NLRP3炎癥小體與腹膜透析患者腹膜纖維化的研究進(jìn)展

胡清華，羅綺媚，鐘少鑫，竇獻(xiàn)蕊

(南方醫(yī)科大學(xué)順德醫(yī)院腎內(nèi)科，廣東 佛山 528300)

腹膜透析是以自身腹膜作為半透膜進(jìn)行溶質(zhì)和水跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)的一種透析方式，具有可居家治療、更好保護(hù)殘余腎功能、對(duì)血流動(dòng)力學(xué)影響小等優(yōu)點(diǎn)，已逐漸成為終末期腎衰竭患者的首選治療方法之一。腹膜結(jié)構(gòu)和功能變化是影響腹膜透析治療的關(guān)鍵因素，長(zhǎng)期行腹膜透析治療患者的腹膜普遍存在纖維化，腹膜纖維化引起的超濾衰竭是影響腹膜透析患者技術(shù)生存的重要因素[1]。目前，腹膜纖維化的發(fā)病機(jī)制尚未完全闡明。研究表明，腹膜炎與腹膜纖維化密切相關(guān)，腹膜透析相關(guān)性腹膜炎癥包括微炎癥狀態(tài)和由感染引起的急性和慢性腹膜炎，兩者結(jié)合是腹膜纖維化的主要原因，最終導(dǎo)致超濾衰竭[2]。Nod樣受體蛋白3(Nod-like receptor protein 3，NLRP3)炎癥小體是近年來(lái)研究最多的復(fù)合體，可引起強(qiáng)效促炎因子白細(xì)胞介素(interleukin，IL)1β、IL-18的成熟和釋放?，F(xiàn)對(duì)NLRP3炎癥小體參與腹膜透析相關(guān)性腹膜炎癥和腹膜纖維化的機(jī)制予以綜述。

1 NLRP3炎癥小體及其激活模式

1.1NLRP3炎癥小體的結(jié)構(gòu)和功能 固有免疫系統(tǒng)可通過特定的模式識(shí)別受體識(shí)別入侵的微生物以及體內(nèi)的危險(xiǎn)信號(hào)，最終排除異己成分、保護(hù)宿主，炎癥小體是固有免疫的重要效應(yīng)因子。模式識(shí)別受體包括膜結(jié)合的Toll樣受體和胞質(zhì)內(nèi)的Nod樣受體。NLRP3是Nod樣受體家族中研究最多的一種，可被多種刺激信號(hào)激活，并募集凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白及胱天蛋白酶1組成多蛋白復(fù)合體——NLRP3炎癥小體[3-4]。NLRP3蛋白由位于染色體1q44上NLRP3基因編碼，包含1 016個(gè)氨基酸，分子結(jié)構(gòu)包括C端、中央和N端3部分，C端是識(shí)別配體的亮氨酸富集結(jié)構(gòu)域；中央為實(shí)現(xiàn)NLRP3寡聚化和活化的NOD結(jié)構(gòu)域；N端為介導(dǎo)下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的熱結(jié)構(gòu)域[3]。凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白作為一種銜接蛋白，其C端為結(jié)合NLRP3的下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的熱結(jié)構(gòu)域，N端為結(jié)合胱天蛋白酶1的CARD結(jié)構(gòu)域。胱天蛋白酶1是前胱天蛋白酶1的活化形式，通過激活蛋白裂解使IL-1β、IL-18等細(xì)胞因子前體成熟，并發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)。當(dāng)內(nèi)源危險(xiǎn)信號(hào)刺激或外源病原毒素侵襲激活NLRP3時(shí)，與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白結(jié)合，并進(jìn)一步募集前胱天蛋白酶1，誘導(dǎo)前胱天蛋白酶1進(jìn)行自我剪切生成活化的胱天蛋白酶1，通過對(duì)相應(yīng)炎性因子的剪切激活，最終引發(fā)炎癥反應(yīng)[5]。

1.2NLRP3炎癥小體的活化過程 目前對(duì)NLRP3炎癥小體激活的具體機(jī)制尚不清楚，但已知的激活模式主要有：①半通道模式，胞外的腺苷三磷酸能夠與細(xì)胞膜上P2X7嘌呤受體結(jié)合開通離子通道，大量K+外流，同時(shí)促進(jìn)半通道蛋白Pannexin-1通道形成，使細(xì)胞外NLRP3配體進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)，直接促進(jìn)NLRP3炎癥小體的聚集和活化。②溶酶體破壞模式，一些晶體物質(zhì)(如石英、二氧化硅、單鈉尿酸鹽等)被吞噬細(xì)胞吞噬后，將溶酶體破壞，使溶酶體中一系列蛋白酶釋放到胞質(zhì)中，直接激活NLRP3炎癥小體。③活性氧類(reactive oxygen species，ROS)模式，細(xì)胞接受刺激時(shí)，氧化酶組裝活化，線粒體合成ROS，產(chǎn)生的ROS可以作為信號(hào)激活NLRP3炎癥小體。④其他模式，細(xì)胞外葡萄糖、細(xì)菌RNA、線粒體DNA等均可激活NLRP3炎癥小體[6-7]。

2 NLRP3炎癥小體與腹膜透析相關(guān)腹膜纖維化

2.1NLRP3炎癥小體與細(xì)菌感染所致腹膜炎 細(xì)菌感染所致腹膜炎是腹膜透析的常見并發(fā)癥，其反復(fù)發(fā)生會(huì)嚴(yán)重影響腹膜超濾功能和透析效能，最終使患者退出腹膜透析。腹膜透析患者發(fā)生急性細(xì)菌性腹膜炎可激活NLRP3炎癥小體，促進(jìn)其下游多種促炎介質(zhì)(如IL-1β、IL-18等)的合成和分泌，與腹膜結(jié)構(gòu)和功能密切相關(guān)。Hautem等[8]在發(fā)生急性細(xì)菌性腹膜炎的腹膜透析患者和用脂多糖誘導(dǎo)的腹膜炎大鼠模型腹膜組織研究中發(fā)現(xiàn)，NLRP3和IL-1β的信使RNA表達(dá)均明顯增加，同時(shí)腹水中IL-1β表達(dá)亦明顯升高，且NLRP3和IL-1β激活程度與透析液中中性粒細(xì)胞增加的比例呈正相關(guān)。若敲除NLRP3基因，IL-β表達(dá)受到抑制，同時(shí)，在急性腹膜炎時(shí)發(fā)生的溶質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)障礙又得到恢復(fù)，可見，腹膜透析患者發(fā)生急性細(xì)菌性腹膜炎時(shí)可激活NLRP3炎癥小體，并促進(jìn)下游多種促炎介質(zhì)(如IL-1β、IL-18 等)的合成和分泌。一項(xiàng)納入210例感染性腹膜炎腹膜透析患者的研究顯示，腹水中炎性因子IL-1β、IL-6和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β均明顯升高[9]。IL-1β是NLRP3炎癥小體下游重要的促炎因子，過度和(或)持續(xù)激活可造成廣泛組織損傷。將腺病毒轉(zhuǎn)載IL-1β至尿毒癥大鼠腹膜組織可引起炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，隨即發(fā)生嚴(yán)重的急性腹膜炎，即使腹膜炎癥狀緩解，促炎因子仍釋放達(dá)數(shù)周，并可潛在影響腹膜形態(tài)和功能[10]。有研究發(fā)現(xiàn)，腹膜透析患者中IL-1β的基因多態(tài)性與腹膜炎相關(guān)，C等位基因攜帶者與腹膜炎的風(fēng)險(xiǎn)增加有關(guān)[11]。同時(shí)，IL-1β有望作為鑒別各種類型腹膜炎的生物標(biāo)志物，有助于選擇適當(dāng)?shù)目股刂委焄12]。

2.2NLRP3炎癥小體與慢性非細(xì)菌性腹膜炎 殘余腎功能下降、尿毒癥毒素、透析所致暴露增加、高糖和低pH溶液反復(fù)刺激等原因可引起腹膜透析患者腹膜慢性非細(xì)菌性炎癥反應(yīng)，促使腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化亦是腹膜纖維化的重要環(huán)節(jié)之一[13]。長(zhǎng)期行腹膜透析患者非細(xì)菌性炎癥發(fā)生率高，且與腹膜纖維化的發(fā)展速度呈正相關(guān)[14-15]。有研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體可介導(dǎo)高濃度葡萄糖透析液誘導(dǎo)的腹膜慢性非細(xì)菌炎癥反應(yīng)，高糖刺激腹膜間皮細(xì)胞后，IL-1β和IL-18表達(dá)明顯升高，且呈時(shí)間和劑量依賴性，用干擾小RNA下調(diào)腹膜間皮細(xì)胞NLRP3的表達(dá)時(shí)，由高糖刺激產(chǎn)生的IL-1β明顯減少。IL-1β和IL-18是重要的促炎因子，可導(dǎo)致下游IL-6、IL-8和腫瘤壞死因子α等炎性因子的表達(dá)增加，這些炎性因子相互作用形成復(fù)雜的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)共同參與炎癥反應(yīng)，最終導(dǎo)致腹膜結(jié)構(gòu)和功能變化[16-17]。Chin等[18]發(fā)現(xiàn)，慢性腎臟病狀態(tài)下機(jī)體代謝廢物(如尿毒癥毒素)可活化NLRP3炎癥小體。晚期腎衰竭患者和透析患者(包括血液透析和腹膜透析)血清中促炎細(xì)胞因子IL-1β、腫瘤壞死因子α和IL-6表達(dá)均明顯升高，且與腎小球?yàn)V過率呈負(fù)相關(guān)[19]。由此推測(cè)，當(dāng)腹膜長(zhǎng)期直接暴露于異常代謝環(huán)境，細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)發(fā)生改變，繼而可產(chǎn)生多種危險(xiǎn)信號(hào)分子(如ROS、腺苷三磷酸等)。危險(xiǎn)信號(hào)分子被細(xì)胞內(nèi)模式識(shí)別受體識(shí)別后可激活NLRP3炎癥小體，通過效應(yīng)分子胱天蛋白酶1、IL-1β和IL-18等作用于腹膜間皮細(xì)胞，使其發(fā)生細(xì)胞凋亡或上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial to mesenchymal transition，EMT)，從而導(dǎo)致腹膜纖維化。

2.3NLRP3炎癥小體與腹膜纖維化 腹膜結(jié)構(gòu)和功能的改變是影響腹膜透析治療的關(guān)鍵因素，長(zhǎng)期腹膜透析患者的腹膜組織中可觀察到間皮下層的厚度逐漸增加，并伴隨腹膜纖維化形成，這些慢性改變?cè)诨颊甙l(fā)生嚴(yán)重或反復(fù)發(fā)生腹膜炎時(shí)更加明顯[20]。一項(xiàng)對(duì)212例腹膜透析患者進(jìn)行的腹膜組織檢查發(fā)現(xiàn)，正常人不存在腹膜纖維化，腹膜透析患者活檢組織中腹膜纖維化的發(fā)生率高達(dá)56%[21]。反復(fù)發(fā)生的急慢性腹膜炎是導(dǎo)致腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生EMT的主要原因，而EMT是腹膜透析相關(guān)腹膜纖維化的重要機(jī)制，最終導(dǎo)致超濾衰竭使患者透析終止[22]。

體外研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β可呈劑量依賴性地誘導(dǎo)腎小管及腫瘤細(xì)胞等發(fā)生EMT，并參與腫瘤細(xì)胞的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移[23-24]。高糖腹膜透析液可活化腹膜間皮細(xì)胞的NLRP3，呈時(shí)間和劑量依賴性，并誘導(dǎo)腹膜間皮細(xì)胞發(fā)生EMT，將NLRP3干擾小RNA轉(zhuǎn)染至間皮細(xì)胞，沉默NLRP3的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，可部分抑制含糖腹膜透析液誘導(dǎo)的腹膜EMT[25]。IL-1β刺激間皮細(xì)胞時(shí)，纖維化指標(biāo)纖維連接蛋白表達(dá)增加，并發(fā)生可逆性的EMT，轉(zhuǎn)分化的間皮細(xì)胞中上皮鈣黏素的分泌減少，伴細(xì)胞外基質(zhì)、波形蛋白和平滑肌肌動(dòng)蛋白成分等增加[26]。綜上所述，NLRP3炎癥小體活化可介導(dǎo)高糖腹膜透析液誘導(dǎo)的腹膜間皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化。

用腺病毒轉(zhuǎn)載IL-1β至尿毒癥大鼠腹膜組織后可引起急性腹膜炎癥，腹膜組織中轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β和纖維連接蛋白的信使RNA表達(dá)明顯增加，膠原沉積，并出現(xiàn)間皮下纖維組織變厚、腹膜纖維化，進(jìn)而導(dǎo)致腹膜超濾功能下降，但腹膜炎癥狀在1周左右可緩解，由于纖維連接蛋白信使RNA的表達(dá)在21 d后仍有持續(xù)升高趨勢(shì)，故腹膜纖維化可持續(xù)至21 d甚至更長(zhǎng)時(shí)間[10]。大鼠實(shí)驗(yàn)中用丙戊酸作用轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β/Smad通路抑制腹膜纖維的同時(shí)，炎性因子IL-1β的表達(dá)明顯降低[27]。綜上所述，NLRP3/IL-1β參與并調(diào)控腹膜透析相關(guān)腹膜炎以及腹膜纖維化的發(fā)生、發(fā)展過程，具體作用機(jī)制尚不明確，但臨床上當(dāng)患者經(jīng)歷一次或數(shù)次腹膜炎后，腹膜纖維化的程度會(huì)明顯增加，而IL-1β可能起重要作用。干預(yù)NLRP3炎癥小體的活化可能對(duì)延緩腹膜纖維化有重要意義。

3 NLRP3炎癥小體與線粒體損傷

NLRP3炎癥小體是溝通腹膜透析相關(guān)腹膜炎癥和腹膜纖維化的橋梁，但其具體調(diào)節(jié)機(jī)制尚不明確。研究發(fā)現(xiàn)，NLRP3炎癥小體活化與線粒體的損傷、代謝和自噬密切相關(guān)[28-29]。線粒體是真核細(xì)胞內(nèi)的能量轉(zhuǎn)換細(xì)胞器，除提供細(xì)胞生命活動(dòng)所需能量外，還參與調(diào)控細(xì)胞內(nèi)環(huán)境鈣離子濃度的穩(wěn)定、凋亡、細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和衰老等功能[30]。目前，越來(lái)越多的研究證明，NLRP3炎癥小體參與腹膜透析相關(guān)腹膜纖維化的過程可能受到線粒體的調(diào)控[31-33]。闡明NLRP3炎癥小體和線粒體的關(guān)系可為延緩腹膜纖維化提供新思路。

3.1NLRP3炎癥小體和ROS 線粒體發(fā)生功能障礙時(shí)，ROS的產(chǎn)生超過機(jī)體清除能力，過量ROS激活相關(guān)信號(hào)通路引起細(xì)胞損傷。近年來(lái)，線粒體來(lái)源的ROS被認(rèn)為是NLRP3炎癥小體的調(diào)控中心[34]。研究表明，線粒體靶向抗氧化劑阻斷ROS的產(chǎn)生可抑制腎小管上皮細(xì)胞NLRP3炎癥小體的激活以及細(xì)胞損傷[35]。高糖培養(yǎng)腹膜間皮細(xì)胞時(shí)，ROS產(chǎn)生增加，與時(shí)間和劑量呈正相關(guān)，而過量的ROS使NLRP3炎癥小體激活，導(dǎo)致IL-1β的分泌[36]。ROS是瞬態(tài)分子，只在短距離內(nèi)充當(dāng)信號(hào)信使，因此被定位在靠近線粒體的有效NLRP3才能對(duì)該細(xì)胞器產(chǎn)生的ROS進(jìn)行有效的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。在慢性腎臟病血液透析患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的線粒體中發(fā)現(xiàn)，NLRP3與凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白、線粒體共區(qū)域化，而正常人群外周血單核細(xì)胞中，NLRP3殘留在細(xì)胞質(zhì)顆粒結(jié)構(gòu)中[37]。進(jìn)一步證實(shí)了線粒體來(lái)源的ROS可激活NLRP3炎癥小體。有研究用高糖以及線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ抑制劑魚藤酮、線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅱ抑制劑TTFA、線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅲ抑制劑抗霉素A分別處理人腹膜間皮細(xì)胞誘導(dǎo)線粒體功能障礙發(fā)現(xiàn)，高糖、魚藤酮和劑抗霉素A可使線粒體ROS產(chǎn)生增加，IL-1β表達(dá)上調(diào)，而TTFA對(duì)ROS和IL-1β表達(dá)無(wú)明顯影響，表明應(yīng)用高糖腹膜透析液或線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ和線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅲ抑制劑會(huì)導(dǎo)致ROS升高和IL-1β高表達(dá)[37]。NLRP3炎癥小體是調(diào)控IL-1β表達(dá)的關(guān)鍵分子，應(yīng)用微RNA技術(shù)下調(diào)NLRP3的表達(dá)后，由高糖透析液和線粒體呼吸鏈抑制劑作用于腹膜間皮細(xì)胞產(chǎn)生的IL-1β表達(dá)均明顯減弱，表明高糖腹膜透液可損傷腹膜間皮細(xì)胞線粒體功能，產(chǎn)生更多的ROS并激活NLRP3炎癥小體，其機(jī)制可能與線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅰ和線粒體呼吸鏈酶復(fù)合體Ⅲ活性增強(qiáng)有關(guān)，并在腎小球系膜細(xì)胞中也得到了類似的結(jié)果[37-38]。

3.2NLRP3炎癥小體活化與線粒體DNA 線粒體DNA是線粒體內(nèi)的遺傳物質(zhì)，線粒體功能障礙時(shí)，從線粒體釋放至胞質(zhì)，成為損傷相關(guān)分子模式[38]。有研究發(fā)現(xiàn)，巨噬細(xì)胞線粒體功能障礙時(shí)釋放至胞質(zhì)的線粒體DNA可直接結(jié)合并活化NLRP3炎癥小體，介導(dǎo)下游炎性因子IL-1β等的合成和分泌，參與炎癥反應(yīng)和組織損傷[29,39]。將腹膜間皮細(xì)胞暴露在高糖透析液中，可觀察到線粒體膜電位的消散，并伴隨細(xì)胞色素C、ROS和線粒體DNA的產(chǎn)生以及釋放的明顯增加[40]。有研究表明，循環(huán)線粒體DNA水平與慢性腎臟病患者全身炎癥狀態(tài)顯著相關(guān)，并發(fā)現(xiàn)慢性腎臟病患者尿液中線粒體DNA濃度明顯升高，與腎小球?yàn)V過率呈負(fù)相關(guān)，有可能作為半段是否需要透析治療的指標(biāo)之一[41]。一項(xiàng)納入197例腹透患者的研究發(fā)現(xiàn)，循環(huán)線粒體DNA水平明顯升高，與血清C反應(yīng)蛋白水平呈正相關(guān)[42]。綜上所述，線粒體DNA可能參與腹膜透析患者的炎癥反應(yīng)，但是否通過調(diào)控NLRP3炎癥小體仍不明確，需要體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)的進(jìn)一步探究。

3.3NLRP3炎癥小體活化與自噬 線粒體是一種易損傷的細(xì)胞器，及時(shí)清除細(xì)胞內(nèi)受損線粒體對(duì)維持細(xì)胞正常生理狀態(tài)具有重要作用。細(xì)胞內(nèi)功能受損的線粒體主要通過自噬進(jìn)行清除[43]。有研究報(bào)道，敲除自噬基因ATG16L1或ATG7的巨噬細(xì)胞中，IL-1β表達(dá)量增多，而IL-1β的成熟與釋放依賴于NLRP3炎癥小體活化，表明自噬可能調(diào)節(jié)NLRP3炎癥小體的活性[44]。在體外培養(yǎng)的腹膜間皮細(xì)胞中加入自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤干擾自噬形成的關(guān)鍵蛋白(Beclin1干擾小RNA、ATG5干擾小RNA)作為自噬阻斷劑后發(fā)現(xiàn)，受損線粒體增多，線粒體釋放的ROS增多，IL-1β表達(dá)量亦明顯增強(qiáng)，而用白藜蘆醇誘導(dǎo)細(xì)胞自噬后，NLRP3炎癥小體激活上調(diào)IL-1β表達(dá)的效應(yīng)卻明顯減弱[34]?？梢姡种谱允蛇^程可使功能障礙的線粒體在胞內(nèi)堆積并產(chǎn)生大量ROS激活NLRP3炎癥小體，而適度自噬可維持線粒體功能，并可抑制NLRP3炎癥小體的激活。此外，NLRP3炎癥小體激活后亦可抑制自噬，影響線粒體的自我清除，對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化等疾病的發(fā)展起促進(jìn)作用[45]。由此推測(cè)，行腹膜透析時(shí)，腹膜間皮細(xì)胞受到炎癥、高糖、低pH腹膜透析液刺激，細(xì)胞線粒體損傷，ROS和線粒體DNA等產(chǎn)生明顯增加，激活NLRP3炎癥小體及其下游炎性因子參與腹膜透析相關(guān)腹膜炎癥及腹膜纖維化，而線粒體自噬又可抑制以上過程的持續(xù)激活。

4 小 結(jié)

腹膜透析受到各種感染及非生物相容性腹膜透析液等的反復(fù)刺激，可導(dǎo)致NLRP3炎癥小體的激活，并通過活化的半胱氨酸蛋白酶1持續(xù)地將前IL-1β和前IL-18剪切為成熟的IL-1β和IL-18，進(jìn)而激活其下游信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路產(chǎn)生大量炎性介質(zhì)，引起機(jī)體炎癥反應(yīng)和腹膜纖維化。NLRP3炎癥小體在腹膜透析相關(guān)腹膜炎癥和腹膜纖維化的重要性受到越來(lái)越多的關(guān)注。目前，以NLRP3炎癥小體為靶點(diǎn)的藥物也正在做有益的嘗試，但具體調(diào)控機(jī)制仍不明確。腹膜透析時(shí)，線粒體損傷在NLRP3炎癥小體的激活過程中起重要作用，線粒體損傷有關(guān)的ROS、線粒體DNA以及自噬均與各組織器官的纖維化密切相關(guān)，其在腹膜纖維化的重要性也日益受到關(guān)注?？梢姡帽Ｗo(hù)線粒體功能的方法抑制NLRP3炎癥小體激活可能為探索延緩腹膜纖維化提供新思路。