錯(cuò)配修復(fù)缺陷與結(jié)直腸癌關(guān)系的研究進(jìn)展

孫 田，柳青峰，肖明明，臧 輝，梁 靜

(1.中國醫(yī)科大學(xué)研究生院，沈陽 110122； 2.遼寧省人民醫(yī)院普外科，沈陽 110016；3.遼寧省人民醫(yī)院病理科，沈陽 110016)

結(jié)直腸癌(colorectal cancer，CRC)是世界上第三大常見的惡性腫瘤[1]和第二大癌癥死亡原因[2]，也是排名前十的影響全球公共衛(wèi)生健康的疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)[3]，目前CRC的全球總病例數(shù)約為180.5萬，其發(fā)病率和死亡率在世界范圍內(nèi)差異較大。在許多中-高人類發(fā)展指數(shù)的國家(亞洲、南美洲等)，CRC的發(fā)病率和死亡率呈升高趨勢，相比之下，在最高人類發(fā)展指數(shù)國家卻保持穩(wěn)定或下降趨勢，這種差異與早期篩查和醫(yī)療改善的相關(guān)性較大。Austin等[4]發(fā)現(xiàn)高年齡組(50歲或以上)CRC的發(fā)病率下降，但年輕組(50歲以下)上升，差異可能與遺傳風(fēng)險(xiǎn)因素富集有關(guān)[5]。據(jù)我國2015年流行病學(xué)的統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示[6]，CRC的發(fā)病率和死亡率均排名所有惡性腫瘤的第五位，男、女性的發(fā)病率和死亡率也位居前列，CRC新發(fā)總例數(shù)為37.63萬，死亡總例數(shù)為19.10萬，城市的發(fā)病率高于農(nóng)村。伴隨著人口基數(shù)大、地域形式多樣和文化信仰不同等問題，我國癌癥防治措施有待進(jìn)一步加強(qiáng)。

CRC是一種復(fù)雜的異質(zhì)性疾病，多種因素影響病情的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)歸。CRC可因遺傳和非遺傳因素的影響而發(fā)病，因遺傳因素而引起的CRC可分為家族性腺瘤性息肉病、遺傳性非息肉性CRC等類型，由非遺傳性因素即僅影響單個(gè)細(xì)胞及其后代引起的CRC稱為散發(fā)性CRC[7]。調(diào)查顯示，高達(dá)35%的CRC與遺傳因素相關(guān)[5]，且年齡是主要的危險(xiǎn)因素[8]。人體內(nèi)存在多種機(jī)制維持遺傳物質(zhì)的穩(wěn)定，其中一種稱為DNA錯(cuò)配修復(fù)(mismatch repair，MMR)，MMR過程需要多種蛋白質(zhì)的參與，它們可以在DNA復(fù)制后修復(fù)錯(cuò)誤位點(diǎn)，維持DNA的高度保真性，進(jìn)而減少基因突變。MMR缺陷(deficient mismatch repair，dMMR)與多種惡性腫瘤存在明顯的相關(guān)性,如CRC、子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌等，并且MMR在CRC的診斷和治療過程中也發(fā)揮重要作用[9-12]。隨著病理分子學(xué)和基因?qū)W等技術(shù)的發(fā)展，CRC的診斷和治療水平有了很大提高，使醫(yī)師有了更準(zhǔn)確的診治方式，也使患者獲得了更好的治療效果，MMR在CRC中有廣闊的應(yīng)用前景?，F(xiàn)就dMMR與CRC的相關(guān)研究進(jìn)展進(jìn)行綜述。

1 dMMR概述

1.1發(fā)生發(fā)展及產(chǎn)生機(jī)制 MMR是一種高度保守的細(xì)胞過程[12]，其中涉及多種蛋白質(zhì)，并在DNA復(fù)制過程中起重要作用。DNA的MMR基因最早在原核生物中被發(fā)現(xiàn)，作用于細(xì)胞內(nèi)，負(fù)責(zé)在DNA復(fù)制后對堿基進(jìn)行MMR，另外也可以修復(fù)一些小的核苷酸插入或缺失，而后其相關(guān)基因也在人類細(xì)胞和酵母菌中被發(fā)現(xiàn)[13]。MMR的關(guān)鍵基因包括MutL同源物1(Mult homolog 1，MLH1)、MutS同源物2(Mult homolog 2，MSH2)、MSH6和減數(shù)分裂后分離增加2(postmeiotic segregation increased 2，PMS2)等。已有研究證實(shí)，MMR基因在雙鏈斷裂修復(fù)，細(xì)胞凋亡和重組中發(fā)揮作用[14]。MMR基因表達(dá)產(chǎn)物稱為MMR蛋白，在DNA復(fù)制、遺傳物質(zhì)重組和化學(xué)或物理損傷過程中以異二聚體復(fù)合物的形式存在，進(jìn)行錯(cuò)配堿基的鑒定及其后續(xù)修復(fù)[15]。這些復(fù)合物包括MutSα(MSH2蛋白與MSH6蛋白組合)、MutLβ(MLH1蛋白與PMS1蛋白組合)、MutSβ(MSH2蛋白與MSH3蛋白組合)和MutLα(MLH1蛋白與PMS2蛋白組合)。在DNA復(fù)制發(fā)生錯(cuò)配后，首先MutSα識別并結(jié)合DNA鏈，招募MutLα，經(jīng)構(gòu)象改變后，從錯(cuò)誤位點(diǎn)釋放，隨后招募核酸外切酶-1切除錯(cuò)配區(qū)域，復(fù)制因子A穩(wěn)定單鏈DNA，由DNA聚合酶Polδ和增殖細(xì)胞核抗原形成的復(fù)合物填補(bǔ)空缺，最后由DNA連接酶修復(fù)缺口[1-2,14]。有研究證實(shí)[12]，MMR使DNA復(fù)制的準(zhǔn)確性提高了100～1 000倍。若MMR基因或蛋白功能缺陷，DNA復(fù)制錯(cuò)誤得不到修正，錯(cuò)誤的逐漸積累加劇基因的變異，進(jìn)而產(chǎn)生dMMR表型?？傊?，dMMR可以通過3種主要機(jī)制[16]發(fā)生：①體細(xì)胞MMR基因的高度甲基化，最常見的是MLH1缺陷；②以Lynch綜合征為代表的MMR基因的遺傳種系突變；③MMR基因中存在的雙體細(xì)胞突變，并且dMMR腫瘤也會表現(xiàn)一定的組織病理學(xué)特征[7]，包括增加的腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞，克羅恩樣腫瘤周圍淋巴細(xì)胞反應(yīng)，黏液/印戒細(xì)胞分化和髓質(zhì)分化等。dMMR使DNA復(fù)制錯(cuò)誤積累，增加染色體重排和基因變異，是CRC發(fā)生、發(fā)展的一種重要機(jī)制。

1.2免疫組織化學(xué)檢測 免疫組織化學(xué)檢測常用于評估MMR蛋白(包括MLH1，MSH2，MSH6和PMS2蛋白)的表達(dá)情況。根據(jù)MMR蛋白的表達(dá)情況可將其分為兩種類型[17]：若一種或多種MMR蛋白表達(dá)缺失稱為dMMR，無缺失稱為正常的MMR(proficient mismatch repair，pMMR)。免疫組織化學(xué)檢測具有技術(shù)簡便、操作易行、成本低，且敏感性和特異性與基因檢測相仿等優(yōu)點(diǎn)，如Lu和Sheng[18]研究發(fā)現(xiàn)，免疫組織化學(xué)檢測對MLH1和MSH2突變的靈敏度為79%～95%，但其不能檢測出種系突變，查明突變的具體位置，這就需要聚合酶鏈反應(yīng)等相關(guān)檢測進(jìn)行確認(rèn)。對其檢測的結(jié)果來說，實(shí)際情況有所不同，因?yàn)镸MR蛋白具有異二聚體的性質(zhì)，蛋白質(zhì)的表達(dá)喪失又有可能是其配對蛋白質(zhì)表達(dá)喪失的結(jié)果。如單獨(dú)PMS2或MSH6蛋白丟失可表明其存在缺陷，但當(dāng)MLH1和PMS2蛋白均表達(dá)喪失時(shí)，可能僅僅是因?yàn)镸LH1的喪失使PMS2不穩(wěn)定而導(dǎo)致的。MSH6和MSH2同樣如此。另外，免疫組織化學(xué)檢測的染色結(jié)果也會有異常的情況出現(xiàn)，如染色不完整，或呈灶狀，但未完全缺失，染色位于細(xì)胞質(zhì)而非細(xì)胞核等，這可能與核定位序列的缺失、實(shí)際使用固定劑的差異或組織固定均勻性的不同等因素相關(guān)[14]。因此，實(shí)際工作中檢測結(jié)果的評估有待進(jìn)一步探究?？傊?，免疫組織化學(xué)檢測優(yōu)勢明顯，符合現(xiàn)狀，可用于評估MMR狀態(tài)，篩選試驗(yàn)或臨床分析試驗(yàn)，在臨床上已廣泛應(yīng)用。

2 dMMR CRC的臨床特征及預(yù)后

dMMR是人類發(fā)現(xiàn)的一種重要的CRC致病機(jī)制，并為研究CRC的發(fā)生、發(fā)展提供了重要的線索和依據(jù)。約15%的CRC與dMMR相關(guān)[17,19]。MMR狀態(tài)不同的CRC在年齡、TN分期和性別等特征上有所不同。如高度微衛(wèi)星不穩(wěn)定(microsatellite instability-high,MSI-H)的dMMR CRC患者顯示出一定的臨床特征[17,20]，包括多見于女性，近端腫瘤位置，分化差的黏液表型等，并且dMMR是Ⅱ期和Ⅲ期CRC患者預(yù)后良好的標(biāo)志物，這些特征與pMMR患者存在明顯的差異性，在腫瘤微環(huán)境上也是如此，應(yīng)用dMMR腫瘤微環(huán)境的相關(guān)特性可為患者的預(yù)后提供參考依據(jù)。dMMR CRC與非轉(zhuǎn)移性患者較高的中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)、中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比率和C反應(yīng)蛋白水平相關(guān)，但中性粒細(xì)胞/淋巴細(xì)胞比率僅在pMMR CRC中具有預(yù)后價(jià)值[21]。此外，因?yàn)閐MMR CRC遺傳物質(zhì)穩(wěn)定性低，可使部分腫瘤基因失活，若失活位點(diǎn)為轉(zhuǎn)移所必需，那么會在一定程度上改善患者的預(yù)后。Yan等[17]臨床研究表明，在近端結(jié)腸癌和直腸癌中，pMMR患者更傾向于晚期并且淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，原因可能是dMMR導(dǎo)致重組人轉(zhuǎn)化生長因子-β受體2基因突變失活，使腫瘤細(xì)胞不易發(fā)生上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化過程，而該過程是轉(zhuǎn)移中的關(guān)鍵事件[21-22]。但有研究得到相反的結(jié)論，Goldstein等[23]證實(shí)，BRAF V600E突變是MSI-H dMMR轉(zhuǎn)移性CRC的不良預(yù)后因素，常見于Ⅳ期CRC患者(41%)，雖然這部分患者存在MSI-H，但生存期不能明顯延長，相反，pMMR是延長無進(jìn)展生存期和總生存期的獨(dú)立因素[17]。因此，對于轉(zhuǎn)移性和非轉(zhuǎn)移性患者相關(guān)結(jié)論不能等同替換，需要更多的樣本及數(shù)據(jù)進(jìn)行研究。

目前，腸道微生物組與MMR CRC之間已建立一定的聯(lián)系，并且在CRC的診斷、預(yù)防和治療中表現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。Hale等[24]將腫瘤生物學(xué)和微生物生態(tài)學(xué)結(jié)合在一起研究CRC后發(fā)現(xiàn)，相比于pMMR CRC，脆弱擬桿菌和硫化原球菌梭狀核在dMMR CRC中顯著富集，并證實(shí)dMMR和pMMR CRC微生物群落的影響網(wǎng)絡(luò)之間的差異僅與腫瘤或正常相鄰的微生物群有關(guān)，再次強(qiáng)調(diào)了將MMR狀態(tài)加入CRC微生物組研究的重要性[25-26]，這些發(fā)現(xiàn)為今后CRC的研究及診療提供了新思路和新手段。

2.1dMMR與Lynch綜合征、Lynch樣綜合征 約3%的CRC患者由MMR基因(MLH1，PMS2，MSH2和MSH6中一種或多種)發(fā)生種系突變造成，被稱為Lynch綜合征相關(guān)CRC,又可稱為遺傳性非息肉性CRC。Lynch綜合征是最常見的遺傳性CRC易感綜合征[5]，屬于常染色體顯性遺傳病，具有較高的外顯率，Lynch綜合征患者發(fā)生CRC的風(fēng)險(xiǎn)高于一般人群，其終生累積發(fā)病率高達(dá)80%[27]，并且也增加了患其他類型癌癥的風(fēng)險(xiǎn)，如子宮內(nèi)膜癌、卵巢癌和胃癌等。Lynch綜合征的存在依據(jù)是微衛(wèi)星不穩(wěn)定的存在和(或)通過免疫組織化學(xué)確定缺乏MMR蛋白的表達(dá)，以及在DNA MMR基因中存在有害的種系突變。MLH1或MSH2的突變占所有Lynch綜合征相關(guān)癌癥的60%～80%，其他病例可歸因于MSH6或PMS2突變[28]。PMS2突變與Lynch綜合征的特殊表型[9]相關(guān)，即患者的發(fā)病年齡較大，常無相關(guān)家族病史，腸鏡見結(jié)腸息肉較多等。Ligtenberg等[19]研究發(fā)現(xiàn)一種特殊類型，即上皮細(xì)胞黏附分子基因(緊鄰MSH2的上游)刪除其終止密碼子導(dǎo)致甲基化，而誘導(dǎo)的MSH2基因沉默，形成Lynch綜合征，其比例小于5%[5]，而Richman[14]證明，上皮細(xì)胞黏附分子種系突變的存在與其表達(dá)缺失之間存在高度特異性，并建議在MSH2陰性腫瘤患者中加入相關(guān)檢測?？傊?，這些差異凸顯了MMR不同基因之間的可變外顯率以及基因癌癥風(fēng)險(xiǎn)評估的重要性。目前，Lynch綜合征相關(guān)CRC的診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)的是阿姆斯特丹Ⅱ標(biāo)準(zhǔn)和修訂的Bethesda標(biāo)準(zhǔn)[22]。早期篩查CRC患者是否因Lynch綜合征引起已為醫(yī)療人員所認(rèn)可，而Lynch綜合征的通用腫瘤篩查也是在CRC上進(jìn)行的，用以早期確定原因不明的MLH1甲基化和種系突變的dMMR患者[10]，但對于Lynch綜合征的攜帶者，因沒有特征性的臨床表型，尤其是沒有癌癥家族史的患者，目前沒有較好的篩查方法[29]。因此，對于Lynch綜合征患者家屬更需要遺傳物質(zhì)鑒定和篩查，以達(dá)到早期預(yù)防和治療的目的。

特別需要說明的是，有關(guān)臨床研究也發(fā)現(xiàn)，沒有MMR基因(包括MLH1，PMS2，MSH2和MSH6)種系突變的dMMR約占Lynch綜合征總數(shù)的70%[8]，并應(yīng)用Lynch樣綜合征來提及不明原因的腫瘤dMMR現(xiàn)象[10]。在發(fā)病機(jī)制上，多數(shù)Lynch樣綜合征患者出現(xiàn)MMR基因的雙等位基因失活[30]，其突變率相對較低，并且可以在一定程度上解釋，與Lynch綜合征患者相比，Lynch樣綜合征患者的一級親屬患CRC和其他癌癥的風(fēng)險(xiǎn)較低[31]。在臨床病理特征上，Lynch綜合征和Lynch樣綜合征的CRC患者的平均發(fā)病年齡接近(48.5歲比53.7歲),重要的區(qū)別特征在于CRC較低的標(biāo)準(zhǔn)化發(fā)病率(6.04%比2.12%)[32]，臨床研究發(fā)現(xiàn)前者更容易發(fā)生于左半結(jié)腸和直腸，后者更易發(fā)生于右半結(jié)腸[10]。目前對于Lynch樣綜合征和Lynch綜合征患者，未解答的關(guān)鍵問題是遺傳特性的風(fēng)險(xiǎn)評估和管理的不確定性，在無癌個(gè)體中識別相關(guān)患者以及如何利用其獨(dú)特的免疫生物學(xué)特性進(jìn)一步治療是今后的研究中面臨巨大的挑戰(zhàn)。

2.2dMMR與散發(fā)性CRC 大多數(shù)dMMR CRC由MLH1基因啟動子區(qū)的異常甲基化引起[11]，即引起散發(fā)性CRC。在免疫組織化學(xué)證實(shí)MLH1缺失的患者中，約75%為散發(fā)性，且散發(fā)性MSI-H CRC占所有CRC的3%～15%[20]。反過來，MLH1啟動子的高甲基化在散發(fā)性CRC的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，這種機(jī)制造成了MLH1基因蛋白的表觀遺傳損失，與體細(xì)胞的BRAF基因的密碼子600(V600E)突變有關(guān)[27]，也有學(xué)者將其稱為高CpG島甲基化表型，并可導(dǎo)致抑癌基因失活。CpG島甲基化表型的腫瘤也具有一定的臨床特征[25]，如通常位于近端結(jié)腸，具有BRAF基因突變，并且由無柄鋸齒狀腺瘤引起。但在一小部分MSI-H CRC中也觀察到MLH1甲基化和CpG島甲基化表型狀態(tài)之間的不一致性[20]，這些差異表現(xiàn)出散發(fā)性CRC發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性，且臨床病理特征的研究結(jié)果也不同,散發(fā)性CRC的致病機(jī)制復(fù)雜，表型多樣，其與dMMR的相關(guān)研究有望為dMMR CRC的診斷和治療提供更有意義的依據(jù)。

3 dMMR 與CRC的治療

3.1化療 對于CRC目前主張多學(xué)科的綜合治療，其中基于氟尿嘧啶的輔助化療已被證實(shí)能夠減少復(fù)發(fā)及延長生存期，特別是Ⅲ期患者[33]。目前更多的研究認(rèn)為，與低度微衛(wèi)星不穩(wěn)定和微衛(wèi)星穩(wěn)定CRC患者相比，MSI-H CRC患者輔助化療的有益效果更少或沒有效果[26]。André等[33]在奧沙利鉑/5-氟尿嘧啶/亞葉酸鈣的結(jié)腸癌輔助治療的多中心國際研究(MOSAIC)中發(fā)現(xiàn)，對Ⅱ期或Ⅲ期CRC患者，在5-氟尿嘧啶和甲酰四氫葉酸方案中添加奧沙利鉑可顯著改善5年無病生存期和6年總體生存率，且更應(yīng)在Ⅲ期患者手術(shù)后給予[14]。然而，Alex等[34]研究762例轉(zhuǎn)移性CRC患者后證實(shí)，dMMR表型對奧沙利鉑化療具有耐藥性，且這種性質(zhì)在散發(fā)性dMMR表型中更為明顯。同樣，Ostwal等[35]在包含419例的局部中晚期直腸癌患者的治療研究中發(fā)現(xiàn)，296例具有dMMR的患者，以基于5-氟尿嘧啶，同時(shí)添加奧沙利鉑的化療作為新輔助治療手段相對缺乏益處。重要的是，該研究可能排除了在晚期直腸癌患者中使用抗dMMR療法，而這反過來可指導(dǎo)抗pMMR療法的研發(fā)?？傊?，對CRC輔助治療，dMMR對未轉(zhuǎn)移患者治療效果的預(yù)測具有一定的價(jià)值。目前不能僅憑MMR狀態(tài)來評估個(gè)體輔助治療效果，基因變異等特殊因素也應(yīng)考慮在內(nèi)，這就需要通過多中心、大樣本的臨床隨機(jī)對照試驗(yàn)為個(gè)體化的綜合治療策略提供依據(jù)。

3.2免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitors，ICIs)治療 ICIs治療已成為抗癌研究的熱點(diǎn),研究者已經(jīng)在腎細(xì)胞癌、肺癌、膀胱癌中證明了其有效性。dMMR會導(dǎo)致動態(tài)的超突變狀態(tài)，從而導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞新生抗原的持續(xù)產(chǎn)生，使其受到免疫監(jiān)視[36]。然而，腫瘤細(xì)胞為了逃避免疫反應(yīng)，在其細(xì)胞表面表達(dá)抑制性程序性細(xì)胞死亡配體1，其與 T淋巴細(xì)胞上的程序性細(xì)胞死亡受體1結(jié)合并抑制細(xì)胞毒活性。研究發(fā)現(xiàn)，與pMMR相比，dMMR的CRC具有較高的突變量，并對ICIs治療具有更高的反應(yīng)效率[37]。如ICIs單藥治療的反應(yīng)率在dMMR CRC中為30%～50%[38]。美國食品藥品管理局2017年5月23日加速批準(zhǔn)pembrolizumab用以治療成人和兒童無法切除或轉(zhuǎn)移的dMMR實(shí)體腫瘤患者，但未能說明免疫治療的最佳治療順序、最佳的治療持續(xù)時(shí)間，以及在pembrolizumab中是否可以添加其他藥物等問題[39]。因此，可將其看作ICIs探索性治療的突破進(jìn)展，Wang等[40]提供了1例73歲患有dMMR的轉(zhuǎn)移性CRC及急性炎癥性脫髓鞘性多發(fā)性神經(jīng)病的女性在長期使用pembrolizumab后癥狀完全緩解的病例，這在一定程度上激勵(lì)了免疫治療的探索。更重要的是，ICIs有望與多種其他藥劑聯(lián)合應(yīng)用，包括細(xì)胞毒性化學(xué)療法、小分子抑制劑、針對促分裂原活化的蛋白激酶途徑的靶向藥劑和放療技術(shù)等，但僅對少數(shù)具有特異突變表型的CRC患者適用，針對這些藥物的新型標(biāo)志物仍有待進(jìn)一步研究[37]。在轉(zhuǎn)移性高dMMR CRC的一線治療和切除的Ⅲ期結(jié)腸癌的輔助治療中，使用ICIs的隨機(jī)臨床試驗(yàn)(分別為NCT02563002和NCT02912559)正在進(jìn)行中[10]。

4 展 望

目前，MMR相關(guān)的CRC仍是臨床研究的重點(diǎn)，并且微生物或生態(tài)學(xué)領(lǐng)域研究的進(jìn)展為研究人員提供了新的研究思路和方式。雖然MMR對CRC的診斷、治療和預(yù)后具有重要指導(dǎo)意義，但仍有許多問題需要解決，如早期發(fā)現(xiàn)dMMR問題相關(guān)患者，進(jìn)行家族特異性的風(fēng)險(xiǎn)評估和管理仍具有挑戰(zhàn)性；MMR相關(guān)疾病的一級預(yù)防；對于不明原因的dMMR患者，遺傳物質(zhì)鑒定、遺傳咨詢和篩選需要更準(zhǔn)確及合理的治療指南；如何利用MMR獨(dú)特的免疫生物學(xué)行為，為患者治療個(gè)體化的治療方案有待進(jìn)一步探尋；隨著腫瘤醫(yī)療研究的發(fā)展，癌癥患者的整體治療、聯(lián)合治療及其療效評估亟待大樣本多中心試驗(yàn)。