中腦多巴胺能神經(jīng)元自身受體DRD2的功能與調(diào)控

楊 璇 王玉波 張 云 賈 丁 張正慧 宋彬彬 于 佳

一、DRD2的結(jié)構(gòu)

多巴胺受體D2(dopamine receptor D2，DRD2)編碼基因位于11號染色體q22～23，編碼415～444(鼠)、414～443(人)個(gè)氨基酸，DRD2基因可編碼產(chǎn)生剪接變異體，即短型(D2S)和長型(D2L)，D2L比D2S在第3胞內(nèi)環(huán)處多29個(gè)氨基酸序列。DRD2屬于G蛋白偶聯(lián)受體，由7個(gè)跨膜區(qū)域組成。DRD2的氨基端位于胞外，包含有4個(gè)N-糖基化位點(diǎn)。羧基端與位于胞內(nèi)，包含有多個(gè)絲氨酸、蘇氨酸殘基位點(diǎn)，可被激酶磷酸化；在DRD2的第3胞內(nèi)環(huán)也存在多個(gè)磷酸化位點(diǎn)，這些位點(diǎn)的磷酸化參與了激動(dòng)劑依賴的受體去敏感化以及第四胞內(nèi)環(huán)的形成[1]。

二、DRD2在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的分布以及亞細(xì)胞分布

DRD2廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)中。DRD2高表達(dá)于紋狀體、伏隔核、嗅球，在大腦皮質(zhì)、基底前腦、邊緣系統(tǒng)、下丘腦、后腦表達(dá)較低[1]。DRD2還表達(dá)于中腦多巴胺能神經(jīng)元中。檢測發(fā)現(xiàn)敲除中腦多巴胺能神經(jīng)元中的DRD2可使大腦中DRD2含量下降20%；而敲除紋狀體神經(jīng)元中DRD2則可使大腦中DRD2含量下降約70%，表明DRD2在中腦的表達(dá)也相對較低[2]。在神經(jīng)元中，DRD2主要分布于胞膜上，但胞質(zhì)內(nèi)也有DRD2，可能主要是位于內(nèi)體[3]。近年來的研究表明，DRD2在多巴胺能神經(jīng)元胞膜中并不是彌散分布的。Robinson等[4]觀察到DRD2基因敲入小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元中胞體胞膜和樹突膜上的DRD2呈點(diǎn)狀聚集分布。此外，Sharma等[3]利用生化實(shí)驗(yàn)證實(shí)在HEK293T細(xì)胞膜上有一部分DRD2存在于某種微結(jié)構(gòu)中，不易于其他膜蛋白發(fā)生相互作用。上述結(jié)果提示，DRD2與其他G蛋白偶聯(lián)受體的分布有所不同，其功能的發(fā)揮可能也具有一定特殊性，這也是未來需要進(jìn)一步研究的問題。

三、多巴胺能神經(jīng)元中存在DRD2自身受體

早在1976年多巴胺自身受體的概念就已經(jīng)被提出，人們發(fā)現(xiàn)多巴胺受體激動(dòng)劑可以抑制多巴胺的釋放；而通過利用多巴胺受體亞型特異性激動(dòng)劑或抑制劑，人們發(fā)現(xiàn)DRD2可能是最主要的多巴胺自身受體。因此，為了明確DRD2的自身受體功能，研究者建立了 DRD2基因敲除小鼠并觀察到與野生型小鼠相比，DRD2基因敲除小鼠表現(xiàn)為水平運(yùn)動(dòng)減少；在可卡因刺激下，野生型小鼠和DRD2基因敲除小鼠的運(yùn)動(dòng)均顯著提高，但可卡因?qū)RD2基因敲除小鼠運(yùn)動(dòng)能力的提高要強(qiáng)于野生型小鼠。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，可卡因或電刺激下，DRD2基因敲除小鼠紋狀體胞外多巴胺含量增加幅度高于野生型小鼠，提示DRD2可以調(diào)節(jié)小鼠腦內(nèi)多巴胺的釋放[5]。

為了進(jìn)一步明確DRD2在小鼠多巴胺能神經(jīng)元突觸前和突觸后的作用，人們建立了選擇性DRD2基因敲除小鼠。Anzalone等[2]研究發(fā)現(xiàn)在可卡因的刺激下，中型多棘神經(jīng)元選擇性DRD2敲除小鼠的運(yùn)動(dòng)功能與野生型小鼠相比明顯下降，而中腦多巴胺能神經(jīng)元選擇性DRD2敲除小鼠運(yùn)動(dòng)功能則顯著升高。DRD2激動(dòng)劑喹吡羅可抑制野生型小鼠紋狀體內(nèi)多巴胺釋放，但在中腦多巴胺能神經(jīng)元選擇性DRD2基因敲除小鼠喹吡羅的這一效應(yīng)明顯降低。但上述DRD2基因敲除小鼠在神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育早期DRD2就已經(jīng)表達(dá)缺失，這可能會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育障礙，從而影響對DRD2功能的研究。因此，Budygin等[6]利用腺相關(guān)病毒包裝的短發(fā)夾RNA敲減成年小鼠黑質(zhì)中的DRD2，結(jié)果發(fā)現(xiàn)該小鼠同樣表現(xiàn)為運(yùn)動(dòng)顯著增強(qiáng)；DRD2拮抗劑氟哌啶醇可以顯著增加對照組小鼠紋狀體內(nèi)多巴胺釋放，但是這種效應(yīng)在DRD2敲減小鼠中被明顯抑制。上述結(jié)果提示，中腦多巴胺能神經(jīng)元中的DRD2作為自身受體抑制多巴胺的釋放和小鼠運(yùn)動(dòng)功能。

四、DRD2自身受體介導(dǎo)的細(xì)胞功能

1.DRD2自身受體調(diào)節(jié)中腦多巴胺釋放：當(dāng)多巴胺能神經(jīng)元在刺激下釋放多巴胺至突觸間隙，可激活軸突上的DRD2自身受體，降低隨后的多巴胺胞吐釋放的概率，這一過程一般僅需幾百毫秒到幾秒[5]。軸突上的DRD2自身受體對多巴胺胞吞釋放的抑制作用具有重要的生理意義，可限制動(dòng)作電位持續(xù)爆發(fā)誘發(fā)的多巴胺過度釋放。

多巴胺的胞吐釋放和胞內(nèi)鈣離子濃度增加密切相關(guān)。研究表明，DRD2激動(dòng)劑喹吡羅可明顯抑制神經(jīng)元的鈣離子電流，DRD2的激活可以有效的抑制P/Q以及N型鈣離子通道，降低突觸前鈣離子濃度，從而抑制突觸前囊泡的釋放[5]。此外，DRD2還可以不通過鈣離子通道，而是鉀離子通道調(diào)節(jié)突觸前囊泡釋放。Fulton等[7]利用免疫熒光染色觀察到電壓門控性鉀離子通道Kv1亞基Kv1.2、1.3和1.6分布于多巴胺能神經(jīng)元軸突，Kv1廣譜抑制劑4-AP可以減輕喹吡羅對多巴胺能神經(jīng)元釋放多巴胺的抑制作用，提示Kv1參與介導(dǎo)了DRD2的自身受體功能。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn) Kv1.2亞基拮抗劑MTX幾乎可以完全拮抗喹吡羅對多巴胺釋放的抑制作用，提示Kv1.2亞基參與了DRD2對多巴胺釋放的抑制。在基礎(chǔ)條件下，Kv1.2基因敲除小鼠紋狀體中多巴胺釋放量明顯高于野生型小鼠，且Kv1.2基因敲除小鼠對喹吡羅不敏感，進(jìn)一步證實(shí)了Kv1.2亞基參與了DRD2自身受體功能[7]。Kv1.2的激活可導(dǎo)致大量鉀離子進(jìn)入多巴胺能神經(jīng)元中，使得神經(jīng)元靜息電位降低，神經(jīng)元發(fā)生超極化，從而抑制多巴胺的釋放。

多巴胺釋放至突觸間隙后，胞外的多巴胺清除主要是通過多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體(dopamine transporter，DAT)，這也是避免胞外過量DA產(chǎn)生持續(xù)性神經(jīng)興奮毒性重要機(jī)制。研究發(fā)現(xiàn)，DRD2自身受體可以調(diào)節(jié)DAT的活性。Budygin等[6]研究發(fā)現(xiàn)利用腺相關(guān)病毒包裝的短發(fā)夾RNA敲減成年小鼠黑質(zhì)中DRD2可導(dǎo)致DAT活性降低。Benoit-Marand等[8]檢測了前腦內(nèi)側(cè)束中多巴胺的半衰期，多巴胺的半衰期可反映DAT對多巴胺的再攝取活性，結(jié)果發(fā)現(xiàn)DRD2拮抗劑氟哌啶醇和依替必利可延長野生型小鼠多次電刺激誘發(fā)釋放的多巴胺的半衰期，但是卻對DRD2基因敲除小鼠無明顯影響。此外，還有研究發(fā)現(xiàn)激活D2S提高了細(xì)胞膜上DAT含量[5]。但值得注意的是，DRD2拮抗劑氟哌啶醇和依替必利并未能改變DAT對單次電刺激誘發(fā)釋放的多巴胺的再攝取，這一結(jié)果表明DRD2介導(dǎo)的DAT活性增強(qiáng)可能只在DRD2被過度持續(xù)激活時(shí)才會(huì)發(fā)生。

DRD2自身受體還可以調(diào)節(jié)多巴胺的合成。多個(gè)研究顯示，DRD2激活可降低多巴胺合成限速酶酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH)Ser40磷酸化水平，DRD2對TH Ser40磷酸化水平的調(diào)節(jié)是通過抑制環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate, cAMP)/蛋白激酶A(protein kinase A, PKA)通路[5]。TH Ser40磷酸化水平和TH的活性呈正相關(guān)。DRD2拮抗劑氟哌啶醇和阿立哌唑增加而DRD2激動(dòng)劑喹吡羅降低小鼠紋狀體內(nèi)的多巴胺合成[5]。多巴胺合成降低可能會(huì)導(dǎo)致突觸前囊泡中多巴胺含量降低，進(jìn)而抑制多巴胺的釋放。

在刺激或靜息狀態(tài)下均有多巴胺在胞體和樹突中釋放。胞體和樹突釋放的多巴胺可激活DRD2自身受體，促使Gβγ和Gα解離釋放入胞質(zhì)，Gβγ可與G蛋白門控內(nèi)向整流鉀離子通道(G protein gated inwardly rectifying K channels，GIRK)胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合從而激活GIRK。在黑質(zhì)和中腦腹側(cè)被蓋區(qū)多巴胺能神經(jīng)元中均有有GIRK表達(dá)。GIRK激活會(huì)導(dǎo)致大量鉀離子內(nèi)流，多巴胺能神經(jīng)元膜電位發(fā)生強(qiáng)烈超極化，多巴胺能神經(jīng)元停止放電，從而抑制多巴胺釋放[9]。

2.DRD2自身受體調(diào)節(jié)多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育和存活:研究發(fā)現(xiàn)胚胎發(fā)育期DRD2基因敲除小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元數(shù)目與野生型小鼠相比明顯降低，而喹吡羅處理可以提高野生型小鼠中腦多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量，促進(jìn)神經(jīng)突起生長，提示多巴胺能神經(jīng)元中DRD2自身受體可能促進(jìn)了多巴胺神經(jīng)元的發(fā)育。

Wiemerslage等[10]研究發(fā)現(xiàn)，DRD2激動(dòng)劑喹吡羅可減輕MPP+所誘導(dǎo)的果蠅多巴胺能神經(jīng)元損傷；而當(dāng)在多巴胺能神經(jīng)元中DRD2被敲減，喹吡羅則不能減輕MPP+誘導(dǎo)的損傷。Bellucci等[11]發(fā)現(xiàn)糖剝奪處理導(dǎo)致SY5Y細(xì)胞中α-突觸核蛋白發(fā)生纖維狀聚集，并伴隨有細(xì)胞死亡，而喹吡羅則可以明顯抑制糖剝奪誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。上述研究提示多巴胺能神經(jīng)元中的DRD2自身受體還可能介導(dǎo)了神經(jīng)保護(hù)作用。

多巴胺能神經(jīng)元中的DRD2自身受體是通過何種機(jī)制促進(jìn)多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育和存活？研究發(fā)現(xiàn)，DRD2可通過激活ERK通路提高核相關(guān)受體因子(nuclear receptor related factor1，Nurr1)的活性，Nurr1在多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育和存活中起到重要作用[12]。因此，中腦多巴胺能神經(jīng)元中的DRD2可能通過激活Nurr1促進(jìn)神經(jīng)元的發(fā)育和存活。此外，Tozzi等[13]發(fā)現(xiàn)喹吡羅可減輕魚藤酮誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激損傷，包括鈣離子積累、線粒體片段化、ATP合成降低；PKA的抑制劑H89也可以抑制上述損傷。據(jù)此可以推測，DRD2可能通過抑制PKA的活性以抑制氧化應(yīng)激損傷，保護(hù)多巴胺能神經(jīng)元。

五、D2L和D2S均可作為自身受體

為了確定D2L和D2S可否在中腦多巴胺能神經(jīng)元中作為自身受體發(fā)揮功能，Radl等[14]同時(shí)建立了D2S基因敲除小鼠和D2L基因敲除小鼠，并觀察到喹吡羅可以有效抑制野生型和D2L基因敲除小鼠的運(yùn)動(dòng)能力，但是對D2S基因敲除小鼠的運(yùn)動(dòng)無明顯影響；氟哌啶醇可以誘導(dǎo)野生型和D2S基因敲除小鼠出現(xiàn)僵直行為，但是卻對D2L基因敲除小鼠無效。根據(jù)以上證據(jù)，研究者認(rèn)為D2L主要分布于多巴胺作用的靶神經(jīng)元，介導(dǎo)突觸后功能；而D2S主要分布于中腦多巴胺能神經(jīng)元，作為自身受體調(diào)節(jié)多巴胺釋放。

但是也有證據(jù)表明，D2L也表達(dá)于多巴胺能神經(jīng)元并發(fā)揮自身受體功能。Jang等[15]利用RT-PCR檢測發(fā)現(xiàn)小鼠黑質(zhì)中同時(shí)有D2L和D2S表達(dá)，且D2L的mRNA水平明顯高于D2L。喹吡羅可以明顯抑制表達(dá)D2L或D2S的中腦神經(jīng)元放電，且這種抑制作用在D2L和D2S陽性神經(jīng)元中無明顯差異。Neve等[16]利用腺相關(guān)病毒在DRD2基因敲除小鼠黑質(zhì)中表達(dá)D2L或D2S，結(jié)果發(fā)現(xiàn)D2L或D2S均可使DRD2基因敲除多巴胺能神經(jīng)元的自身受體功能回復(fù)。因此可以推測，D2L和D2S均表達(dá)于中腦多巴胺能神經(jīng)元中發(fā)揮自身受體功能。

D2L比D2S在第3胞內(nèi)環(huán)處多29個(gè)氨基酸序列，鑒于第3胞內(nèi)環(huán)包含多個(gè)翻譯后修飾位點(diǎn)，因此D2S和D2L可能具有不同的特性。Tabor等[17]利用全內(nèi)角反射熒光顯微鏡在CHO細(xì)胞中觀察到在激動(dòng)劑刺激下，D2S發(fā)生內(nèi)化的程度要明顯高于D2L。Gantz等則發(fā)現(xiàn)胞內(nèi)鈣離子可促使D2S發(fā)生去敏感化，但對D2L卻無明顯影響，即胞內(nèi)鈣離子的增加可導(dǎo)致D2S的自身受體功能被抑制，而D2L卻依然可以發(fā)揮自身受體功能。

此外，第3胞內(nèi)環(huán)對于胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)起著重要作用，因此D2S和D2L介導(dǎo)不同的胞內(nèi)信號通路。DRD2通常和Gαi偶聯(lián)抑制cAMP/PKA信號通路。TH Ser40、多巴胺和cAMP調(diào)節(jié)的磷蛋白(dopamine and adenosine 3′5′-monophosphate-regulated phospho-protein，Mr 32kDa, DARPP-32)Thr34都是PKA磷酸化作用靶點(diǎn)。在D2L基因敲除小鼠中，喹吡羅仍可降低小鼠多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)TH Ser40磷酸化水平，但是DARPP-32 Thr34磷酸化水平無改變，提示D2L介導(dǎo)了DARPP-32 Thr34的磷酸化，而D2S介導(dǎo)了TH Ser40的磷酸化。DRD2的激活還可促進(jìn)AKT和其負(fù)性調(diào)節(jié)蛋白蛋白磷酸酶2A形成復(fù)合體，使其失活。激活D2L可抑制AKT活性，而激活D2S則不會(huì)影響AKT活性[5]。上述D2L和D2S的差異可能對DRD2自身受體功能的發(fā)揮有重要意義，但是目前人們還未能闡明其生理意義以及導(dǎo)致這些差異的機(jī)制。

六、DRD2自身受體功能的調(diào)節(jié)機(jī)制

1.GRK2對DRD2自身受體功能的調(diào)節(jié)：DR的內(nèi)化過程受到G蛋白偶聯(lián)受體激酶(G protein-coupled receptor kinase, GRK)調(diào)節(jié)，當(dāng)DR被激活后，會(huì)被GRK磷酸化，增加DR和Arrestin的結(jié)合能力，促使DR發(fā)生內(nèi)化。Daigle等[18]建立了DRD2陽性神經(jīng)元GRK2特異性基因敲除小鼠，并觀察發(fā)現(xiàn)該小鼠紋狀體中多巴胺釋放量顯著低于野生型小鼠，并且DRD2自身受體活性明顯降低，提示GRK2可以調(diào)節(jié)中腦多巴胺能神經(jīng)元中的DRD2活性。

2.其他膜受體對DRD2自身受體功能的調(diào)節(jié)：大麻素受體(cannabinoid receptor 1，CB1)受體和DRD2共定位與多巴胺能神經(jīng)元的軸突末端、軸突、樹突以及胞體中。CB1受體是一個(gè)7跨膜的G蛋白偶聯(lián)受體，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛表達(dá)，位于突觸前膜的CB1可以調(diào)節(jié)神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。O′Neill等[19]發(fā)現(xiàn)CB1受體激動(dòng)劑WIN55212-2可以降低喹吡羅對多巴胺釋放的抑制作用，提示激活CB1受體可以拮抗DRD2的自身受體功能。在紋狀體神經(jīng)元和HEK293細(xì)胞中，激活CB1受體降低了多巴胺和DRD2的結(jié)合能力，但是這一機(jī)制是否同樣適用于多巴胺能神經(jīng)元中的DRD2自身受體目前仍缺乏證據(jù)，需要進(jìn)行驗(yàn)證。

Escobar等[20]利用免疫熒光染色觀察在伏隔核中到κ阿片受體、DRD2和突觸前標(biāo)志物Syntaxin 1共定位，且κ阿片受體和DRD2雙陽性的突觸小體也表現(xiàn)為TH陽性，表明κ阿片受體和DRD2共定位于多巴胺能神經(jīng)元的突觸前。而κ阿片受體激動(dòng)劑U69593可加速喹吡羅對多巴胺釋放的抑制作用，表明κ阿片受體激活可促進(jìn)DRD2自身受體功能。

此外，還有研究檢測到痕量胺相關(guān)受體1(trace amine-associated receptor 1，TAAR1)的激活可以抑制多巴胺的釋放。TAAR1分布于大腦邊緣系統(tǒng)，如杏仁核、背縫神經(jīng)核、中腦腹側(cè)被蓋區(qū)中。Leo等[21]觀察到TAAR1基因敲除小鼠伏隔核中多巴胺釋放量明顯高于野生型小鼠，而TAAR1激動(dòng)劑RO5166017可導(dǎo)致野生型小鼠伏隔核中多巴胺釋放降低。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，在野生型小鼠中RO5166017可以增強(qiáng)喹吡羅對多巴胺釋放的抑制作用，提示 TAAR1的激活也可以作用于DRD2，提高其自身受體功能[21]。

七、DRD2自身受體異常與神經(jīng)精神疾病

DRD2自身受體表達(dá)異常與成癮相關(guān)。Milella等[22]利用正電子發(fā)射型計(jì)算機(jī)斷層顯像(positron emission computed tomography，PET)檢測發(fā)現(xiàn)在可卡因?yàn)E用者中腦內(nèi)DRD2水平越低，其對可卡因渴求程度越高。Tournier等[23]研究發(fā)現(xiàn)黑質(zhì)和中腦腹側(cè)被蓋區(qū)內(nèi)天生DRD2表達(dá)降低的大鼠可能更易濫用藥物。

DRD2自身受體表達(dá)異常還可能參與了帕金森病的發(fā)生。Dragicevic等[24]檢測發(fā)現(xiàn)在帕金森病患者中黑質(zhì)未變性死亡的多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)DRD2 mRNA水平明顯則增加，目前這一改變在帕金森病發(fā)病中的意義仍不明確。但已有臨床證據(jù)顯示DRD2激動(dòng)劑羅平尼羅可能會(huì)延緩帕金森病病程的進(jìn)展，提示黑質(zhì)中未變性死亡的多巴胺能神經(jīng)元內(nèi)DRD2表達(dá)升高可能一種代償性的保護(hù)機(jī)制。

八、展 望

多巴胺能神經(jīng)元上的DRD2自身受體調(diào)節(jié)多巴胺的釋放，還參與多巴胺能神經(jīng)元的發(fā)育和存活。因此，目前研究者正致力于開發(fā)以DRD2自身受體作為靶點(diǎn)的藥物，用于治療帕金森病或干預(yù)藥物成癮。DRD2的兩種亞型D2L和D2S均可發(fā)揮自身受體功能，但由于D2L和D2S的自身特性和所介導(dǎo)的胞內(nèi)信號通路存在差異，其所介導(dǎo)的功能也可能有所不同，而今后對于這些差異的研究將會(huì)促使人們細(xì)化DRD2自身受體的功能，為進(jìn)一步藥物的開發(fā)提供實(shí)驗(yàn)和理論依據(jù)。此外，DRD2自身受體活性還受多個(gè)其他膜受體的調(diào)節(jié)，也就意味著DRD2自身受體的活性還可能與其他遞質(zhì)系統(tǒng)相關(guān)，揭示大腦中多種遞質(zhì)系統(tǒng)存在交互調(diào)節(jié)機(jī)制。而在未來對這些調(diào)節(jié)機(jī)制的研究將有助于進(jìn)一步闡明神經(jīng)系統(tǒng)中多巴胺受體的生理功能和病理意義，并可為藥物靶點(diǎn)的開發(fā)提供新思路。