低劑量氚照射對仔鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響及其機(jī)理研究

王 冰，呂慧敏，劉玉龍，高衛(wèi)民，王春燕，董金嬋，張 偉，陳煒博

(1. 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所，天津，300192；2.中國疾病預(yù)防控制中心輻射防護(hù)與核安全醫(yī)學(xué)所，北京，100088；3. 蘇州大學(xué)附屬第二醫(yī)院，江蘇 蘇州，215004)

0 引言

隨著世界能源需求不斷增長，核電作為清潔能源具有廣闊的發(fā)展前景。中國目前是全球核電發(fā)展最快的國家。截至2019年2月，我國大陸在運行核電機(jī)組達(dá)到45臺。我國能源發(fā)展“十三五”規(guī)劃中提出“到2020年運行核電裝機(jī)力爭達(dá)到5 800萬千瓦，在建核電裝機(jī)達(dá)到3 000萬千瓦以上”。至此，我國已然躋身于核電大國，核電甚至成為了我國核技術(shù)應(yīng)用領(lǐng)域的“國家名片”之一。同時，核技術(shù)在國民經(jīng)濟(jì)各個領(lǐng)域的應(yīng)用也十分廣泛。核能的發(fā)展和核技術(shù)的廣泛應(yīng)用造福于人類的同時，也給人類帶來了災(zāi)難和危險。前蘇聯(lián)切爾諾貝利核電站事故(1986.04)和日本福島核事故(2011.03)后，人們已經(jīng)行動起來，在避免或減少核與輻射事故的發(fā)生方面做了大量工作，全方位提高了核能安全水平，核應(yīng)急工作日益緊迫。

隨著核聚變的快速發(fā)展，重要核素氚的環(huán)境排放量增加以及在各領(lǐng)域的廣泛應(yīng)用，增加了人們受到氚照射的機(jī)會。環(huán)境中的氚主要以氚水形式存在，氚水可通過食物鏈、呼吸和皮膚接觸等途徑進(jìn)入人體造成危害。進(jìn)入母體后的氚可通過胎盤和乳汁無阻擋地進(jìn)入胚胎、胎兒和新生子代的腦組織，氚宮內(nèi)照射對子代可能產(chǎn)生的生物效應(yīng)很難得到人的資料，故實驗動物的研究成為本領(lǐng)域的重要課題[1-2]。

在進(jìn)行《低劑量氚照射對仔鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響及其機(jī)理研究》項目研究期間(1988—2002)，連續(xù)獲得1項國家自然科學(xué)研究基金、3項衛(wèi)生部科學(xué)研究基金及3項衛(wèi)生部工業(yè)衛(wèi)生實驗所所長基金資助。本研究超額完成了基金規(guī)定的內(nèi)容[3-7]。研究結(jié)果匯總?cè)缦隆?/p>

1 實驗材料

1.1 實驗動物

(1) Wistar大鼠：10周齡,體重250±10 g，北京醫(yī)科大學(xué)動物部提供。動物合格證號：醫(yī)動字第01-3056，1995。

(2) C57BL/6J小鼠：10周齡,體重22±2 g，中國預(yù)防醫(yī)學(xué)科學(xué)院微生物流行病研究所提供。動物合格證號：醫(yī)動字第01-3059號，1995。

(3) ICR小鼠胚胎：11天齡。

1.2 輻射源

(1)氚水：中國科學(xué)院上海原子能所提供，用蒸餾水稀釋后，經(jīng)Pharmacia WALLAC 1410型液閃標(biāo)定。

(2)有機(jī)結(jié)合氚(OBT)：3H-胸腺嘧啶核苷(3H-TdR)，從NEN購買。

1.3 主要儀器

液閃標(biāo)定儀，Pharmacia WALLAC 1410型，瑞典；γ計數(shù)儀，F(xiàn)J2003/50型；Y型迷宮，60 cm×45 cm×15 cm，電網(wǎng)連接220 V電源，TDGC調(diào)壓器；YL3型回轉(zhuǎn)式切片機(jī)，上海儀表廠；二氧化碳培養(yǎng)箱，Baxter USA；微電極拉制儀，Sachs-Flaming PC-84,USA；微電極拋光儀，Narishige Scientific Instrument Lab,Japan；倒置顯微鏡，Olympus；解剖顯微鏡，Carlzeiss,West Germany；膜片鉗記錄和分析軟件，P-clamp 5.5.1；放大器和Pclamp接口，TL-Ⅰ Axon Instruments；X射線機(jī)，Pantak 320S，Kanda；Nishikicho 2 Chome, Japan；FACSCalibur流式細(xì)胞儀，Becton Dickinson Immunocytometry Systems,USA。

1.4 主要試劑

RIA放免藥盒，中國人民解放軍總后科工委科盾新技術(shù)開發(fā)公司提供；胰蛋白酶，新疆化學(xué)試劑廠；馬血清，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所提供；MEM，Gibco,USA；Hepes和谷氨酰胺，Sigma；河豚毒(TTX)，秦皇島市水產(chǎn)品研究所；焦油紫，北京醫(yī)科大學(xué)神經(jīng)解剖教研室提供；苦味酸，廣東介山化工廠；DNA marker，Gibco BRL；羊多克隆抗p53抗體，USA；兔抗羊IgG抗體，USA。

2 實驗方法

2.1 照射

Wistar大鼠雌鼠與同齡雄鼠1∶1合籠過夜12 h，次日晨以檢查到陰栓定為妊娠零天。孕齡13 d按體重隨機(jī)分為3個實驗組和1個對照組，實驗組腹腔一次性注入氚水，對照組腹腔一次性注入蒸餾水。

C57BL/6J小鼠雌鼠與同齡雄鼠2∶1合籠過夜12 h，次日晨以檢查到陰栓確定為妊娠零天。孕齡12.5 d按體重隨機(jī)分為3個實驗組和1個對照組，實驗組腹腔一次性注入氚水，對照組腹腔一次性注入蒸餾水。

Wistar大鼠和C57BL/6J小鼠的3個實驗組注入氚水活度分別為24.09×104(低劑量組)、48.18×104(中劑量組)和144.54×104Bq/g(高劑量組)。以下文中分別以低劑量組、中劑量組、高劑量組說明。

3H-TdR用DMEM10稀釋調(diào)節(jié)到濃度為21.0 kBq/mL。在ICR小鼠11天齡胚胎MBC培養(yǎng)基中，加入含有HTO的DMEM10(5.616 MBq/mL)，培養(yǎng)20 h，進(jìn)行氚β射線照射，細(xì)胞核受氚照射劑量為0.42 Gy。

2.2 組織氚活度測量

動物經(jīng)麻醉或脫頸處死，采集生物樣品，樣品稱重并處理后，用液閃測定總氚活度。

2.3 組織水分含量測定[8-10]

采用冷凍干燥法。妊娠小鼠、胎兒、哺乳小鼠和新生仔鼠體內(nèi)水分含量的平均值分別是82%、96%、78%和81%。

2.4 氚生物半衰期的計算

動物濕組織中總氚生物半衰期(Tb)是通過氚存留曲線計算的，即收集組織樣品時氚活度與注射氚活度的百分比。單次腹腔注入氚水，妊娠和哺乳小鼠的Tb值分別是1.59和1.69 d，成年雄性和雌性小鼠的Tb值分別是1.96和2.06 d[8-9]。

2.5 仔鼠氚劑量估算

胎兒體內(nèi)水含量幾乎占100%。孕鼠單次腹腔注射氚水后，仔鼠體內(nèi)總氚累積吸收劑量(DT)應(yīng)為宮內(nèi)胎兒接受氚照射的吸收劑量(DF)和出生后某一時期氚吸收劑量(DN)的總和。此時，通過乳汁和有機(jī)結(jié)合氚的劑量可以忽略。氚水照射后10天，24.09×104、48.18×104和144.54×104Bq/g照射組的子代小鼠劑量分別為0.036、0.071和0.213 Gy；子代大鼠的劑量分別為0.044、0.088和0.264 Gy[10-15]。

培養(yǎng)的ICR小鼠11天齡胚胎受氚照射的劑量為1.68 Gy[16]。

2.6 妊娠和哺乳期氚分布和轉(zhuǎn)移[11-14]

妊娠第一天的小鼠按每克體重單次腹腔注射氚水，活度為1.82×105Bq, 收集妊娠鼠及胎兒的組織器官樣品并測量氚濃度。

哺乳第一天的小鼠按每克體重單次腹腔注射氚水，活度為1.85×105Bq。懷孕不同時間的孕鼠單次腹腔注射氚水，分別采集分娩后3.5 d的哺乳鼠和受乳鼠的生物樣品，并測量氚活度。

2.7 生物學(xué)指標(biāo)[18-33]

2.7.1仔鼠生長發(fā)育和生理標(biāo)志

檢查指標(biāo)包括張耳、開眼、出牙、睪丸下降、陰道張開。

張耳：仔鼠雙耳張開呈完全直立位為達(dá)標(biāo)。從出生后第3天齡開始檢測并記錄達(dá)標(biāo)天齡，直到全部仔鼠達(dá)標(biāo)。

開眼：仔鼠雙眼被膜處同時可見裂隙即為達(dá)標(biāo)。從出生后第10天齡開始檢測并記錄達(dá)標(biāo)天齡，直到全部仔鼠達(dá)標(biāo)。

出牙：仔鼠有一顆門齒長出牙床突破牙齦即為達(dá)標(biāo)。從出生后第9天齡開始檢測并記錄達(dá)標(biāo)天齡，直到全部仔鼠達(dá)標(biāo)。

睪丸下降：抓住雄性仔鼠前肢垂直放置，睪丸降到陰囊(可以觸及)即達(dá)標(biāo)。從出生后第19天齡開始檢測并記錄達(dá)標(biāo)天齡，直到全部仔鼠達(dá)標(biāo)。

陰道張開：仔鼠陰唇向旁拉開時可見膜開口即為達(dá)標(biāo)。從出生后第25天齡開始檢測并記錄達(dá)標(biāo)天齡，直到全部仔鼠達(dá)標(biāo)。

2.7.2仔鼠新生反射和感覺功能

檢查指標(biāo)包括斷崖回避、平面翻正、負(fù)趨地性、空中翻正、抓握反射、聽覺驚愕、視覺定位、趨母性試驗、痛覺反應(yīng)潛伏期的測定。

斷崖回避：將小鼠的頭向前置于臺面邊緣，3 s內(nèi)軀體縱軸轉(zhuǎn)過90°為陽性，連續(xù)3次呈陽性反應(yīng)為達(dá)標(biāo)。從出生后第3天齡開始檢測并記錄達(dá)標(biāo)天齡，直到全部的仔鼠達(dá)標(biāo)。

平面翻正：將仔鼠仰臥于表面稍粗糙的硬質(zhì)平板上，并使之保持片刻。松手后其能在3 s內(nèi)翻正呈俯臥位并連續(xù)3次成功即為達(dá)標(biāo)。從出生后第4天齡開始檢測并記錄達(dá)標(biāo)天齡，直到全部的仔鼠達(dá)標(biāo)。

負(fù)趨地性：將仔鼠頭向下置于25°斜面, 在15 s內(nèi)其完成轉(zhuǎn)頭并向斜面上方運動則達(dá)標(biāo)。從生后第3天齡起檢測并記錄達(dá)標(biāo)天齡，直到全部仔鼠達(dá)標(biāo)。

空中翻正：地面放置海綿墊，在距離海綿墊45 cm高處將仔鼠置于仰臥位，然后松手使其自然落下，仔鼠在連續(xù)兩次下落過程中均能自行轉(zhuǎn)體并呈俯臥位落地(四肢著地)為達(dá)標(biāo)。從出生后第11天齡開始檢測并記錄達(dá)標(biāo)天齡，直到全部仔鼠達(dá)標(biāo)。

抓握反射：提起仔鼠尾部使其四肢懸空，用一尖銳硬質(zhì)小棒輕觸其左后肢掌心，發(fā)生屈曲反射即為達(dá)標(biāo)。從生后第11天齡起檢測并記錄達(dá)標(biāo)天齡，直到全部仔鼠達(dá)標(biāo)。

聽覺驚愕：在仔鼠無意識準(zhǔn)備的情況下，突然給予聲鳴(哨聲)刺激，陽性反應(yīng)為仔鼠全身出現(xiàn)可見的抽動，連續(xù)2次刺激反應(yīng)呈陽性反應(yīng)為達(dá)標(biāo)。出生后第9天齡開始檢測并記錄達(dá)標(biāo)天齡，直到全部仔鼠達(dá)標(biāo)。

視覺定位: 提起仔鼠尾部使其四肢懸空，頭部盡量接近距地45 cm且與地面平行的方形鐵絲網(wǎng)邊緣，注意不要使其胡須與之接觸。仔鼠連續(xù)2次將前肢伸向其邊緣即為視覺發(fā)育正常(達(dá)標(biāo))。從生后第14天齡起檢測并記錄達(dá)標(biāo)天齡，直到全部仔鼠達(dá)標(biāo)。

趨母性試驗: 將母鼠置于以過道連接的2個無異味小籠之一中，其仔鼠依次放于過道中央。在3 min內(nèi)仔鼠發(fā)生向其母親方向的運動即為達(dá)標(biāo)。從生后第14天齡起檢測并記錄達(dá)標(biāo)天齡，直到全部仔鼠達(dá)標(biāo)。

痛覺反應(yīng)潛伏期的測定：金屬盤浮于55 ℃恒溫水育箱中放置10 min，使金屬盤與水溫一致。把雌性仔鼠放于盤上，當(dāng)仔鼠因熱刺激引起疼痛而出現(xiàn)踢后腿或舔后足或四肢亂動等反應(yīng)時取出動物。記錄放入金屬盤到出現(xiàn)疼痛反應(yīng)的時間，作為痛覺反應(yīng)潛伏期。仔鼠于出生后46和47天齡分別檢測。

2.7.3仔鼠運動協(xié)調(diào)功能和活動度

指標(biāo)包括轉(zhuǎn)體、足展開、前肢懸掛、連續(xù)通道活動。

轉(zhuǎn)體：仔鼠在30 s內(nèi)身體縱軸旋轉(zhuǎn)90°為陽性。從出生后第2天齡開始檢測并記錄達(dá)標(biāo)天齡，直到全部仔鼠達(dá)標(biāo)。

足展開：仔鼠雙側(cè)后足最外趾涂以黑色液體，在距離臺面30 cm高處自然下落至臺面白紙上，測量兩點間距離。仔鼠于出生后15和30天齡分別檢測，每天測量兩次，求平均值。

前肢懸掛：將14及16天齡的仔鼠后肢捆住，前肢懸掛于高45 cm的鐵絲上，記錄持續(xù)時間，連續(xù)無間隔地測定3次。

連續(xù)通道活動：仔鼠置于5 m長、有11個直角轉(zhuǎn)彎的通道中，記錄仔鼠在3 min內(nèi)轉(zhuǎn)彎次數(shù)，比較氚照射組與對照組仔鼠活動能力。

2.7.4行為測試試驗

行為測試試驗包括曠場試驗和孔板探究試驗。

曠場試驗：圓形鐵盒改裝而成的曠場直徑45 cm，分為面積近似的25個小格，壁高50 cm。距曠場中央60 cm高處放置一盞40 W燈泡進(jìn)行照明。把22天齡的仔鼠置于曠場中央的格中，記錄其走出中央格的潛伏期及2 min內(nèi)雙后肢走過的格子數(shù)。在暗環(huán)境下進(jìn)行測試。

孔板探究試驗：將直徑23.5 cm圓形木板置于經(jīng)改制的塑料桶中部，板距桶底15 cm，距桶上緣40 cm，板上鉆有9個間距1.5 cm的小孔。把100天齡的仔鼠置于孔板上，記錄其從被放入至將頭第一次探入孔中所用的時間，即首次探孔時間及其在2 min內(nèi)探孔的次數(shù)。探孔的定義為仔鼠將頭主動探入孔中。

2.7.5學(xué)習(xí)和記憶能力的測試試驗

測試試驗包括電擊回避學(xué)習(xí)、電擊回避記憶測試、食物迷宮測試、水迷宮測試、Y迷宮刺激單向回避反射實驗和條件反射試驗。

電擊回避學(xué)習(xí)：20 cm×20 cm×30 cm的方型有機(jī)玻璃箱，底部鋪設(shè)不繡鋼柵，箱底的一角固定一個3 cm×3 cm×2 cm的木塊。仔鼠第53、54和55天齡，每只仔鼠每天訓(xùn)練10次。仔鼠每次被放在箱底部與固定木塊對應(yīng)的角處，鼠頭向木塊，5 s后鋼柵通以38 V電擊鼠腳5 s，動物慌忙逃竄，在奔跑中偶然跳上安全臺，讓它停留10 s，拿出休息30 s后再重復(fù)，每只動物在每天訓(xùn)練結(jié)束后再進(jìn)行10次測試，測試時不用電擊，以在10 s內(nèi)跳上木塊為反應(yīng)正確，并將10次測試中正確反應(yīng)次數(shù)為7、8和9次定為達(dá)標(biāo)，且在最后一天測試達(dá)標(biāo)鼠作為已產(chǎn)生記憶鼠。

電擊回避記憶測試：仔鼠第62、69、76和113天齡，每只仔鼠每天進(jìn)行3次測試，裝置及方法同“電擊回避學(xué)習(xí)”。在3次測試中均反應(yīng)正確者認(rèn)為保持記憶；對未保持記憶者在下一次的檢測時仍記為未保持記憶者，予以淘汰，但記入累積數(shù)中。

食物迷宮測試：食物箱內(nèi)有葵花籽和動物飼料，將禁食36 h的50天齡仔鼠放入食物箱內(nèi)并開始記時，至其進(jìn)食時止，所用時間為首次進(jìn)食時間。仔鼠進(jìn)食10 s后，打開活動門1，將仔鼠趕出食物箱，關(guān)閉活動門1，打開活動門2并記時至其經(jīng)活動門2進(jìn)入食物箱時止，所用時間為首次獲食時間。在小鼠尋獲食物并進(jìn)食10 s后，關(guān)閉活動門2，打開活動門1并重復(fù)上述程序，以小鼠由1門至2門最短行走路線為正確路徑，記錄仔鼠從1門被趕出至由2門進(jìn)入食物箱所用時間及所走的錯誤路徑次數(shù)，如此連測3次，每只小鼠以均值作為統(tǒng)計值，每個劑量組平均獲食時間為其組中各小鼠統(tǒng)計值的平均值。平均錯誤路徑次數(shù)(以下稱平均錯誤)的計算與平均獲食的計算相仿。

水迷宮測試：設(shè)計一個50 cm×35 cm×20 cm的有機(jī)玻璃池，水深16 cm，水溫在22±1 ℃。仔鼠第60天齡測試。仔鼠從中間小池的起始點(跳臺)入水。首次登岸(安全臺)時間、平均登岸時間和平均錯誤等指標(biāo)的計算同“食物迷宮測試”小鼠首次登岸后休息30 s后再進(jìn)行下一次測試。

Y迷宮刺激單向回避反射實驗：將仔鼠置于Y迷宮中適應(yīng)2 min，在迷宮危險區(qū)置有兩道帶洞屏障，給予38 V電刺激，引導(dǎo)仔鼠由帶電的危險區(qū)到達(dá)安全區(qū)，每只仔鼠訓(xùn)練15次，再連續(xù)測試10次，記錄每次跑至安全區(qū)所用時間(超過5 s視為錯誤)。以10次中連續(xù)6次正確為陽性，計算每組陽性率并計算每組所有受試動物的無誤率(正確次數(shù)/總次數(shù))。

條件反射試驗：取Y迷宮兩臂，一臂為危險區(qū)，一臂為安全區(qū)，在危險區(qū)加置兩道帶洞屏障。仔鼠從出生后58天齡開始訓(xùn)練(第1實驗日)由危險區(qū)跑至安全區(qū)。每只仔鼠第1天訓(xùn)練15次，從第2實驗日起在鈴聲后給予38 V電刺激，連續(xù)訓(xùn)練7天，每天10次，以10次中連續(xù)6次仔鼠能在鈴聲后進(jìn)入安全區(qū)視為條件反射建立，記錄各組仔鼠每訓(xùn)練日的達(dá)標(biāo)率。

2.7.6腦發(fā)育及腦細(xì)胞學(xué)

內(nèi)容包括:(1)腦發(fā)育(腦體比)；(2)腦皮質(zhì)厚度、腦細(xì)胞計數(shù)及大腦錐體細(xì)胞發(fā)育；(3)腦海馬細(xì)胞學(xué)研究。

腦發(fā)育(腦體比)：小鼠仔鼠在出生后21、49和66天齡,大鼠仔鼠在第52天齡，稱重后，斷頭殺死，開顱取全腦(嗅球、大腦、小腦和延髓)稱重，計算腦體比。

腦皮質(zhì)厚度、腦細(xì)胞計數(shù)及大腦錐體細(xì)胞發(fā)育：在仔鼠第45或150天齡時，斷頭處死開顱取腦。對150天齡的仔鼠腦組織按Cox-鎢酸鹽法的改進(jìn)法固定、染色、切片。①腦皮質(zhì)厚度：每張切片測量3 次取均值，測量部位：大腦為中央前回上、中及下部的中段；小腦為蚓部相鄰的三個腦回的最高處。每張切片測量3次，每個標(biāo)本皮質(zhì)厚度取其9次測量的均值。②大腦皮質(zhì)第五層錐體細(xì)胞計數(shù)：每張切片計數(shù)4 個視野, 每個視野面積1.470×3.675 mm2, 共計數(shù)12個視野；由12個視野計算出每mm2大腦皮質(zhì)的細(xì)胞數(shù)。每個標(biāo)本單位面積的細(xì)胞數(shù)為其3張切片計算值的均數(shù)。③小腦浦氏細(xì)胞：每張切片沿小腦溝回共計數(shù)7.4 mm皮質(zhì)長度，細(xì)胞數(shù)計算與大腦的相仿，單位為每mm長度皮質(zhì)內(nèi)的細(xì)胞數(shù)。④大腦錐體細(xì)胞初級、次級樹突及樹突分枝比：將錐體細(xì)胞調(diào)到一個0.147×0.147 mm2的視野中央，計數(shù)該細(xì)胞在此范圍內(nèi)的初級和次級樹突數(shù)及樹突分枝比，即：樹突分枝比=初級樹突數(shù)/次級樹突數(shù)。次級樹突數(shù)為初級樹突數(shù)與其發(fā)出的一級分枝的和。每個標(biāo)本計數(shù)80～100個錐體細(xì)胞。

腦海馬錐體細(xì)胞[29,31]：取全腦，固定，修塊，脫水透明，浸蠟包埋，切片，染色，脫色透明，透明和封片。讀片，10(目鏡)×40(物鏡)倍視野下觀察海馬錐體細(xì)胞。連續(xù)切片中選擇錐體細(xì)胞面積大，密度高的部位進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)(以CA1區(qū)為基準(zhǔn))；每只動物取3片計數(shù)(每張載玻片上有4張腦切片，任選兩張，計數(shù)后取均數(shù))；兩側(cè)海馬各區(qū)錐體細(xì)胞分別計數(shù)，計數(shù)面積為116 μm×58 μm。每個劑量組實際計數(shù)的數(shù)目為5(動物數(shù))×3(切片數(shù))×2(兩側(cè)海馬)。

2.7.7仔鼠腦神經(jīng)肽含量的測定[32]

仔雄鼠第54天齡斷頭處死，鼠頭置于煮沸的生理鹽水中3 min。開顱取出腦組織，分離腦區(qū)并稱重。將已分離出的腦組織加入勻漿器中勻漿，加入NaOH溶液，3 000轉(zhuǎn)/min離心30 min，取上清液測定。

2.7.8神經(jīng)元培養(yǎng)和電生理記錄仔鼠海馬神經(jīng)元及Ca2+電流[29,31,33]

海馬神經(jīng)元培養(yǎng)后6、8、10和12 d，分別記錄各劑量組海馬神經(jīng)元Ca2+電流，每天2皿細(xì)胞，每皿測2～3個細(xì)胞。

2.7.9腦分子水平的研究[16-17,29,33]

內(nèi)容包括:(1)細(xì)胞凋亡的鑒定和定量；(2)培養(yǎng)細(xì)胞p53蛋白的檢測；(3)細(xì)胞周期的檢測。

細(xì)胞凋亡的鑒定和定量：利用形態(tài)學(xué)和常規(guī)的熒光染色和DNA電泳方法對培養(yǎng)的MBC細(xì)胞進(jìn)行凋亡的鑒定。在不同的時間點，培養(yǎng)物用胰島素-EDTA處理的單細(xì)胞懸液用戊二醛固定在PBS緩沖液中，接著用Hoechst 33342(HO)染色。凋亡的細(xì)胞具有濃縮的染色質(zhì)，同時記錄凋亡細(xì)胞的百分?jǐn)?shù)。根據(jù)Ramachandra等提供的方法稍作修改，凝膠電泳檢測DNA片段。DNA片段(free DNA)用枸櫞酸鹽磷酸緩沖液進(jìn)行抽提，接著用RNase和蛋白酶K消化。得到的樣品進(jìn)行瓊脂凝膠電泳、DNA顯影，并在UV燈下拍片。胎兒和新生小鼠的腦用10%福爾馬林溶液固定，石蠟包埋。常規(guī)HE染色，鑒定凋亡細(xì)胞，放大400倍進(jìn)行定量。同一樣品檢測200～250個細(xì)胞，每組檢測3個樣品。

培養(yǎng)細(xì)胞p53蛋白的檢測：培養(yǎng)物用SDS-PAGE和Western Blotting的方法檢測p53。在不同的時間點收集MBC細(xì)胞，并用SDS-PAGE樣品分解緩沖液處理。每個樣品的等量全蛋白細(xì)胞溶解產(chǎn)物加入12.5%SDS-多聚acrylamide凝膠電泳池中電泳，然后電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上(BioRad)。多余的結(jié)合位點用含5%干牛奶和0.05%Tween20的PBS(PBST)、4 ℃下過夜培養(yǎng)濾膜來阻斷。濾膜與羊的多克隆抗-p53抗體一起培養(yǎng)(M-19)1.5 h。用PBST洗兩次，與堿性磷酸酶結(jié)合的兔抗羊IgG抗體培養(yǎng)。抗體復(fù)合物用NBT/BCIP顯色反應(yīng)來檢測。

細(xì)胞周期的檢測：培養(yǎng)物中細(xì)胞周期的分布用FACS Calibur流式細(xì)胞儀測定。在不同的時間點，培養(yǎng)物用胰島素-EDTA處理后，單細(xì)胞懸液在4 ℃下用70%乙醇固定至少4 h，或者保存在-20 ℃下過夜。接著，細(xì)胞與RNase一起培養(yǎng)并在室溫暗室下、PBS中用PI染色至少30 min。在流式細(xì)胞儀測定前，細(xì)胞用30 um的尼龍網(wǎng)過濾。

2.8 閾劑量

閾劑量是指與對照組相比某項生物學(xué)指標(biāo)出現(xiàn)顯著性差異的最低劑量。

小鼠的生物學(xué)指標(biāo)包括生長發(fā)育、神經(jīng)行為、出生后不同時期腦發(fā)育、出生后不同時期腦病理、腦生化測定以及細(xì)胞凋亡的研究。大鼠的生物學(xué)指標(biāo)包括生長發(fā)育、神經(jīng)行為、腦發(fā)育、腦病理、海馬神經(jīng)元體外培養(yǎng)形態(tài)觀察和計數(shù)以及海馬神經(jīng)元Ca2+電流測定。共計56項生物學(xué)指標(biāo)。

2.9 統(tǒng)計分析

用STATA和SAS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計檢驗。

t檢驗或方差分析：體重、張耳、出牙、開眼、睪丸下降和陰道張開的平均達(dá)標(biāo)天齡；斷崖回避、平面翻正、負(fù)趨地性、空中翻正、抓握反射、視覺定位、聽覺驚愕和趨母性試驗的平均達(dá)標(biāo)天齡，痛覺反應(yīng)潛伏期；轉(zhuǎn)體的平均達(dá)標(biāo)天齡、足展開的距離、前肢懸掛的時間、連續(xù)通道活動轉(zhuǎn)彎數(shù)；曠場試驗平均潛伏期和走格數(shù)、孔板探究試驗首次探孔時間和平均探孔數(shù)；食物迷宮試驗的首次進(jìn)食時間、首次獲食時間、平均獲食時間、平均錯誤次數(shù)，水迷宮首次登岸時間、平均登岸時間、平均錯誤次數(shù)，Y迷宮刺激回避反射試驗的逃避時間；腦體比、腦皮質(zhì)厚度、腦細(xì)胞數(shù)、樹突數(shù)和樹突比、海馬各區(qū)錐體細(xì)胞計數(shù)；生長抑素、精氨酸加壓素濃度；體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元計數(shù)，Ca2+電流幅度；細(xì)胞凋亡數(shù)，p53蛋白含量。

方差分析及χ2檢驗：電擊回避的學(xué)習(xí)和記憶保持，Y迷宮刺激回避反射試驗的陽性率和無誤率，條件反射的達(dá)標(biāo)率；海馬神經(jīng)元Ca2+電流。

3 結(jié)果

3.1 出生前氚照射對仔鼠生理標(biāo)志出現(xiàn)天齡的影響[5-6,19,25]

出生前氚照射對小鼠和大鼠仔鼠生理標(biāo)志出現(xiàn)天齡的影響結(jié)果分別列于表1和表2。

由表1和表2可見，與對照組相比，小鼠3個實驗組仔鼠張耳和出牙時間顯著延遲，中劑量組和高劑量組開眼發(fā)育顯著延遲；大鼠中劑量組和高劑量組出牙顯著延遲，高劑量組張耳及開眼顯著延遲。

表1 出生前氚照射對小鼠仔鼠生理標(biāo)志出現(xiàn)天齡的影響結(jié)果

注：*與對照組相比,p<0.05；**與對照組相比,p<0.01。 余表同。

表2 出生前氚照射對大鼠仔鼠生理標(biāo)志出現(xiàn)天齡的影響結(jié)果

3.2 出生前氚照射對仔鼠新生反射出現(xiàn)天齡的影響[19]

出生前氚照射對小鼠和大鼠仔鼠新生反射出現(xiàn)天齡的影響結(jié)果分別列于表3和表4。由表3可見，與對照組相比，小鼠中劑量組和高劑量組仔鼠斷崖回避、空中翻正、平面翻正反射出現(xiàn)時間顯著延遲。由表4可見，大鼠中劑量組和高劑量組仔鼠平面翻正和負(fù)趨地性出現(xiàn)時間顯著延遲。

表3 出生前氚照射對小鼠仔鼠新生反射出現(xiàn)天齡的影響結(jié)果

表4 出生前氚照射對大鼠仔鼠新生反射出現(xiàn)天齡的影響結(jié)果

3.3 出生前氚照射對感覺功能出現(xiàn)天齡的影響[19]

出生前氚水照射后小鼠和大鼠子代感覺功能出現(xiàn)天齡的影響結(jié)果分別列于表5和表6。

由表5可見，與對照組相比，小鼠3個實驗組仔鼠的聽覺驚愕出現(xiàn)天齡均延緩，46和47天齡痛覺反應(yīng)潛伏期延長，趨母性試驗出現(xiàn)發(fā)育受阻，中劑量組和高劑量組視覺定位受到影響。

表5 出生前氚照射對小鼠仔鼠感覺功能出現(xiàn)天齡的影響結(jié)果

注：1)46 天齡仔鼠；2)47 天齡仔鼠。

由表6可見，大鼠中劑量組和高劑量組仔鼠的聽覺驚愕出現(xiàn)的平均天齡顯著延緩。

表6 出生前氚照射對大鼠仔鼠聽覺驚愕出現(xiàn)天齡的影響結(jié)果

3.4 出生前氚照射對仔鼠運動協(xié)調(diào)功能和活動度的影響[26]

出生前氚照射對小鼠和大鼠仔鼠運動協(xié)調(diào)功能和活動度的影響結(jié)果分別列于表7和表8。

由表7可見，與對照組相比，小鼠中劑量組和高劑量組28天齡仔鼠的連續(xù)通道活動轉(zhuǎn)彎數(shù)減少顯著； 高劑量組63天齡仔鼠的連續(xù)通道活動轉(zhuǎn)彎次數(shù)減少顯著。

由表8可見，與對照組相比，大鼠高劑量組仔鼠14和16天齡前肢懸掛時間縮短顯著，28天齡仔鼠的連續(xù)通道活動轉(zhuǎn)彎數(shù)低劑量組減少顯著。

3.5 出生前氚照射對仔鼠行為測試試驗的影響[19]

出生前氚照射對小鼠仔鼠行為測試試驗的影響結(jié)果列于表9。由表9可見，與對照組相比，小鼠中劑量組和高劑量組仔鼠離開曠場中央的潛伏期和仔鼠走格數(shù)兩項指標(biāo)的差異非常顯著，具體表現(xiàn)為潛伏期的縮短和走格數(shù)的增加；3個實驗組首次探孔時間顯著延長，低劑量組平均探孔次數(shù)明顯減少，中劑量組和高劑量組這種差異更加顯著。

3.6 出生前氚照射對仔鼠學(xué)習(xí)記憶能力的影響[20,22,25-27]

出生前氚照射對小鼠仔鼠電擊回避學(xué)習(xí)情況的影響結(jié)果列于表10。對電擊回避學(xué)習(xí)記憶保持情況的影響結(jié)果列于表11。食物迷宮實驗測試結(jié)果列于表12。水迷宮實驗測試結(jié)果列于表13。對Y迷宮刺激單向回避反射的影響結(jié)果列于表14。對條件反射達(dá)標(biāo)率的影響結(jié)果列于表15。

表7 出生前氚照射對小鼠不同天齡仔鼠運動協(xié)調(diào)功能和活動度的影響結(jié)果

表8 出生前氚照射對大鼠不同天齡仔鼠運動和協(xié)調(diào)功能及活動度的影響結(jié)果

表9 出生前氚照射后小鼠仔鼠行為測試試驗的影響結(jié)果

表10 出生前氚照射對小鼠不同天齡仔鼠電擊回避學(xué)習(xí)情況的影響結(jié)果

注：達(dá)標(biāo)數(shù)和失敗數(shù)(未達(dá)標(biāo)數(shù))均指累積數(shù)。余表同。

表11 出生前氚照射對小鼠不同天齡仔鼠電擊回避學(xué)習(xí)記憶保持情況的影響結(jié)果

表12 出生前氚照射對小鼠仔鼠食物迷宮實驗測試的影響結(jié)果

表13 出生前氚照射CF 小鼠仔鼠水迷宮實驗測試的影響結(jié)果

表14 出生前氚照射對小鼠仔鼠Y迷宮刺激單向回避反射的影響結(jié)果

表15 出生前氚照射對小鼠不同天齡仔鼠條件反射達(dá)標(biāo)率的影響結(jié)果(%)

注：()內(nèi)數(shù)字表示實驗日。余表同。

出生前氚照射對大鼠仔鼠Y迷宮刺激回避反射試驗的影響結(jié)果列于表16。對條件反射達(dá)標(biāo)率的影響結(jié)果列于表17。

實驗結(jié)果表明，與對照組相比：小鼠中劑量組和高劑量組仔鼠電擊回避學(xué)習(xí)能力差異顯著，記憶喪失的比例增加，且這種情況差異具有統(tǒng)計學(xué)意義；首次進(jìn)食時間和平均獲食時間顯著改變，高劑量組仔鼠平均錯誤次數(shù)的增加差異顯著；仔鼠水迷宮實驗，實驗組平均錯誤次數(shù)比對照組明顯增加；中劑量組和高劑量組仔鼠回避反射的無誤率及陽性率顯著降低；高劑量組仔鼠4、5、6、7和8實驗日條件反射達(dá)標(biāo)率顯著降低；實驗組45天齡逃避時間均明顯延長，中劑量組和高劑量組逃避無誤率顯著降低，逃避時間延長差異非常顯著性。

大鼠中劑量組仔鼠51天齡和52天齡(第6和7實驗日)的達(dá)標(biāo)率顯著降低，高劑量組50、51和52天齡(第5、6和7實驗日)仔鼠條件反射達(dá)標(biāo)率顯著性降低。

3.7 出生前氚照射對仔鼠腦發(fā)育及腦細(xì)胞學(xué)的研究[29-31,33]

出生前氚照射對小鼠仔鼠體重和腦重的影響結(jié)果列于表18。對不同天齡雌性仔鼠腦體比的影響結(jié)果列于表19。對不同天齡雄性仔鼠腦體比的影響結(jié)果列于表20。對小鼠仔鼠腦皮質(zhì)厚度和腦細(xì)胞數(shù)的影響結(jié)果列于表21。對150天齡仔鼠大腦錐體細(xì)胞樹突的影響結(jié)果列于表22。21天齡仔鼠海馬各區(qū)錐體細(xì)胞計數(shù)結(jié)果列于表23。49天齡仔鼠海馬各區(qū)錐體細(xì)胞計數(shù)結(jié)果列于表24。66天齡仔鼠海馬各區(qū)錐體細(xì)胞計數(shù)結(jié)果列于表25。

表16 出生前氚照射對大鼠仔鼠Y迷宮刺激回避反射試驗的影響結(jié)果

表17 出生前氚照射對大鼠不同天齡仔鼠條件反射達(dá)標(biāo)率的影響(%)

表18 出生前氚照射對小鼠不同天齡仔鼠腦重的影響結(jié)果(mg)

注： ( )內(nèi)數(shù)字表示仔鼠數(shù)。余表同。

表19 出生前氚照射對小鼠不同天齡雌性仔鼠腦體比的影響結(jié)果( ×10-2)

表20 出生前氚照射對小鼠不同天齡雄性仔鼠腦體比的影響結(jié)果(×10-2)

表21 出生前氚照射對小鼠仔鼠腦皮質(zhì)厚度和腦細(xì)胞數(shù)的影響結(jié)果

表22 出生前氚照射對小鼠150天齡仔鼠大腦錐體細(xì)胞樹突的影響結(jié)果

表23 出生前氚照射對小鼠21天齡仔鼠海馬各區(qū)錐體細(xì)胞計數(shù)的影響結(jié)果

表24 出生前氚照射對小鼠49天齡仔鼠海馬各區(qū)錐體細(xì)胞計數(shù)的影響結(jié)果

表25 出生前氚照射對小鼠66天齡仔鼠海馬各區(qū)錐體細(xì)胞計數(shù)的影響結(jié)果

52天齡各組大鼠仔鼠體重和腦重的結(jié)果列于表26。大鼠仔鼠海馬各區(qū)錐體細(xì)胞計數(shù)結(jié)果列于表27。

研究結(jié)果表明：

腦重，中劑量組和高劑量組雌性仔鼠45天齡顯著降低。腦體比，中劑量組21天齡、高劑量組21、49及66天齡明顯降低，高劑量組降低顯著。

小鼠雄性仔鼠在150天齡時的大腦錐體細(xì)胞數(shù)和小腦浦氏細(xì)胞數(shù)均明顯減少；而對于腦皮質(zhì)厚度，各受照組大、小腦皮質(zhì)厚度依劑量的增加均有變薄趨勢，高劑量組差異顯著。

實驗組150天齡的雄性仔鼠大腦錐體細(xì)胞的初級和次級樹突均受阻，改變非常顯著，樹突分枝比值的變化也與此一致。

低劑量組21天齡仔鼠海馬CA1及CA3區(qū)、49天齡CA1區(qū)、66天齡CA1區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)均比對照組明顯降低。中劑量組21天齡CA1及CA3區(qū)、49天齡CA1及CA3區(qū)、66天齡CA1及CA3區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)均比對照組顯著減少。高劑量組21天齡海馬各區(qū)，49天齡CA1、CA3及CA4區(qū)，66天齡CA1和CA3區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)都比對照組明顯減少。隨著出生天齡的延長，CA2及CA4區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)逐漸恢復(fù)，在66天齡時基本恢復(fù)正常，但CA1及CA3區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)恢復(fù)不明顯，相同天齡錐體細(xì)胞減少程度隨劑量增加而增加。

大鼠實驗結(jié)果與小鼠相似。

3.8 出生前氚照射對仔鼠腦神經(jīng)肽含量的影響[32]

出生前氚照射對小鼠仔鼠生長抑素、精氨酸加壓素含量的影響結(jié)果列于表28。由表28可見，與對照組相比，中劑量組和高劑量組雄性仔鼠腦垂體中生長抑素(SOM)含量升高顯著；高劑量組下丘腦中精氨酸加壓素(AVP)含量顯著降低。

表26 出生前氚照射對大鼠52天齡仔鼠體重和腦重的影響結(jié)果

表27 出生前氚照射對大鼠仔鼠海馬各區(qū)錐體細(xì)胞計數(shù)的影響結(jié)果

表28 出生前氚照射對小鼠仔鼠生長抑素、精氨酸加壓素含量的影響結(jié)果

3.9 出生前氚照射對大鼠仔鼠海馬神經(jīng)元及Ca2+電流的影響[29,31,33]

出生前氚照射對新生大鼠仔鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)的影響結(jié)果列于表29。

中劑量組和高劑量組海馬神經(jīng)元生長緩慢，胞體較小，視野中細(xì)胞數(shù)較少，2周時開始退化，退化的神經(jīng)細(xì)胞輪廓不清，界限模糊，胞漿顆粒增多,出現(xiàn)空泡，腫脹、斷裂、崩解，網(wǎng)絡(luò)稀疏。中劑量組和高劑量組體外培養(yǎng)6、8、10和12天的海馬神經(jīng)元數(shù)顯著減少。

比較不同劑量的氚照射對海馬神經(jīng)元Ca2+電流的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，高劑量組海馬神經(jīng)元Ca2+電流明顯下降，Ca2+電流的衰減與照射劑量及培養(yǎng)天數(shù)無關(guān)，而與記錄神經(jīng)元的狀態(tài)有關(guān)。對照組及照射組均發(fā)現(xiàn)快相和慢相Ca2+電流。

表29 出生前氚照射對大鼠不同天齡仔鼠海馬神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)的影響結(jié)果(個/視野)

3.10 氚水和OBT照射對仔鼠腦分子水平的影響[16-17]

MBC培養(yǎng)基中，加入3H-TdR或HTO培養(yǎng)后，細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)逐漸增加。培養(yǎng)12 h后，細(xì)胞凋亡百分?jǐn)?shù)明顯的高于對照組，培養(yǎng)第4天，3H-TdR組和HTO組分別達(dá)到24.5%和28.1%。

3.11 妊娠和哺乳期氚的分布和轉(zhuǎn)移[9]

妊娠第1天的孕鼠單次腹腔注射氚水后，測量妊娠和胚胎小鼠組織樣品的氚活度，結(jié)果發(fā)現(xiàn)氚是均勻分布的。注射第2天，注入氚水量的51%滯留在體內(nèi)，到第20天體內(nèi)僅存留1.5%。在同樣取樣時間，胎盤和胚胎中氚活度與孕鼠組織中氚活度近似。結(jié)果沒有顯示出胎盤對氚轉(zhuǎn)移的屏蔽作用。妊娠0天接受氚水照射后5、10和20天通過胎盤轉(zhuǎn)移到胚胎的系數(shù)分別為0.96、0.97和1.06。哺乳當(dāng)天接受氚水照射后10、15和20天通過乳汁轉(zhuǎn)移到仔鼠的系數(shù)分別為1.30、1.89和2.10。母鼠體內(nèi)的氚通過乳汁向仔鼠轉(zhuǎn)移，及通過胎盤和乳汁聯(lián)合轉(zhuǎn)移，仔鼠體內(nèi)氚比母鼠高1.3～2倍。

3.12 閾劑量[3-7]

研究分為3部分：第1部分，C57BL/6J孕鼠63只，獲仔鼠399只，22項生物指標(biāo)；第2部分，C57BL/6J孕鼠49只，獲仔鼠234只，18項生物指標(biāo)；第3部分，Wistar大鼠孕鼠12只，獲仔鼠86只，16項生物指標(biāo)。

出生前氚照射對大鼠和小鼠仔鼠不同生物學(xué)指標(biāo)影響的劑量閾值結(jié)果列于表30。大鼠和小鼠不同生物學(xué)指標(biāo)的氚致畸閾劑量閾值分布結(jié)果列于表31。結(jié)果可見，56項生物學(xué)指標(biāo)中，45項生物學(xué)指標(biāo)致畸閾值在0.03～0.092 Gy范圍內(nèi)，11項在0.093～0.30 Gy范圍內(nèi)。

表30 出生前氚照射對大鼠和小鼠仔鼠不同生物學(xué)指標(biāo)影響的致畸劑量閾值結(jié)果

注：第一、二部分實驗用動物為C57BL/6J小鼠；第三部分實驗用Wistar大鼠。

4 討論

(1)劑量估算

胚胎或胎兒在宮內(nèi)接受內(nèi)照射只有進(jìn)行合理的劑量估算才能確定劑量-效應(yīng)關(guān)系和制定標(biāo)準(zhǔn)。

以往的研究中，用成年鼠的估算模式估計仔鼠的劑量是不合理的，因為孕鼠及胎鼠的代謝模式與成年鼠不同，其半排期較成年鼠短，因此用成年鼠的估算模式來估計出生前受照的仔鼠累積吸收劑量必將導(dǎo)致結(jié)果的偏高。氚水能暢通無阻地通過血腦屏障，均勻地分布在包括神經(jīng)系統(tǒng)在內(nèi)的各種組織和臟器中。出生前接受氚照射的大鼠仔鼠的劑量估算已有較為適宜的模式。

表31 仔鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)生物學(xué)指標(biāo)致在氚畸閾劑量數(shù)的分布數(shù)

本次實驗參考國內(nèi)外學(xué)者對大鼠的劑量估算模式及某些參數(shù)對大鼠仔鼠進(jìn)行估算，并在此基礎(chǔ)上，結(jié)合本實驗室以往研究的相關(guān)成年小鼠及孕小鼠的代謝、分布參數(shù)等對小鼠仔鼠進(jìn)行劑量估算。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著仔鼠出生后天齡的增加氚累積吸收劑量也稍有增加，但到出生后一定天齡時(小鼠仔鼠出生后6 d，大鼠仔鼠出生后12 d)氚累積吸收劑量保持恒定。雖然出生后不同時間仔鼠氚累積吸收劑量有所不同但變化甚微。比較大鼠和小鼠的劑量估算結(jié)果發(fā)現(xiàn)，宮內(nèi)接受氚照射后相同時間，大鼠氚累積吸收劑量比小鼠氚累積吸收劑量高。分析認(rèn)為，妊娠大鼠及仔鼠的半排期比小鼠長，氚水在大鼠體內(nèi)滯留多、代謝慢，所以盡管以相同的氚水活度注入腹腔，而劑量上仍然有一定的差異[3,7,9,15]。

(2)生長發(fā)育及神經(jīng)行為

低劑量組仔鼠連續(xù)通道活動轉(zhuǎn)彎數(shù)減少，并隨著劑量增加效應(yīng)更加明顯。中劑量組仔鼠出牙出現(xiàn)的延遲、平面翻正及聽覺驚愕達(dá)標(biāo)天齡的延遲，隨著劑量增加更明顯。高劑量組仔鼠張耳及開眼出現(xiàn)的延遲，14及16天齡仔鼠前肢懸掛時間縮短。結(jié)果說明，出生前氚水照射對中樞神經(jīng)系統(tǒng)有抑制作用，不同指標(biāo)的敏感性不同。

選擇與小鼠同樣的兩項學(xué)習(xí)記憶行為指標(biāo)測定大鼠的智力發(fā)育狀況(Y迷宮刺激回避反射試驗和條件反射試驗)。結(jié)果表明，低劑量組仔鼠初級學(xué)習(xí)記憶能力受損。中劑量組50～52天齡的仔鼠產(chǎn)生條件反射建立達(dá)標(biāo)率的降低。大、小鼠初級和高級學(xué)習(xí)記憶功能受損的結(jié)果的說明出生前氚照射可導(dǎo)致仔鼠智力遲鈍。與人類資料一致[19-20,25-26]。

電擊回避和迷宮實驗結(jié)果表明，中劑量組和高劑量組仔鼠對短期學(xué)習(xí)發(fā)生障礙，獲得記憶鼠所占比例顯著低于對照；而經(jīng)過連續(xù)3天的30次訓(xùn)練后，這種差異已不再有統(tǒng)計學(xué)意義。在對電擊回避記憶保持上，上述兩個劑量組仔鼠在學(xué)習(xí)結(jié)束二周后，記憶保持者所占比例不足60%，而此時對照組仍有89%以上保持記憶，說明中劑量組仔鼠在長期記憶上已發(fā)生障礙，這是否由于輻射損害了仔鼠記憶鞏固過程有待于進(jìn)一步研究。對仔鼠短期記憶損害的腦生化基礎(chǔ)研究結(jié)果表明，高劑量組仔鼠下丘腦精氨酸加壓素的含量降低。記憶過程是一個極為復(fù)雜的心理過程，結(jié)合生化和組織學(xué)的進(jìn)一步研究對我們探討輻射損傷的生物學(xué)機(jī)理十分必要[20,22,27]。

(3)腦病理學(xué)改變

宮內(nèi)氚輻射對仔鼠體重的影響，在從出生時至出生后成年相對較長的時間內(nèi)均有持續(xù)作用。仔鼠45天齡時，中劑量組和高劑量組雌雄鼠全腦重均分別低于對照組，雖然雌鼠體重在各劑量組并無顯著性改變，但腦重的變化說明腦發(fā)育受阻的程度大于體重發(fā)育所受的阻礙。

照射使腦神經(jīng)元缺失，從而致神經(jīng)機(jī)能減退，相應(yīng)的運動機(jī)能和智力活動將發(fā)生失調(diào)和遲鈍。皮層的軀體運動調(diào)節(jié)功能是通過錐體系和錐體外系下傳完成的，錐體細(xì)胞的缺失直接影響到錐體束纖維的組成；大小腦之間聯(lián)系密切，小腦與軀體運動的反射調(diào)節(jié)有著密切的關(guān)系，而浦氏細(xì)胞的軸突是小腦皮層唯一的傳出纖維，它的缺失將使小腦皮層與其深部核團(tuán)細(xì)胞的突觸聯(lián)系直接受到影響，加之錐體細(xì)胞的樹突減少，它與其它神經(jīng)元的化學(xué)信息傳遞必然減弱。這些很可能是導(dǎo)致宮內(nèi)受照后仔鼠反射發(fā)育遲緩的解剖學(xué)和生理學(xué)基礎(chǔ)。結(jié)合對仔鼠腦神經(jīng)肽及行為、學(xué)習(xí)和記憶能力的檢測結(jié)果，從病因?qū)W方面支持 ICRP 對原子彈爆炸幸存者所做的關(guān)于受照時間和智力遲鈍發(fā)生的流行病學(xué)調(diào)查結(jié)果[1]。

(4)神經(jīng)元的形態(tài)觀察及電生理功能的測定

輻射對細(xì)胞、整體的損傷必然基于分子水平物質(zhì)的變化,如DNA、酶和激素等含量改變。近年來，氚的生化、分子神經(jīng)毒理學(xué)研究多限于遞質(zhì)、激素和DNA/RNA含量等。對電生理的研究尚未見報道。有關(guān)外照射的電生理研究也只限于大劑量。本研究體外培養(yǎng)新生大鼠海馬神經(jīng)元的形態(tài)觀察及電生理功能的測定結(jié)果發(fā)現(xiàn)，中劑量組和高劑量組海馬神經(jīng)元生長緩慢，胞體較小，較早退化。并且視野中海馬神經(jīng)元數(shù)目明顯減少。結(jié)果說明一定劑量的氚照射，可明顯抑制海馬神經(jīng)元的生長發(fā)育和增殖能力，并且隨劑量增加效應(yīng)明顯增加。

離子通道是神經(jīng)、肌肉和其它組織細(xì)胞膜興奮性的基礎(chǔ)，是生物電活動的基礎(chǔ)。離子通道是生物膜上的特殊蛋白大分子。1976年西德Neher和Sakmann直接從生物膜上記錄了離子單通道電流。80年代初期發(fā)展起來的膜片鉗技術(shù)，為從分子水平了解生物膜離子通道的開啟和關(guān)閉、動力學(xué)、選擇性和通透性等膜信息提供了直接手段。由于Ca2+對細(xì)胞有極重要的生理功能，如遞質(zhì)釋放、肌肉收縮和第二信使等作用，沒有鈣通道，神經(jīng)系統(tǒng)將無輸出。電壓依賴的Ca2+通道廣泛存在于各種組織細(xì)胞中，是細(xì)胞興奮時鈣內(nèi)流的主要途徑，其為許多神經(jīng)毒素和藥物的作用靶，因此研究輻射對電壓依賴性鈣通道的影響極為重要，可為闡明輻射對海馬神經(jīng)元影響的分子機(jī)制提供資料。本實驗結(jié)果表明，隨著體外培養(yǎng)海馬神經(jīng)元時間的延長，細(xì)胞Ca2+電流逐漸增加，隨氚照射劑量的增加，Ca2+電流有下降趨勢，高劑量組下降顯著，分析認(rèn)為鈣電流降低，與輻射導(dǎo)致海馬神經(jīng)元功能受損密切相關(guān)。

另外，由于一定的細(xì)胞數(shù)可維持細(xì)胞間相互營養(yǎng)和支持作用，其可能與氚內(nèi)照射導(dǎo)致細(xì)胞活存數(shù)較少，細(xì)胞存活狀況不好也有關(guān)系。由于突觸形成過程對Ca2+很敏感，相對低的突觸前高水平Ca2+可增加神經(jīng)遞質(zhì)的釋放和突觸電位的增強(qiáng)。本實驗條件下，實驗組Ca2+電流比對照組低，可能對海馬神經(jīng)元突觸活動產(chǎn)生影響，如突觸電位的改變、神經(jīng)遞質(zhì)釋放減少，并且需要Ca2+參與的細(xì)胞核和蛋白合成系統(tǒng)也可能受損，導(dǎo)致神經(jīng)信息傳導(dǎo)的不良，而導(dǎo)致神經(jīng)行為尤其是學(xué)習(xí)記憶功能的嚴(yán)重?fù)p傷[29,31,33]。

(5)閾劑量

實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，出生前氚照射對仔鼠中樞神經(jīng)系統(tǒng)影響的致畸閾值大部分在0.03～0.092 Gy范圍內(nèi)，少數(shù)在0.093～0.30 Gy范圍內(nèi)，提示低至0.092 Gy的氚照射妊娠的大鼠或小鼠即可導(dǎo)致大鼠或小鼠仔鼠表現(xiàn)出體內(nèi)或體外的異常改變，并且這種改變往往具有不可逆性。鑒于中樞神經(jīng)系統(tǒng)調(diào)控機(jī)體的特殊性、其本身結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性及不同測試指標(biāo)靈敏性的差異，研究選用了多項指標(biāo)以期全面、系統(tǒng)的探討氚輻射對中樞神經(jīng)系統(tǒng)可能造成的生物效應(yīng)。結(jié)果顯示，不同指標(biāo)對氚輻射敏感性的差異是顯著的，但是在實驗中各指標(biāo)均隨劑量增加而加重，這不僅為我們今后工作的開展確立了敏感的指標(biāo)，也提示我們應(yīng)進(jìn)一步增加實驗劑量點，將有可能實現(xiàn)選擇適當(dāng)?shù)臄?shù)學(xué)模型來分析劑量-效應(yīng)關(guān)系及致畸閾值的確定[3-4,6-7]。

5 結(jié)語

腦是分子、細(xì)胞和組織活動相互關(guān)聯(lián)、相互制約的高度綜合體。機(jī)體是一復(fù)雜的有機(jī)體，體內(nèi)其它因素如體液效應(yīng)可能影響神經(jīng)元的活性，血流的改變和血腦屏障的改變將影響腦功能，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的改變也會改變神經(jīng)元的環(huán)境。

利用多種實驗動物并完善實驗?zāi)Ｐ?，加?qiáng)對氚內(nèi)照射致細(xì)胞核劑量的估算，采用綜合指標(biāo)在分子、基因水平上深入地探討氚對發(fā)育中腦的生物效應(yīng)并將動物實驗所得的劑量-效應(yīng)關(guān)系適當(dāng)?shù)赝馔朴谌?，這些研究工作均有待于進(jìn)一步開展。諸多相關(guān)因素相互作用徹底弄清后，我們才能充分認(rèn)識輻射對諸多神經(jīng)行為的損傷作用。