黃瓜體細(xì)胞胚途徑再生體系的建立及優(yōu)化

馮 琴 魏文霞 董翔宇 張婷婷 楊玉婷 陳書霞

（西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院，陜西楊凌 712100）

黃瓜（Cucumis sativus L.）作為設(shè)施蔬菜栽培中常見種類，在生產(chǎn)過程中常受到各種病蟲害及連作障礙的困擾（朱宗源 等，2000；楊建霞，2005），導(dǎo)致產(chǎn)量和品質(zhì)受到嚴(yán)重影響（賀麗娜 等，2008；何莉莉 等，2010）。由于黃瓜遺傳基礎(chǔ)狹窄（Staub et al.，2005；張圣平 等，2010；聞小霞 等，2014），傳統(tǒng)的常規(guī)育種存在轉(zhuǎn)育效率低、育種周期長且可利用的抗性資源少的問題（劉麗英 等，2006；許娜和儲俊，2008；段莉莉 等，2018），重要農(nóng)藝性狀基因的功能驗證與快速轉(zhuǎn)育也面臨著巨大的挑戰(zhàn)。因此，利用基因工程技術(shù)進(jìn)行種質(zhì)改良不失為一條有效途徑（王燁 等，2014），同時也為近年來大量發(fā)掘與克隆的重要基因功能解析奠定了堅實的基礎(chǔ)。

自2006年以來，研究者對黃瓜的組織培養(yǎng)和遺傳轉(zhuǎn)化進(jìn)行了很多探索（李建欣，2006；張圣平 等，2010；黃東梅 等，2012；李蕾 等，2015）。在組織培養(yǎng)方面，主要通過原生質(zhì)體途徑、體細(xì)胞胚途徑和離體器官再生途徑進(jìn)行黃瓜再生體系的探索（陳繼峰，2007），主要是針對基因型（劉艷，2016）、苗齡（Kantharajah & Dodd，1990；張興國和劉佩瑛，1998）、外植體前處理（李艷華，2016）、外植體類型（Colijn-Hooymans et al.，1994；劉玉霞 等，2014）、激素種類和濃度（Punja et al.，1990）對誘導(dǎo)黃瓜植株再生的因素進(jìn)行了探究，但在黃瓜的遺傳轉(zhuǎn)化效率上，依舊存在轉(zhuǎn)化率低、假陽性高、嵌合體多等方面的問題（黃東梅 等，2012；安亞偉，2013；李勝男，2016；段莉莉 等，2018；秦智偉 等，2018；趙子瑤，2018）。雖然一些研究者在黃瓜單倍體誘導(dǎo)方面進(jìn)行了探索，但再生頻率沒有明顯提高（張圣平 等，2010；王燁 等，2015）。因此，在器官再生基礎(chǔ)上發(fā)展起來的黃瓜轉(zhuǎn)基因技術(shù)不夠完善，轉(zhuǎn)化效率普遍較低，當(dāng)前進(jìn)行基因功能的遺傳轉(zhuǎn)化研究還遠(yuǎn)遠(yuǎn)不夠。

利用體細(xì)胞胚發(fā)生途徑進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化具有很多優(yōu)點，體細(xì)胞胚具有與合子胚相似的結(jié)構(gòu)，繁殖速度快且易接受外源DNA的插入（胡適宜，1982），并且一個成熟的體細(xì)胞再生體系通常具有很高的再生效率。因此能否通過體細(xì)胞胚發(fā)生途徑建立一種高頻的再生體系，提高黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化效率是關(guān)系到黃瓜外源基因能否高效導(dǎo)入的重要技術(shù)問題，也是對大量挖掘到的重要農(nóng)藝性狀基因進(jìn)行功能驗證的主要途徑。黃瓜體細(xì)胞胚發(fā)生受基因型、外植體類型和激素濃度等因素的影響（Cade et al.，1990；余陽俊和朱其杰，1992；Kim et al.，2008），盡管高濃度的2，4-D能夠促使胚性愈傷的形成，子葉節(jié)被認(rèn)為是最佳外植體，但體細(xì)胞胚的誘導(dǎo)受基因型的影響非常顯著（Kuijpers et al.，1996；楊愛馥 等，2003；魏文霞 等，2019），目前僅限部分基因型可以誘導(dǎo)。本試驗擬通過對4個不同基因型黃瓜種質(zhì)、不同外植體類型和培養(yǎng)基激素組成進(jìn)行篩選，建立黃瓜體細(xì)胞胚再生體系并進(jìn)行優(yōu)化，為進(jìn)一步的黃瓜遺傳轉(zhuǎn)化研究提供技術(shù)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗所用的黃瓜種質(zhì)華北型8681和DB、華南型D4和9101均為西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院黃瓜課題組保存的高代自交系材料。試驗于2016年10月至2017年12月在西北農(nóng)林科技大學(xué)園藝學(xué)院公共實驗平臺進(jìn)行。

1.2 試驗方法

1.2.1 無菌苗的獲得 挑選飽滿的黃瓜種子，流水沖洗后，在超凈工作臺中，首先用75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗3～4次，然后再用5% NaClO消毒10 min，無菌水沖洗3～4次，最后浸泡4 h，無菌濾紙吸干表面水分，接種到MS培養(yǎng)基上，置于培養(yǎng)室中，培養(yǎng)室溫度22 ℃，光照條件1 200 μmol·m-2·s-1，光照時間 16 h·d-1。

1.2.2 不同外植體的獲得 子葉節(jié)：培養(yǎng)無菌苗生長至子葉展開，用無菌手術(shù)刀切除下胚軸及其以下部位，切除2/3子葉遠(yuǎn)端部分，獲得子葉節(jié)外植體。子葉：將子葉切成靠近葉柄的近生長點段（占子葉的1/3）、中間段（占子葉的1/3）和子葉尖端（占子葉的1/3）。下胚軸：切除黃瓜無菌苗的子葉和根部，將下胚軸切成1 cm左右的小段，每株苗可獲得2個外植體。

1.2.3 激素組合 激素組合見表1，其中A、B、C分 別 代 表 2，4-二 氯 苯 氧 乙 酸（2，4-Dichlorophenoxyacetic acid，2，4-D）、N6- 呋 喃甲基腺嘌呤（kinetin，KT）和6-芐氨基腺嘌呤（6-benzylaminopurine，6-BA）的濃度，與編號對應(yīng)的是濃度，如A1表示2，4-D的濃度為0 mg·L-1，B2表示KT濃度為0.1 mg·L-1，A1B2激素組合表示在培養(yǎng)基中添加的2，4-D濃度為0 mg·L-1，KT濃度為0.1 mg·L-1。對不同基因型黃瓜進(jìn)行愈傷組織和體細(xì)胞胚誘導(dǎo)時僅使用A和B的激素組合。

1.2.4 愈傷組織的誘導(dǎo) 愈傷組織誘導(dǎo)的基礎(chǔ)培養(yǎng)基為MS培養(yǎng)基，添加不同濃度的2，4-D（A）、KT（B） 和 6-BA（C）， 蔗 糖 30 g·L-1， 瓊 脂 7 g·L-1，調(diào)節(jié)pH至5.8，高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌21 min。將外植體背面朝下，接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基，每瓶含6個外植體，每個處理3次重復(fù)。培養(yǎng)21 d后統(tǒng)計愈傷組織的產(chǎn)生情況（愈傷組織誘導(dǎo)率=長出愈傷的外植體數(shù)/總外植體數(shù)×100%）并記錄。培養(yǎng)溫度22 ℃，光照強度為1 200 μmol·m-2·s-1，光照時間16 h·d-1。暗培養(yǎng)處理是以子葉節(jié)為外植體，在誘導(dǎo)起始階段進(jìn)行7 d的黑暗處理，接著進(jìn)行光照培養(yǎng)，光照時間16 h·d-1，以誘導(dǎo)培養(yǎng)基上一直進(jìn)行光照培養(yǎng)的子葉節(jié)為對照。

表1 培養(yǎng)基的不同激素處理及編號 mg·L-1

1.2.5 胚狀體的誘導(dǎo) 分化培養(yǎng)基為MS基礎(chǔ)培養(yǎng)基，添加不同濃度的2，4-D、KT和6-BA，蔗糖30 g·L-1，瓊脂7 g·L-1，調(diào)節(jié)pH至5.8，高壓蒸汽滅菌鍋中121 ℃滅菌21 min。將產(chǎn)生的愈傷組織接種至分化培養(yǎng)基中，每瓶6塊，培養(yǎng)20～35 d后統(tǒng)計出胚率（出胚率=出胚愈傷塊數(shù)/總愈傷塊數(shù)×100%）并記錄。

1.2.6 體細(xì)胞胚的細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察 將在分化培養(yǎng)基中形成的胚性愈傷組織，取不同發(fā)育時期的體細(xì)胞胚置于含MS培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中，用體視熒光顯微鏡（MZ10F，徠卡，德國）進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察。

1.2.7 體細(xì)胞胚植株再生及煉苗移栽 將成熟的胚轉(zhuǎn)移至MS培養(yǎng)基上，培養(yǎng)至萌發(fā)成具有生長點的正常小植株時，逐漸打開瓶口，7 d后移栽至基質(zhì)中。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同基因型對愈傷組織誘導(dǎo)率和出胚率的影響

將子葉節(jié)接種在愈傷誘導(dǎo)培養(yǎng)基7 d后，可見外植體上切口處有愈傷形成，隨著時間的增加愈傷組織也明顯增加。但不同基因型對愈傷組織的誘導(dǎo)率不同。4種基因型中，8681和DB的愈傷誘導(dǎo)率分別在27.78%～100.00%及22.22%～94.44%之間（表2）。而D4和9101的愈傷誘導(dǎo)率較穩(wěn)定，平均誘導(dǎo)率分別為73.61%和80.83%；其中，9101的愈傷誘導(dǎo)率較高，且誘導(dǎo)的愈傷松散、質(zhì)地疏松，顏色嫩黃色。

將愈傷組織接種至分化培養(yǎng)基中，14 d后可萌發(fā)出胚，在此階段4種基因型的出胚率差異明顯（表3）。在分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)14 d，未觀察到8681和DB有胚出現(xiàn)，D4和9101形成了一定數(shù)量的胚。9101形成的體細(xì)胞胚較正常，出胚率較高。而D4出胚率低，畸形胚較多。因此，后續(xù)試驗皆以9101種質(zhì)為試驗材料。

表2 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中不同基因型對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

表3 分化培養(yǎng)基中不同基因型對出胚率的影響

2.2 不同激素配比對愈傷組織誘導(dǎo)率和出胚率的影響

生長素和細(xì)胞分裂素對黃瓜愈傷組織的誘導(dǎo)和胚狀體的產(chǎn)生都具有一定的影響。將外植體接種至誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，7 d左右可見外植體膨大，且在切口處有愈傷形成。由表4可以看出，添加2，4-D與不同濃度的KT和6-BA都能夠誘導(dǎo)愈傷組織形成，2，4-D濃度較低時愈傷數(shù)量較少，伴有不定根產(chǎn)生，隨著濃度的增加其愈傷組織形成的數(shù)量越多，2，4-D 濃度為 1.50 mg·L-1或 2.00 mg·L-1時愈傷誘導(dǎo)率分別達(dá)97.92%和100.00%，并且形成的嫩黃色愈傷組織質(zhì)地疏松，量較多。添加KT或6-BA后愈傷誘導(dǎo)率呈降低趨勢，特別是添加6-BA的培養(yǎng)基中愈傷組織的形成受到了一定的抑制。因此添加濃度為1.50 mg·L-1或2.00 mg·L-12，4-D的MS培養(yǎng)基為較適宜的誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

表4 誘導(dǎo)培養(yǎng)基中不同激素濃度對愈傷組織誘導(dǎo)率的影響

將胚性愈傷組織轉(zhuǎn)至分化培養(yǎng)基，約14 d可觀察到萌發(fā)的成簇狀胚狀體，不同濃度激素的培養(yǎng)基出胚率差異較大，總的看來，添加KT的2，4-D培養(yǎng)基都能誘導(dǎo)出胚。雖然大部分添加6-BA的2，4-D培養(yǎng)基也能夠誘導(dǎo)出胚，但發(fā)育成正常苗的數(shù)量較少，得到的植株大多為畸形苗（表5）。在添加0.10 mg·L-12，4-D和0.5 mg·L-1KT的分化培養(yǎng)基中出胚率可達(dá)33.33%，且獲得正常植株12株，明顯高于其他激素組合。因此，9101較適宜的出胚培養(yǎng)基為MS+0.10 mg·L-12，4-D + 0.5 mg·L-1KT。

2.3 暗培養(yǎng)對愈傷組織誘導(dǎo)率和出胚率的影響

以子葉節(jié)為外植體，暗培養(yǎng)的處理中愈傷組織誘導(dǎo)率為94.44%，遠(yuǎn)高于光照處理。暗培養(yǎng)條件下誘導(dǎo)出的愈傷質(zhì)地更為疏松，呈顆粒狀（表6）。將暗培養(yǎng)誘導(dǎo)出的愈傷組織轉(zhuǎn)接到分化培養(yǎng)基后，其出胚率也高于光照下的25.71%，達(dá)36.47%。由暗培養(yǎng)誘導(dǎo)的愈傷而獲得的正常植株數(shù)量也較光照下的多了1倍多。因此，愈傷組織誘導(dǎo)階段暗培養(yǎng)對于出胚和正常植株的形成較為有利。

2.4 不同外植體對愈傷組織誘導(dǎo)率及出胚率的影響

將外植體放入含2.00 mg·L-12，4-D的誘導(dǎo)培養(yǎng)基中，黃瓜幼苗不同外植體的愈傷組織誘導(dǎo)率不同，愈傷的生長狀態(tài)也不同，且影響到胚的正常萌發(fā)。由子葉節(jié)誘導(dǎo)的愈傷組織質(zhì)地更疏松，且多為顆粒狀，由近生長點段子葉、中間段子葉和子葉尖端誘導(dǎo)而得到的愈傷組織結(jié)構(gòu)更為緊致（表7）。子葉節(jié)和子葉尖端都能夠形成大量的愈傷組織，后者雖能出少量胚，但大多畸形，不具有正常成苗能力，而由子葉節(jié)誘導(dǎo)而來的愈傷組織更容易在分化培養(yǎng)基中出胚，并形成正常植株。

表5 分化培養(yǎng)基中不同激素濃度對出胚率的影響

2.5 胚狀體發(fā)育及植株再生

從圖1可明顯看出，黃瓜胚狀體形成和發(fā)育過程包含球形胚（A）、心形胚（B）、魚雷形胚（C）和子葉胚（D）4個時期。后期（E、F）子葉和胚根分化出來。與母體分離且結(jié)構(gòu)完整的胚狀體發(fā)育為成熟胚，萌發(fā)成苗，最終獲得完整植株。以黃瓜子葉節(jié)為外植體的胚狀體發(fā)育及植株再生過程見圖2。

圖1 9101子葉節(jié)所出胚狀體的不同生長階段

圖2 華南型黃瓜9101的植株再生過程

表6 光暗條件對9101愈傷組織誘導(dǎo)率和出胚率的影響

表7 不同外植體部位對9101愈傷組織誘導(dǎo)率和出胚率的影響

3 結(jié)論與討論

3.1 不同基因型對體細(xì)胞胚形成的影響

植物體細(xì)胞胚的形成和發(fā)育易受到基因型、激素水平、暗條件等因素的影響。同一科屬的不同植物體材料其成胚的能力也不同（袁澍 等，2003），Oláh等（2009）對59種基因型的葡萄材料進(jìn)行誘導(dǎo)，有29種無法通過體細(xì)胞胚途徑完成再生。楊愛馥等（2003）用3種不同的黃瓜種質(zhì)葉三旱、長春密刺和老來少誘導(dǎo)體細(xì)胞胚，只有華南型黃瓜葉三旱誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚。本試驗選用了4種基因型黃瓜種質(zhì)，僅華南型黃瓜9101和D4能成功誘導(dǎo)出胚狀體，這也說明了基因型差異是影響胚狀體形成和發(fā)育的重要因素。此外，張若緯等（2009）比較了8種類型的黃瓜自交系材料再生頻率的差異，發(fā)現(xiàn)華南型黃瓜品種四川白瓜再生頻率高于華北型黃瓜，黃瓜體細(xì)胞成胚及再生能力可能與不同生態(tài)型種質(zhì)有關(guān)，華南型黃瓜是體細(xì)胞胚發(fā)生較為理想的材料。

3.2 不同培養(yǎng)條件對體細(xì)胞胚形成的影響

有研究認(rèn)為培養(yǎng)初期的暗培養(yǎng)處理有利于黃瓜子葉節(jié)的分化再生（王燁 等，2011），本試驗也證實了這一點，這可能跟黑暗條件下植物體內(nèi)某些酶的合成有關(guān)。大量的研究表明2，4-D能夠促進(jìn)胚狀體形成（陳小鵬 等，2005；王璐 等，2008），因此在體細(xì)胞胚誘導(dǎo)過程中2，4-D的應(yīng)用較為廣泛。Kuijpers等（1996）研究發(fā)現(xiàn)，在誘導(dǎo)培養(yǎng)初期提高2，4-D的濃度能夠促進(jìn)胚性愈傷組織的形成，在胚狀體形成階段僅需較低的2，4-D濃度即可，在胚狀體發(fā)育階段則不需要2，4-D。本試驗愈傷組織誘導(dǎo)階段，隨著2，4-D濃度的增加其愈傷誘導(dǎo)率也上升，愈傷組織呈嫩黃色，質(zhì)地疏松，生長狀態(tài)較好，添加濃度為2.00 mg·L-12，4-D的培養(yǎng)基愈傷誘導(dǎo)率最高可達(dá)100.00%，而分化培養(yǎng)階段2，4-D濃度在0.15 mg·L-1以下時有利于胚狀體的形成，在未添加激素的普通MS培養(yǎng)基上胚狀體生長發(fā)育，最終形成完整的植株。Masuda等（1995）認(rèn)為，在愈傷組織誘導(dǎo)及胚性細(xì)胞形成的過程中生長素起決定性作用，細(xì)胞分裂素的加入會影響愈傷組織和體細(xì)胞胚的發(fā)生。本試驗中與僅添加2，4-D相比，添加KT 和6-BA的培養(yǎng)基中愈傷誘導(dǎo)率呈下降趨勢。在添加0.10 mg·L-12，4-D和0.5 mg·L-1KT的分化培養(yǎng)基中出胚率可達(dá)33.33%，且獲得正常植株12 株，明顯高于其他激素組合。在含2，4-D的分化培養(yǎng)基中添加6-BA，與添加KT相比，雖然也能夠誘導(dǎo)出胚，但發(fā)育成正常苗的數(shù)量較少，畸形苗居多。

3.3 不同組織部位對體細(xì)胞胚形成的影響

有報道表明，黃瓜子葉（Ziv & Gadasi，1986；Chee，1990）、初生葉（Chee & Tricoli，1988）、未成熟的合子胚（Kim & Janik，1989）、下胚軸（Chee，1990）、原生質(zhì)體（張興國和劉佩瑛，1998）、子葉節(jié)（余陽俊和朱其杰，1992）等外植體均能誘導(dǎo)出體細(xì)胞胚。本試驗中不同類型的外植體出胚率差異較大，子葉節(jié)的出胚率最高，且是唯一獲得正常再生植株的外植體，這種差異可能是由于子葉節(jié)具有某種特殊的細(xì)胞或組織（谷安根和王立軍，1997），能夠在外源激素的刺激下發(fā)生脫分化形成具有胚性的細(xì)胞，進(jìn)而分化成完整植株。因此，子葉節(jié)是愈傷誘導(dǎo)和體細(xì)胞胚形成的最佳外植體。

本試驗成功誘導(dǎo)出了體細(xì)胞胚并萌發(fā)成苗，但不正常胚和畸形苗出現(xiàn)的情況比較嚴(yán)重，這類問題在魏文霞等（2019）的研究中也出現(xiàn)過，可能是由于在愈傷組織誘導(dǎo)或分化培養(yǎng)過程中2，4-D和KT的濃度過高導(dǎo)致的，如何減少不正常胚形成和畸形苗出現(xiàn)的頻率，還有待進(jìn)一步研究。