相關(guān)。進(jìn)一步構(gòu)建穩(wěn)定Annexin A3敲除的肺AdC細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)下調(diào)Annexin A3的表達(dá)，腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移明顯受到抑制。探討其分子機(jī)制發(fā)現(xiàn)，下調(diào)Annexin A3可降低MMP-2和N-cadherin的表達(dá)，增加E-cadherin的表達(dá)，同時降低MEK和ERK的磷酸化水平，減少M(fèi)EK/ERK信號通路的活化，從而在抑制肺AdC細(xì)胞遷徙和轉(zhuǎn)移的過程中發(fā)揮作用。在裸鼠體內(nèi)評估Annexin A3敲減對腫瘤細(xì)胞增殖和轉(zhuǎn)移的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)與對照組相比，下調(diào)Annexin A3后腫瘤體積明顯減小，肺、肝、腦轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)量均明顯降低。以上結(jié)果表明，Annexin A3可以作為肺腺癌中淋巴道轉(zhuǎn)移和預(yù)后的新型分子標(biāo)志物，并且在肺AdC的進(jìn)展中起關(guān)鍵性作用［34］。

3.2 Annexin A3與卵巢癌卵巢癌是是女性生殖器官中死亡率居首位的惡性腫瘤，根據(jù)對中國國家中央癌癥登記處人口登記數(shù)據(jù)庫提供的數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，估計2015年卵巢癌心法病例為5.21萬，死亡人數(shù)為2.25萬［35］。目前，外科手術(shù)的基礎(chǔ)上輔助化療仍然為治療卵巢癌的基本方法，順鉑和卡鉑是針對本病最有效的抗癌藥物，但由于腫瘤細(xì)胞對鉑類藥物耐藥性的產(chǎn)生，晚期患者的預(yù)后并不理想。因此，及早發(fā)現(xiàn)耐藥性并快速調(diào)整化療方案對于改善卵巢癌患者治療的結(jié)局至關(guān)重要。Yan等［36］通過蛋白質(zhì)組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)與卵巢癌鉑敏感患者相比具有鉑抗性患者癌組織中Annexin A3的表達(dá)顯著增高，高水平的Annexin A3使卵巢癌細(xì)胞更具鉑抗性，反之，下調(diào)Annexin A3的表達(dá)可增加其鉑敏感性。同時研究發(fā)現(xiàn)Annexin A3上調(diào)可能通過減少細(xì)胞中鉑的積累并負(fù)性調(diào)節(jié)p53基因水平促進(jìn)卵巢癌細(xì)胞的鉑類耐藥。為探索其機(jī)制，Yin等［37］研究表明鉑類耐藥患者血清中Annexin A3水平顯著高于鉑類敏感患者，這與Jin等［38］的研究結(jié)果一致。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Annexin A3可以從卵巢癌細(xì)胞分泌出來，其分泌量與細(xì)胞內(nèi)Annexin A3的表達(dá)和鉑抗性呈正相關(guān)。此外，通過透射電子顯微鏡和免疫電子顯微鏡觀察以及生物化學(xué)分析均表明Annexin A3的分泌可能與胞吐作用和外泌體的釋放有關(guān)。以上結(jié)果均可證明Annexin A3可能是潛在的卵巢癌患者鉑抗性的預(yù)測因子。

3.3 Annexin A3與乳腺癌乳腺癌發(fā)病率逐年增加，其轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)嚴(yán)重影響著患者的生存和生活質(zhì)量，因此，明確乳腺癌轉(zhuǎn)移的機(jī)制對于改善患者預(yù)后尤為重要。Zhou等［39］對309名乳腺癌患者的癌組織進(jìn)行免疫組化檢測，研究發(fā)現(xiàn)與癌旁組織相比，乳腺癌組織中Annexin A3的表達(dá)明顯升高，且在預(yù)后不良的三陰乳腺癌中表達(dá)水平最高，并指出其與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和組織學(xué)分級顯著相關(guān)。進(jìn)一步對Annexin A3在乳腺癌中的作用進(jìn)行研究，通過RNA干擾Annexin A3的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)乳腺細(xì)胞的增殖、侵襲和轉(zhuǎn)移均被抑制，而凋亡顯著增加，其機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)BCL-2/Bax平衡來發(fā)揮作用［40］，此結(jié)果與Zeng等［41］報道一致。此外，有學(xué)者認(rèn)為Annexin A3在乳腺癌化療耐藥方面亦發(fā)揮作用，敲低Annexin A3的表達(dá)可通過增加藥物攝取的方式提高乳腺癌細(xì)胞對阿霉素的敏感性［42］。然而，更為有趣的一點(diǎn)是，另有研究認(rèn)為雖然與健康組相比，乳腺良性病變和浸潤性乳腺癌血清樣品中Annexin A3水平均升高，但乳腺良性病變組無論在血清還是組織水平均高于侵潤性乳腺癌組，而出現(xiàn)這一趨勢的分子機(jī)制尚待研究［43］。以上研究結(jié)果均表明Annexin A3可作為乳腺癌患者的新型和潛在預(yù)后標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。

3.4 Annexin A3與前列腺癌前列腺癌為男性生殖系統(tǒng)高發(fā)腫瘤，早期臨床癥狀不明顯，發(fā)現(xiàn)時多已發(fā)生轉(zhuǎn)移。Annexin A3作為惡性腫瘤潛在的標(biāo)志物，在前列腺癌的基礎(chǔ)和臨床的研究表現(xiàn)突出。郭志文［44］、Kollermann等［45］均對良性、癌前和癌變的前列腺組織進(jìn)行了免疫組織化學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)Annexin A3在3組中均有表達(dá)且表達(dá)水平具有顯著差異，良性組表達(dá)最高，癌前組次之，癌變組表達(dá)最低，說明Annexin A3的表達(dá)可能與Gleason評分呈負(fù)相關(guān)。Wozny等［46］研究發(fā)現(xiàn)Annexin A3在前列腺癌細(xì)胞中主要在細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜表達(dá)，其蛋白可能是通過外泌體的形式分泌至泌尿生殖道?；谶@種分泌機(jī)制，Schostak等［47］證實(shí)尿中Annexin A3為一種高度特異性的新型前列腺癌無創(chuàng)標(biāo)志物，Jeun等［48］進(jìn)一步顯示尿液中的Annexin A3水平與臨床上真實(shí)腫瘤體積顯著相關(guān)，聯(lián)合血清PSA水平可有效提高前列腺癌臨床診斷的精確性，使患者避免不必要的前列腺活檢。

4 結(jié)語與展望

基于上述研究，我們發(fā)現(xiàn)Annexin A3的異常表達(dá)與惡性腫瘤的發(fā)生發(fā)展、轉(zhuǎn)移、侵襲及抗藥性的形成有著密切的聯(lián)系，并且對惡性腫瘤的診斷和預(yù)后有著重要臨床意義?？偨Y(jié)以上研究，發(fā)現(xiàn)Annexin A3的表達(dá)在不同惡性腫瘤的正負(fù)相關(guān)性存在著差異。在包括胃癌、肝細(xì)胞癌、結(jié)直腸癌、膽囊癌、胰腺癌的消化道惡性腫瘤以及肺腺癌、乳腺癌中，Annexin A3的高表達(dá)發(fā)揮促進(jìn)腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的作用，而在前列腺癌中則相反。此外，Annexin A3的高表達(dá)與胃癌、肝癌、結(jié)直腸癌、乳腺及卵巢癌化療抗藥性的發(fā)生明顯相關(guān)，在卵巢癌鉑類耐藥形成方面其作用尤為突出。更重要的是，Annexin A3的異常表達(dá)往往與多種惡性腫瘤的臨床分期及不良預(yù)后相關(guān)，這使其可作為一個潛在的生物學(xué)檢測指標(biāo)和治療靶標(biāo)來為腫瘤患者的診斷及治療提供更多可能。

然而，盡管在Annexin A3與惡性腫瘤關(guān)系的研究中取得了初步成果，但對于Annexin A3在基因及蛋白水平上是如何對惡性腫瘤產(chǎn)生上述影響，其分子生物學(xué)機(jī)制尚不十分明確，故需要更多后續(xù)的實(shí)驗進(jìn)行深入研究，為Annexin A3成為惡性腫瘤的預(yù)測指標(biāo)和治療靶標(biāo)提供更多有力的證據(jù)，以及不斷挖掘其在腫瘤領(lǐng)域的更多可能作用。