先天性巨結腸與RET基因的相關研究進展

王 慧 姜 茜

RET蛋白是由RET原癌基因編碼的一種跨膜蛋白，屬于酪氨酸激酶受體，RET蛋白在腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用。胚胎發(fā)育時期多種因素共同作用導致腸神經(jīng)嵴細胞在腸道中的遷移、增殖和分化發(fā)生異常，致使遠端腸道神經(jīng)節(jié)細胞缺如，導致HSCR的發(fā)生。本文就RET基因的結構、功能及其調(diào)控網(wǎng)絡的異常表達對HSCR的影響等近期研究進展進行綜述。

一、RET原癌基因

1.RET的分子的結構：RET原癌基因位于10號染色體長臂,全長60000,由21個外顯子組成,編碼一種含有1114個氨基酸的酪氨酸激酶受體超家族蛋白[1，2]。RET蛋白包含3個結構域：細胞外配體結合結構域(extracellular regions)、跨膜結構域(transmembrane domain, TMD)以及細胞內(nèi)的酪氨酸激酶(tyrosine kinase, TK) 結構域(圖1)。不同結構域內(nèi)的堿基突變導致的HSCR的機制有所不同(表1)。RET基因的3′-端的可變剪接形成3種轉錄本，分別被命名為RET51、RET43和RET9[3]。其中RET51和RET9為主要形式，在各物種間高度保守。RET51和 RET9 相關的信號復合物并不完全相同，表明不同RET亞型介導的生理功能也不盡相同。

圖1 RET基因的結構示意圖及突變位置

2.RET蛋白的表達和激活:RET原癌基因編碼跨膜酪氨酸激酶受體，在人體大部分組織中均有表達，RET蛋白與相應配體如GDNF(glial cell line-derived neurotrophic factor)等結合，促進受體二聚化，激活下游信號通路，進而刺激細胞增殖、分化和遷移。相關功能研究顯示，RET蛋白的磷酸化及其受體-配體復合物的形成是RET信號通路轉導中的重要步驟。RET蛋白的磷酸化即其活化形式，發(fā)揮生物學功能。人體內(nèi)有4種配體可誘導其活化，分別是GDNF、artemin(ARTN)、persephin(PSPN)和 neurturin (NRTN)，統(tǒng)稱為GDNF配體家族(GDNF family ligands, GFLs)[4]。

二、先天性巨結腸

腸神經(jīng)嵴細胞在胎兒期5～12周時由神經(jīng)嵴細胞(neural crest cell，NCC)移行種植于整個腸道。如NCC在腸道內(nèi)移行、種植過程發(fā)生異常引起遠端腸道缺乏神經(jīng)節(jié)細胞，即可導致先天性巨結腸(Hirschsprung disease, HSCR)。HSCR是最常見的小兒消化道畸形，屬于典型的腸神經(jīng)系統(tǒng)(enteric nervous system, ENS)發(fā)育異常疾病。HSCR在活產(chǎn)嬰兒中的平均發(fā)生率約1/5000，存在明顯種族差異,亞洲人群發(fā)病率最高，為1/3571。中國屬高發(fā)生率國家，男性與女性發(fā)生率之比為(2～4)∶1[5]。

1.先天性巨結腸的分類:按照腸道缺失神經(jīng)節(jié)細胞的長度可將HSCR分為3種類型，即短段型(short-segment hirschsprung disease, S-HSCR)、長段型(long-segment hirschsprung disease, L-HSCR)以及全結腸型巨結腸(total colonic aganglionosis, TCA)，另有罕見的累積全腸型巨結腸[6]。此外，按照有無合并其他畸形以及染色體異常，可將HSCR分為單純型和綜合征型兩種[5]，后者最常見合并21三體畸形,另有18%患兒同時存在其他器官系統(tǒng)先天畸形，如胃腸道畸形、唇腭裂、泌尿生殖道畸形、先天性心臟病以及顱面部畸形等[7]。根據(jù)患者其他家族成員中有無HSCR患者，可分為家族型和散發(fā)型HSCR兩種[8]。

2.先天性巨結腸的相關基因:遺傳學研究表明與HSCR相關的易感基因主要來自ENS發(fā)育過程中兩條主要的信號通路及與其相關的轉錄因子[2]：RET、GDNF、NRTN、PSPN、EDNRB、EDN3、ECE1、NTF3、NTRK3、SOX10、PHOX2B、L1CAM、ZFHX1B、KIAA1279、TCF4、PROK1、PROKR1、PROKR2、GFRA1、NRG1、NRG3、SEMA3A、SEMA3C和SEMA3D[5，6]。但這些基因異常只能解釋部分HSCR患者的發(fā)病原因，且大多為綜合征型或臨床表現(xiàn)較為嚴重的患者。隨著高通量測序和基因分型技術的廣泛應用，全基因組關聯(lián)分析研究(GWAS)被逐漸運用在包括先天性巨結腸在內(nèi)的各種復雜疾病易感基因的發(fā)掘上，越來越多的HSCR潛在易感基因被發(fā)現(xiàn)，如最近Zhao等[9]報道的VAMP5和MCC基因多態(tài)性與中國南方兒童HSCR之間有一定的相關性。此外，基因相互作用也在逐漸進入研究者的視野，如RET基因編碼區(qū)罕見突變與NRG1基因內(nèi)常見變異的共同作用，修飾基因NRG3、MAPK10、ZEB2、SOX2等的調(diào)控作用等[5]。

三、RET基因與先天性巨結腸的關系

目前HSCR患者檢出的已知致病性突變中約有80%來自RET基因，其中含有大量功能失活(loss-of-function, LOF)突變和新發(fā)突變(de novo mutations, DNMs)，且靶向外顯子測序和全外顯子組測序(whole exome sequencing, WES)結果均顯示RET基因的有害性變異在HSCR患者中呈明顯富集現(xiàn)象[4，10，11]。雖有研究提示環(huán)境因素在疾病促發(fā)中也可能發(fā)揮一定作用，如HSCR的發(fā)生與患者母親懷孕期間的BMI值增高及胎兒早產(chǎn)均有一定關系，但遺傳因素在HSCR的發(fā)病中依然占據(jù)重要地位[12]。與HSCR可能相關的致病性基因有24個，但以RET基因為主。利用 CRISPR/Cas9 基因編輯技術在離體細胞模型中修正患者所攜帶的突變后，可明顯恢復腸神經(jīng)嵴細胞的正常功能，進一步說明RET基因突變在HSCR發(fā)病中的重要致病作用[13]。RET基因突變導致RET蛋白表達定位異常、糖基化或磷酸化水平異常，以及一些其他基因或調(diào)節(jié)因素如miRNA或基因的甲基化調(diào)控異常導致RET表達降低時，都將影響RET蛋白在細胞內(nèi)的功能，進一步影響細胞的增殖分化和遷移，從而導致HSCR的發(fā)生[6，14～16]。

1.RET蛋白在腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中的作用：RET蛋白及其信號通路參與調(diào)節(jié)細胞的增殖、遷移和分化。RET基因表達異常將導致ENCCs在腸道內(nèi)異常定植，甚至可促進ENCCs的凋亡引起HSCR的發(fā)生。既往動物模型實驗表明RET蛋白表達降低可導致小鼠結腸內(nèi)的腸神經(jīng)元細胞廣泛死亡,當基因表達量低于30%時即表現(xiàn)出明顯的無神經(jīng)節(jié)細胞缺陷表型，表明HSCR的發(fā)生、發(fā)展與RET基因的表達水平或功能活性存在明顯劑量依賴效應[17]。

2.RET基因編碼區(qū)變異：編碼區(qū)(coding sequences, CDS)突變主要包括同義突變、無義突變、移碼突變和錯義突變等。其中同義突變雖然沒有改變基因編碼的氨基酸，如RET基因的c135G>A(p.A45A)、c2307 T>G(p.L769L) 和c1296 G>A(p.A432A)，但等位基因的分布和HSCR的發(fā)生、發(fā)展及嚴重程度密切相關[18]。無義突變導致RET基因編碼的RET蛋白提前終止，形成的截短蛋白對功能影響較大。HSCR患者中的RET基因突變以錯義突變?yōu)橹?，突變后多?shù)導致RET蛋白在細胞內(nèi)定位發(fā)生改變，或影響RET蛋白的糖基化、磷酸化，進而不同程度地影響RET蛋白活性[14]。不同位置的RET基因突變導致的RET蛋白功能改變不一(表1)。RET基因的 c.341G> A(p.R114H)突變在中國6%～7%的HSCR患兒中被發(fā)現(xiàn)，但在高加索人群中并未發(fā)現(xiàn)這一變異，推測為中國人群的創(chuàng)始者突變(founder mutation)[19]。

表1 不同位置RET突變影響蛋白質功能的主要機制

某些RET基因的LOF突變在HSCR患者發(fā)病過程中屬于必要不充分條件[6]。如單獨的RET基因編碼區(qū)突變可能并不足以導致HSCR發(fā)生，需累積其他微效基因[20]。RET基因編碼區(qū)突變在合并內(nèi)含子變異時，可顯著增加患病風險。2017年開展的一項跨種族全基因組Meta分析結果顯示，RET基因編碼區(qū)錯義突變p.Asp489Asn (rs9282834)與增強子rs2435357的風險等位基因共存時，其患病風險的OR值從1.1增加至16.7[16]。隨著測序技術的成熟，更多的RET基因罕見突變在HSCR患者中被發(fā)現(xiàn)，其中近5年發(fā)現(xiàn)的RET新發(fā)突變詳見表2。

表2 近5年報道的先天性巨結腸患兒的RET基因新發(fā)突變

3.RET基因的甲基化與HSCR:自20世紀90年代以來，CpG島甲基化水平對基因表達的影響已經(jīng)引起人們的廣泛重視。RET基因啟動子區(qū)富含5′-CG-3′序列，其表達受DNA甲基化的高度調(diào)控。研究表明維甲酸可通過調(diào)節(jié)RET基因啟動子區(qū)5′-CG-3′富含區(qū)的DNA甲基化水平來調(diào)控RET基因的表達。另有研究證實RET基因啟動子區(qū)的CpG島甲基化程度可能是指示結腸癌患者預后的一個重要標志，表明RET基因的表達受其啟動子區(qū)CpG島甲基化的調(diào)控，推測這一機制有可能在HSCR疾病發(fā)生中也發(fā)揮一定作用[21]。

4.RET基因與其他基因之間的相互作用:RET蛋白的表達不足或功能異常都將影響ENCCs在腸道內(nèi)的增殖、遷移和分化。很多基因可通過復雜的網(wǎng)絡作用干擾RET信號通路，進而導致HSCR的發(fā)生。如Nrg1可干擾GDNF對神經(jīng)元分化的誘導作用，且GDNF能通過下調(diào)其受體ERBB2基因的表達水平來負向調(diào)控Nrg1信號傳導[22]；另外一些基因則可通過直接調(diào)控降低RET基因的表達導致HSCR的發(fā)生，如先天性中樞性低通氣綜合征(congenital central hypoventilation syndrome , CCHS) 中，PHOX2B基因變體降低了RET基因啟動子的反式激活作用，從而導致RET基因的表達下降致使患者出現(xiàn)HSCR的表型[23]。近期研究表明L1cam作為SOX10的修飾基因可調(diào)控SOX10的表達，后者可直接參與調(diào)控RET基因的表達，因此L1cam也被列為HSCR的候選基因之一[6,22]。

圖2 HSCR發(fā)生模式圖

5.miNRA對RET的調(diào)控作用:MiRNA是小的非編碼RNA，研究表明，miRNA通過與靶基因互補結合觸發(fā)后者mRNA的降解或抑制其翻譯來調(diào)控靶基因的表達。目前研究表明，miR-218-1 可通過調(diào)控RET和PLAG1基因異常表達導致HSCR的發(fā)生。進一步分析顯示，在HSCR患者的狹窄段腸組織中5種miRNA(hsa-miR-142-3p、hsa-miR-142-5p、hsa-miR-146b-5p、hsa-miR-369-3p和hsa-miR-429)表達水平顯著上調(diào)(P<0.05)，而hsa-miR-885-3p則明顯下調(diào)。這些差異表達的miRNA均參與RET信號通路的調(diào)控[15]。此外，lncRNA在HSCR發(fā)生中的作用也被逐漸發(fā)現(xiàn)，但其具體機制有待于進一步研究。

6.基因調(diào)控網(wǎng)絡(gene regulatory network, GRN)異常與HSCR：基因表達調(diào)控是生物個體發(fā)育的重要基礎，因此基因在生物個體發(fā)育過程中的作用應該作為GRN的一部分來看待，而不是孤立地研究基因的功能。2016年經(jīng)體外實驗、胎鼠實驗及人類胎兒腸道樣本表達的研究表明，RET基因的3個順式調(diào)控原件(cis-regulatory elements，CREs)中的風險等位基因組合可協(xié)同降低RET基因的表達，同時調(diào)節(jié)RET基因相應轉錄因子的表達致使RET基因的GRN失常[6]。該研究還發(fā)現(xiàn)，分別與RET-7、RET-5.5、RET+3相結合的轉錄因子RARB、GATA2、SOX10在胎鼠體內(nèi)的表達具有時空特性，且每一種轉錄因子的作用時間各不相同。RARB表達水平降低時引起的RET基因表達降低程度不如SOX10和GATA2明顯，提示RARB可能還有其他可替代的未知轉錄因子在體內(nèi)發(fā)生作用。該項研究還表明，SOX10基因表達量的輕微下降就可導致RET基因表達明顯減少，表明SOX10在RET基因中的轉錄調(diào)節(jié)作用最強。在人類胎兒腸道樣本的檢測中還發(fā)現(xiàn)，不同的CRE組合雖然造成一定程度的RET基因及其轉錄因子SOX10和GATA2的降低，但在RET信號轉導通路中GDNF和GFRA1組分的表達卻明顯增加，表明胚胎發(fā)育期人類腸道中可能還有其他轉錄因子或增強子在RET基因的GRN中發(fā)揮作用。

7.RET基因的嵌合體變異：近年來研究表明，越來越多的遺傳性疾病的發(fā)生、發(fā)展與嵌合體變異密切相關。2014年Jesus 和Haase分別在兩個先天性巨結腸家系中的非巨結腸患者中檢測出嵌合體突變。同年，Moore和Zaahl等通過對56個石蠟包埋腸組織標本RET基因兩個snp的基因型分析認為，RET基因的體細胞突變可能存在于無神經(jīng)節(jié)細胞的腸組織中。2017年本課題組的最新研究顯示，在9例HSCR患兒中檢出RET基因突變，其中對8例患者父母有DNA樣本的家庭做了進一步Sanger測序檢測，在其中2個家庭患者父母外周血樣本中檢出與先證者相同位點的較小的突變峰，表明這兩個家庭的親本屬于嵌合體變異[11]。進一步深度測序發(fā)現(xiàn)另外6個家系中兩個患兒體內(nèi)多組織RET突變等位基因頻率各不相同且顯著偏離50%。由此可見，這兩個患兒的突變不是發(fā)生在受精卵結合前，而應是由胚胎發(fā)育早期合子形成后的變異造成的；另有兩個家庭的親本DNA中發(fā)現(xiàn)了極低水平的突變等位基因(頻率為1%～4%)。因此既往HSCR患者中RET基因嵌合體變異的頻率和程度存在被嚴重低估的可能。對于新發(fā)突變(尤其是嚴重突變)攜帶者所在家庭，應采用具有足夠敏感度的深度測序來驗證其父母或患者自身是否存在嵌合體變異，從而為疾病再發(fā)風險評估以及患者后代臨床表型的嚴重程度預測提供更加可信的依據(jù)。

綜上所述，HSCR是典型的多個基因共同參與的復雜人類遺傳病，同時與環(huán)境因素如孕母的肥胖、胎兒早產(chǎn)等也有一定關系[12]。RET基因在腸神經(jīng)嵴細胞的發(fā)育過程中占據(jù)重要作用，當 RET蛋白在細胞內(nèi)的定位發(fā)生改變，或其糖基化、磷酸化水平出現(xiàn)異常時，將導致RET功能失常并進一步影響ENCCs在腸道內(nèi)的定植，最終引起相關表型。MiRNA、RET基因內(nèi)含子、增強子區(qū)域及SOX10、RARB、GATA2、PHOX2B等轉錄調(diào)控基因因子也可調(diào)節(jié)RET的表達，這些元件功能出現(xiàn)異常時也可引起HSCR臨床表型。隨著基因檢測技術和相關功能研究手段的發(fā)展，越來越多的罕見突變在HSCR患者中被鑒定，使人們對HSCR的發(fā)病機制有了更深入的了解，這對HSCR的臨床治療、遺傳咨詢以及腸神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育的研究都將具有重大意義。