氚水誘發(fā)染色體畸變的研究進展

王春燕(中國疾病預(yù)防控制中心輻射防護與核安全醫(yī)學(xué)所，北京，100088)

劉玉龍 (蘇州大學(xué)第二附屬醫(yī)院，江蘇 蘇州，215004)

氚是產(chǎn)生輕核聚變反應(yīng)的重要核素之一，也是造成放射性工作人員內(nèi)污染的主要核素之一[1]。氚和其它主要放射性核素相比，雖然毒性較低，國際放射防護委員會(ICRP) 把它定為低毒類放射性核素[2]，但是，氚與氫的化學(xué)性質(zhì)相似，可以通過同位素交換反應(yīng)而進入相應(yīng)的物質(zhì)分子當(dāng)中[3]。在地球上的各種生物圈之中，氚無處不在。核爆炸和核反應(yīng)堆運行也會釋放大量的氚到環(huán)境中，遠(yuǎn)大于天然氚，并在自然界生態(tài)鏈中轉(zhuǎn)移[4-6]。所以，氚對人類健康的影響應(yīng)持續(xù)關(guān)注。

本文介紹了氚的毒理學(xué)特性，以及氚水對哺乳動物、細(xì)胞系及人離體細(xì)胞的輻射損傷導(dǎo)致的微核和染色體畸變的研究進展。

1 氚的毒理學(xué)特性

氚是氫的放射性同位素，氚通過β粒子衰變轉(zhuǎn)變?yōu)榉€(wěn)定的氦同位素，發(fā)射平均能量為5.7 keV的低能電子以及反中微子粒子。最大能量18.6 keV，半衰期為12.3 a。氚發(fā)射的β粒子的路徑長度僅為0.6 μm，小于細(xì)胞核直徑[7]。由于射程短，氚不易對人體產(chǎn)生外照射危害，但由于較長的半衰期及較高的同位素交換率和氧化率，進入機體后會對人體組織和器官造成內(nèi)照射危害。因此，如果氚通過飲用水或食物攝入，或通過皮膚吸入或吸收進入人體，就會對機體健康產(chǎn)生危害，氚在細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生電離，引起細(xì)胞單鏈斷裂，導(dǎo)致基因突變[8]。作為氫的同位素，氚容易形成水分子，因此在環(huán)境中非常易于移動，并且結(jié)合到有機分子中以形成有機結(jié)合的氚(OBT)[9]。理論和實驗研究表明，氚β粒子在DNA中產(chǎn)生雙鏈斷裂(DSBs)特別有效，包括復(fù)雜的DSB[10-13]被認(rèn)為是最有害的DNA損傷類型，如果留下未修復(fù)或不正確修復(fù)，可能導(dǎo)致染色體損傷，基因組不穩(wěn)定和癌癥[14-16]。

環(huán)境中的氚主要來自于天然氚和人工氚，并以氚氣(HT)、氚水(HTO)和有機結(jié)合氚(OBT)化學(xué)態(tài)存在。另外，核電站、核爆炸和核反應(yīng)堆運行也會釋放大量的氚到環(huán)境中，且遠(yuǎn)大于天然氚，排放到環(huán)境中的氚可與氫交換，隨氫的循環(huán)在不同環(huán)境介質(zhì)和生物體內(nèi)遷移轉(zhuǎn)化[17-20]。

2 氚誘發(fā)體內(nèi)細(xì)胞染色體畸變的研究

2.1 氚誘發(fā)小鼠染色體畸變研究

輻射誘發(fā)的哺乳類生殖細(xì)胞遺傳損傷中，染色體畸變是最主要的指標(biāo)之一，在各類畸變中,相互易位型畸變更具危險性。它們能傳遞到子代，進而導(dǎo)致后代的許多嚴(yán)重遺傳疾患。

姜濤等[21]通過觀察初級精母細(xì)胞D-MI中的多價體探討氚水誘發(fā)精原細(xì)胞染色體易位的劑量-效應(yīng)關(guān)系。采用小鼠一次腹腔注射法，氚水注入量分別為3.22×102、6.44×102、11.06×102、21.76×102和31.23×102kBq/g, 小鼠睪丸組織65天累積吸收劑量分別為 0.070、0.140、0.242、0.476和0.684 Gy。中毒后65天處死小鼠。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，易位率隨氚水劑量的增加而升高, 劑量-效應(yīng)關(guān)系可擬合為直線方程Y=0.581+0.0366X。 精原細(xì)胞易位產(chǎn)物主要為D-MI中的鏈狀四價體,占總畸變的77.8%；其次為鏈狀六價體、鏈狀三價體加單價體,分別占總畸變的11.1%和9.7%；環(huán)狀四價體最少,僅占1.4%。在嚙齒類動物中,由于生殖細(xì)胞在進行減數(shù)分裂時染色體在一條或多條臂間發(fā)生交叉的頻率比較低,所以易位染色體形成環(huán)狀多價體的可能性小于鏈狀多價體。精原細(xì)胞染色體相互易位率隨氚水劑量的增加而升高。小劑量范圍內(nèi),劑量-效應(yīng)關(guān)系表現(xiàn)為線性無閾的模式。生殖腺是輻射誘發(fā)基因突變和染色體畸變而引起遺傳性缺陷所涉及到的很敏感組織。

Brooks等[22]給BNL小鼠飲用3×3.7×104Bq/mL氚水90～700 d，并在不同時間點取部分肝組織，觀察肝細(xì)胞染色體畸變情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在330 d或500 d時，小鼠染色體損傷明顯增加。

崔鳳梅等[23]探討氚水染毒后小鼠外周血白細(xì)胞總數(shù)和骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率的改變。小鼠腹腔單次注入氚水分別為1.85×105、5.55×105和16.65×105Bq/g，10 d后處死，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著氚水初始注入量的增加，累積劑量也增加，骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率相應(yīng)增大，與對照組比較，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。小鼠腹腔單次注入5.55×105Bq/mL/g的氚水，分別于2、4、6、10和28 d處死小鼠，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，氚水初始注入量相同，隨注入后時間延長，累積劑量增大，骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率持續(xù)增加，與對照組比較，自第4 d起差異均有統(tǒng)計學(xué)意義。給小鼠腹腔注入不同初始量的氚水, 2、4、6、10和28 d眼球摘除取血,處死后取兩側(cè)股骨,并計數(shù)外周血白細(xì)胞總數(shù)和骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率。結(jié)果表明，骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核率不僅隨氚水初始注入量的增大而增高，而且還隨注入后時間的延長而增高，直到第28天仍未恢復(fù)到對照組水平。結(jié)果說明，氚水引起內(nèi)照射損傷時，骨髓嗜多染紅細(xì)胞微核可作為一個早期輻射損傷的靈敏指標(biāo)，但仍然需要積累更多的劑量和時間分級的檢測結(jié)果來估算其劑量-效應(yīng)關(guān)系和時間-效應(yīng)關(guān)系。

陳德清等[24]研究發(fā)現(xiàn)，小劑量HTO(氚水)進入體內(nèi)能引起機體細(xì)胞產(chǎn)生對較大劑量電離輻射的適應(yīng)性反應(yīng)。小鼠腹腔注射3.7×102～3.7×105Bq/g HTO作為適應(yīng)劑量，隨后60Co γ射線全身照射1.5 Gy作為激發(fā)劑量，結(jié)果觀察到3.7×103Bq/g組誘發(fā)的適應(yīng)性反應(yīng)最明顯，同時在1～5 d內(nèi)照射激發(fā)劑量1.5 Gy均可觀察到適應(yīng)性反應(yīng)，以第5 d最為顯著，觀察值相當(dāng)于預(yù)期值的50%。如果以適應(yīng)性反應(yīng)指數(shù)表示,激發(fā)劑量照射后24 h達(dá)最大值0.52。一次腹腔注射小劑量 HTO, 可引起小鼠骨髓細(xì)胞對隨后一個較大劑量γ射線照射誘發(fā)的染色單體畸變率顯著地低于預(yù)期值。

Ikuohima等[25]給 Hale toner SBrookhaven系小鼠飲用氚水 3×3.7×104Bq/mL，在之后的28～261天多次采集骨髓，制片，觀察細(xì)胞增殖動力學(xué)和姐妹染色單體互換數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，81、163、192、247 和261天時姐妹染色單體互換數(shù)均有增加，并且隨飲用氚水時間的延長而呈直線上升，與對照組相比差異顯著。氚水也能使姐妹染色單體互換率(SCE)增加。

Roch-Lefevri等[26]對長期暴露于低劑量氚β粒子輻射的小鼠的細(xì)胞遺傳學(xué)損傷進行分析，并將這些效應(yīng)與等劑量γ射線照射產(chǎn)生的效應(yīng)進行比較。給小鼠飲用水中加入氚化水(HTO)或有機結(jié)合的氚(OBT),HTO吸收劑量分別為0.009、0.9、18.3、0.0083、8.3、166 mGy；OBT吸收劑量分別為0.008、0.97、21.7、0.088、8.95、181.3 mGy。計算經(jīng)氚作用后產(chǎn)生的β粒子的劑量率，并進行相同劑量全身外部γ照射，劑量率1.44 μGy/h和31 μGy/h，持續(xù)1或8個月。檢測了骨髓和外周血淋巴細(xì)胞中的細(xì)胞遺傳學(xué)損傷，以及其相對生物學(xué)效應(yīng)(RBE)。氚和γ射線照射均未在骨髓中產(chǎn)生遺傳毒性作用。

2.2 氚誘發(fā)大鼠染色體畸變

郭月鳳等[27]給Wistar大鼠在妊娠第11 d單次腹腔注射適當(dāng)濃度的氚水，大鼠體水氚的濃度分別為0.037、0.555和5.55 MBq/mL，8月齡仔鼠吸收劑量分別為0.012、0.189和1.89 Gy。檢查各組8月齡仔鼠心臟血淋巴細(xì)胞染色體畸變。結(jié)果表明，各受照組仔鼠淋巴細(xì)胞染色體型畸變率、總畸變率、畸變細(xì)胞率都顯著高于對照組；0.189和1.89 Gy兩個劑量組間總畸變率、畸變細(xì)胞率差異顯著。

鄒淑愛等[28]使用40天齡SD大鼠，設(shè)2個實驗組，自由飲用4.8×105Bq/mL和2.22×105Bq/mL濃度的氚水，對照組動物飲用自來水，直至自然死亡。取股骨骨髓涂片，計數(shù)嗜多染紅細(xì)胞中的微核細(xì)胞率；取瀕死狀態(tài)的大鼠心臟血2～3 mL進行淋巴細(xì)胞培養(yǎng)，統(tǒng)計染色體畸變率。結(jié)果表明，平均微核細(xì)胞率高劑量組和低劑量組分別為(8.3±2.12)%和(4.95±1.85)%，對照組為(1.2±0.48)%，兩劑量組間及兩劑量組與對照組間差異顯著。染色體觀察結(jié)果表明，高劑量組和低劑量組分別為23.27%、4.96%，對照組為1.8%，兩劑量組間及兩劑量組與對照組間差異顯著。并見到在一個細(xì)胞中染色體可有多個畸變。與骨髓嗜多染紅細(xì)胞中的微核細(xì)胞率相比，心臟血淋巴細(xì)胞的染色體畸變率更高, 說明染色體對氚水更敏感。

3 氚誘發(fā)離體細(xì)胞染色體畸變的研究

3.1 細(xì)胞系

鄒淑愛等[28]以中國倉鼠肺細(xì)胞克隆亞系 CHL-1作為實驗用細(xì)胞，觀察不同劑量的氚水誘發(fā)的CHL-1 細(xì)胞染色體畸變。把氚水加至細(xì)胞培養(yǎng)液中，細(xì)胞的輻射吸收劑量分別為0.022、0.044、0.088、0.176、0.264、0.44 Gy, 結(jié)果觀察到主要是染色體型的畸變, 畸變細(xì)胞數(shù)及斷裂數(shù)與劑量呈線性關(guān)系，Y畸變細(xì)胞數(shù)=4.4×10-2+1.2×10-2D，r=0.9746；Y斷裂數(shù)=3.2×10-2+3.1×10-2D，r=0.9964。該實驗同時用60Co γ射線誘發(fā)細(xì)胞染色體畸變作為對比效應(yīng)，以CHL-1細(xì)胞的畸變細(xì)胞數(shù)和斷裂數(shù)為生物終點時，氚水相對于60Co γ射線的相對生物效應(yīng)分別為1.3和6.2。

3.2 人外周血染色體畸變

鄧冰等[29]研究低劑量水平下氚水β射線的生物效應(yīng)，將人體外周血分別與不同濃度的氚水(0.1～100 μL)混合，對照組加入同體積的0.9%的NaCl溶液，氚水活度4.65×108Bq/mL，劑量率0.024～1.230 mGy/min, 劑量范圍0～1.8 Gy。分別培養(yǎng)24、48、72 h后收獲細(xì)胞，計數(shù)染色體雙著絲粒體，得到與氚水作用后染色體畸變的頻率，以60Co γ射線照射后的細(xì)胞效應(yīng)作為參照，得到相同劑量下氚水的相對生物效應(yīng)值。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在劑量率一定時，隨吸收劑量增加，各劑量點的雙著絲粒體/細(xì)胞增加；在低劑量作用下，β射線誘發(fā)染色體畸變的能力比同劑量γ射線強。

張連珍等[30]研究發(fā)現(xiàn)，氚水β射線誘發(fā)人淋巴細(xì)胞染色體畸變研究中的氚水濃度為1.85×105Bq/mL，劑量率為0.00931 Gy/min，在37 ℃下照射不同時間，得到照射不同劑量的實驗樣品，其劑量范圍為0～0.465 Gy。同時進行60Co γ射線平行實驗，劑量率為0.01 Gy/min，細(xì)胞的吸收劑量范圍為0～0.5 Gy。結(jié)果表明，氚β射線和60Co γ射線照射G0期人淋巴細(xì)胞誘發(fā)染色體畸變的劑量-效應(yīng)關(guān)系均宜擬合為Y=a+bD模式，相關(guān)系數(shù)分別為0.9918和0.9257。以60Co γ射線為參考輻射,以淋巴細(xì)胞染色體畸變?yōu)樯锝K點, 測得氚的RBE值為2。

張秀珍等[31]研究報道，將人全血0.2 mL加入3.8 mL培養(yǎng)液中培養(yǎng)24 h，再加入不同濃度的3H-TdR和HTO，同時加入秋水仙素，繼續(xù)培養(yǎng)到52～54 h收集，觀察S 期、G2期淋巴細(xì)胞染色體單體型畸變。結(jié)果表明，每個細(xì)胞中染色單體斷裂隨劑量呈線性增加，染色體畸變的劑量-效應(yīng)關(guān)系適宜以Y=aD+bD2表示。以60Co γ射線為參考輻射，HTO誘發(fā)人淋巴細(xì)胞雙著絲粒體加著絲粒環(huán)的RBE值隨β射線劑量的增加而降低，范圍為1.4～2.6。

Hori等[32]把3H-TdR(10-3～102)×3.7×104Bq/mL和HTO (10-3～102)×3.7×104Bq/mL加入人淋巴細(xì)胞的培養(yǎng)液中培養(yǎng)48 h。結(jié)果表明，兩者都可以使細(xì)胞的染色體發(fā)生畸變，而且畸變率與劑量相關(guān)。在高劑量時，畸變隨劑量呈直線增加，但在低劑量時，明顯高于所預(yù)測得的直線關(guān)系。

Prosser[33]做了相似的實驗，并與250 kV X射線作了比較，測得的RBE值為1.13±0.18。若將大劑量70×3.7×107Bq/mL并作用20～150 min，使劑量達(dá)0.25～7 Gy，所得的結(jié)果包括細(xì)胞損傷率、有著絲點的環(huán)、無著絲點環(huán)和雙著絲點的出現(xiàn)率都與劑量呈正相關(guān)。與X射線所致人淋巴細(xì)胞色體畸變數(shù)相比,在0.25 Gy時RBE2.6，劑量增大此值下降[34]。

Bocian等[35]研究了氚水或180 kV X射線對人外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變的誘導(dǎo)作用。將淋巴細(xì)胞經(jīng)不同濃度的HTO照射2 h或53 h。用植物血凝素刺激后的第一次有絲分裂期間對染色體和染色單體型畸變進行分析。結(jié)果表明，淋巴細(xì)胞經(jīng)氚β射線和X射線照射后，雙著絲粒+中心環(huán)、末端+間質(zhì)缺失最適合線性二次函數(shù)。然而，暴露于HTO 53 h后這些類型的畸變數(shù)據(jù)給出了線性和線性二次函數(shù)的同樣良好的擬合。線性模型給出了染色單體畸變的劑量-效應(yīng)關(guān)系的曲線。在研究中發(fā)現(xiàn)與180 kV X射線相比，氚β射線的RBE為1.17±0.02。

Snigireva等[36]用人外周血淋巴細(xì)胞染色體畸變來評估氚的相對生物學(xué)效應(yīng)，人外周血淋巴細(xì)胞經(jīng)γ射線和氚β射線照射后，分析了外周血淋巴細(xì)胞中非穩(wěn)定染色體畸變頻率，并與60Co γ射線照射相比。結(jié)果表明，氚β輻射的RBE在最小劑量下確定為2.2，在1 Gy下降至1.25。比較兩組專業(yè)核工作者(Sarov鎮(zhèn))在遠(yuǎn)程接觸慢性氚β和γ輻射時穩(wěn)定染色體畸變率，證明氚β輻射RBE為2.5。

3.3 人類離體精子染色體畸變

Kamiguchi等[37]使用人類精子和倉鼠卵母細(xì)胞的種間體外受精，研究了氚β射線對人類離體精子染色體的影響。用含有1.53～24.3 mCi/mL HTO的培養(yǎng)基處理精液樣品約80 min。來自對照的1 290個精子和來自受照射組的1 842個精子進行核型分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，染色體畸變的精子發(fā)生率隨著劑量的增加呈線性增加；斷裂型畸變的發(fā)生頻率遠(yuǎn)高于易位；染色體型畸變的出現(xiàn)頻率遠(yuǎn)高于染色單體型。所有這些類型的畸變都表現(xiàn)出線性劑量依賴性增加。計算HTO β射線相對于X射線的RBE值，當(dāng)吸收劑量估計為最小值時，RBE值介于1.89至3.00之間；當(dāng)吸收劑量估計為最大值時，RBE值介于1.04和1.65之間。

4 事故的劑量重建

Lioyd等[38]通過熒光原位雜交(FISH)技術(shù)對一名11年前因事故攝入氚水的病例進行的染色體易位分析。比較此方法與先前由尿液分析和雙著絲粒染色體估算的劑量進行比較。

兩個實驗室共享血液淋巴細(xì)胞，每個實驗室使用不同的染色體探針組合進行FISH分析。通過參考其中一個實驗室建立的離體標(biāo)準(zhǔn)刻度曲線進行劑量估算。兩個實驗室測得的易位率非常一致。將易位率與事故后不久獲得的雙著絲粒頻率進行比較，并且在暴露后6年測量的易位率顯示所有測量之間有良好一致性，并且不會隨時間的延長而有很大的變化。表明該個體在11年內(nèi)易位是相當(dāng)穩(wěn)定的。用FISH方法測定經(jīng)氚水照射后，對染色體易位率進行回顧性的劑量重建。結(jié)果顯示，與初始雙著絲粒分析和尿中氚測量估計的劑量一致。由于對接受均勻全身照射的個體進行了廣泛的初始劑量測定，該病例是使用FISH測量易位率用于回顧性生物劑量的極好例證。

5 結(jié)語

氚水可以滲入細(xì)胞及細(xì)胞核內(nèi)，照射處于各期的細(xì)胞，可產(chǎn)生染色體型畸變及染色單體型畸變。還參與DNA分子結(jié)構(gòu)的構(gòu)建，氚極易經(jīng)呼吸、飲水、飲食及皮膚途徑進入人體[39]并與細(xì)胞中的 DNA和RNA結(jié)合，直接產(chǎn)生輻照作用，并可誘發(fā)染色體畸變。DNA 對電離輻射非常敏感[40]，氚水中的氚易于與DNA 結(jié)合，從而導(dǎo)致生物體分子遺傳毒性[41,42]。同時HTO在衰變過程中除了射線輻射作用外，3H衰變時產(chǎn)生的作用，會在衰變地址留下一個具有3He原子的分子，依賴于3He原子所在分子及其在分子中的具體位置，畸變可能比粒子的電離輻射更加危險[43]。

分析外周血淋巴細(xì)胞染色體異常在電離輻射領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用，可作為“生物劑量計”估算事故情況下受照人員的輻射劑量，同時也是評價輻射遠(yuǎn)后效應(yīng)的重要指標(biāo)，在輻射致癌和遺傳效應(yīng)與染色體損傷關(guān)系方面有著重要的意義。隨著核電的大力發(fā)展，氚向環(huán)境中排放量不斷增加，氚對人類健康的影響越來越重要。對氚的生物學(xué)效應(yīng)開展更深入的研究，結(jié)合分子生物學(xué)等有效的的手段，從分子水平加以研究，更全面和客觀了解氚的生物學(xué)效應(yīng)，為輻射防護提供數(shù)據(jù)支撐。