菜薹乳白色花突變體的遺傳規(guī)律研究及瓣化型細胞質(zhì)不育系的應(yīng)用

張德雙 李佩榮 張鳳蘭 余陽俊 趙岫云 于拴倉 汪維紅 蘇同兵 辛?xí)栽?盧桂香

（北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心，北京 100097）

菜薹〔Brassica campestris L. ssp. chinensis（L.）var. utilis Tsen et Lee〕起源于我國，別名菜心、綠菜薹、廣東菜、菜尖等，是十字花科蕓薹屬蕓薹種白菜亞種中以花薹為產(chǎn)品的變種，為一、二年生草本植物。菜薹的食用器官為花莖和薹葉，薹質(zhì)柔嫩多汁，風(fēng)味獨特，富含纖維素、VC、胡蘿卜素和礦質(zhì)元素，享有蔬菜之冠的美譽。廣州地區(qū)菜薹可實現(xiàn)周年生產(chǎn)供應(yīng)，年栽培面積約16 800 hm2（劉自珠和張華，2016）。近年來，由于市場需求的改變、冷鏈物流和長途運輸?shù)陌l(fā)展，北方的一些地區(qū)利用相對冷涼、雨水較少的生態(tài)條件，如寧夏、河南等地也開始大面積種植菜薹，寧夏地區(qū)的“寧夏菜心”已經(jīng)成為優(yōu)勢品牌，常年栽培面積可達6 000 hm2以上（方智遠，2017）。菜薹的雜種優(yōu)勢利用主要以玻里馬pol CMS、改良的蘿卜胞質(zhì)Ogu CMS和甘藍型油菜CMS96細胞質(zhì)不育系為母本，早優(yōu)1號、早優(yōu)2號、中花雜交菜心、秦薹1號、柳雜1號和柳雜2號等都是利用玻里馬pol CMS育成的菜薹品種；廣州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院利用蘿卜胞質(zhì)Ogu CMS育成2個菜薹一代雜種玉田1號和玉田2號；2018年，北京市農(nóng)林科學(xué)院蔬菜研究中心利用甘藍型油菜CMS96細胞質(zhì)不育系育成18A1、18A2、18A4等菜薹新品系。

菜薹的花瓣顏色是重要的植物學(xué)性狀之一，花色作為指示性狀，可用于純度鑒定或作為遺傳標(biāo)記等育種相關(guān)選擇。但是菜薹的花色比較單一，黃色花為主要花瓣顏色。另外，白色花（張華和劉自珠，1999）和橘紅色花（張德雙 等，2013）也見報道。雖然獲得了白色花和橘紅色花材料，但在已推廣的菜薹品種中還未見白色花和橘紅色花一代雜種的報道。張德雙等（2004）研究表明，大白菜橘紅色花與橘紅心球色的基因完全相同，大白菜橘紅色花與營養(yǎng)成分相關(guān)，VC含量和β-胡蘿卜素含量極顯著高于普通白心大白菜。在菜薹新品種選育中，應(yīng)拓寬不同花色資源，探索不同花色品種和營養(yǎng)品質(zhì)的關(guān)系，以提高菜薹的營養(yǎng)品質(zhì)、豐富菜薹品種類型，進而滿足市民對菜薹品種的多樣性需求。蘿卜胞質(zhì)Ogu CMS是菜薹的主要細胞質(zhì)不育系，但是由于單一細胞質(zhì)可能導(dǎo)致菜薹一代雜種對病害、蟲害的脆弱性，存在對菜薹產(chǎn)業(yè)造成不利影響的隱患，因此應(yīng)重視廣泛引進和創(chuàng)制新型細胞質(zhì)不育源，拓寬不同類型細胞質(zhì)不育系在菜薹雜交優(yōu)勢利用中的應(yīng)用。

本試驗利用菜薹與大白菜雜交、回交，轉(zhuǎn)育菜薹瓣化型細胞質(zhì)不育系。同時，利用在菜薹中發(fā)現(xiàn)的乳白色花色突變體與黃花菜薹雜交，研究乳白色花色的遺傳規(guī)律，并將黃花核心材料轉(zhuǎn)為乳白色花。通過創(chuàng)制和篩選多種瓣化型細胞質(zhì)不育系和乳白色花色菜薹優(yōu)良親本材料，進一步配制菜薹雜交組合，以期選育出乳白色花色、瓣化型細胞質(zhì)不育系、強優(yōu)勢的菜薹一代雜種，更好地豐富市民的“菜籃子”，促進農(nóng)民增收。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試菜薹超級80天菜心（P1）和坡頭70天油青菜心（P2）均為自交6代以上的純合自交系材料，前者的花色為乳白色，葉片顏色淺綠，購于廣東省鶴山市農(nóng)友種子店；后者的花色為黃色，葉片顏色深綠，購于楊偉星種子有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 乳白色花色遺傳 2017年秋季，配制超級80天菜心×坡頭70天油青菜心F1；2018年春季，F(xiàn)1自交獲得F2，F(xiàn)1與雙親分別回交，獲得BC1和BC1′群體，其中 BC1為 F1×P1，BC1′為 F1×P2。8月21日，在大棚內(nèi)采用穴盤育苗方法，播種6世代材料，9月10日定植到大棚中，10月30日開始調(diào)查6個世代全部單株的花瓣顏色，同時記錄各單株花色，并拔除已開花的單株，避免重復(fù)記數(shù)，調(diào)查工作持續(xù)到6個世代全部單株開花、并可以明顯分辨出花色才結(jié)束，研究乳白色花的遺傳規(guī)律。

1.2.2 營養(yǎng)成分含量測定 2018年10月30日，分別取超級80天菜心和坡頭70天油青菜心10～12 cm長菜薹30個，包括花莖和薹葉，3次重復(fù)，送交農(nóng)業(yè)農(nóng)村部種質(zhì)質(zhì)量監(jiān)督檢測中心測定VC、可溶性糖、纖維素、蛋白質(zhì)等營養(yǎng)成分含量。VC含量測定采用2，6-二氯酚靛酚滴定法，可溶性糖含量測定采用蒽酮比色法，纖維素含量測定采用重量法，蛋白質(zhì)含量測定采用凱氏定氮法。試驗數(shù)據(jù)采用卡方χ2和F測驗進行方差分析。

1.2.3 瓣化型細胞質(zhì)CMS不育系的轉(zhuǎn)育 瓣化型細胞質(zhì)CMS不育系來源于大白菜，2017年春季和2018年春季，以坡頭70天油青菜心為父本與大白菜瓣化型細胞質(zhì)CMS連續(xù)回交2代，獲得菜薹瓣化型細胞質(zhì)不育系，定名為18NBCC。2018年8月21日，采用穴盤育苗的方法播種18NBCC，9月10日定植到露地，11月12日取18NBCC分枝花序，在實體解剖鏡下觀察18NBCC蜜腺，并照相。

2 結(jié)果與分析

2.1 菜薹乳白色花的遺傳規(guī)律

從2017年10月30日開始，分別調(diào)查6個世代全部單株的花瓣顏色，因為菜薹開花時間和生長勢等不一致，花色調(diào)查和記錄工作直至11月25日結(jié)束。從彩色圖版1、2可以看出，超級80天菜心的花瓣顏色混雜有部分淺黃色等，因此該品種花色不是純白色，為乳白色，坡頭70天油青菜心的花瓣顏色為黃色。超級80天菜心（P1）×坡頭70天油青菜心（P2）雜交F1的花瓣顏色為黃色，表明乳白色花對黃花的顯隱性關(guān)系為隱性。而F2、BC1和BC1′群體的各單株花色出現(xiàn)了分離（表1）。BC1分離群體的各單株在初花期和盛花期植株生長勢旺盛，葉片大，分枝和花序多，花蕾飽滿，花朵盛開（彩色圖版3、4）；同時，具有乳白色花植株的葉片顏色也不同于親本P1的淺綠色，其顏色比親本P1深。

表1 菜薹乳白色花色6個世代的遺傳分析

進一步對F2、BC1和BC1′群體的各單株花色進行方差分析。在F2群體中，χ2=0.080＜χ20.05=3.841，黃色花與乳白色花植株的分離比例符合3∶1；在BC1群體中，χ2=0.003＜χ20.05=3.841，黃色花與乳白色花植株的分離比例符合1∶1；在BC1′群體中，316株為黃花，14株為乳白色花。表明菜薹黃花對乳白色花為顯性，乳白色花由1對隱性等位基因控制。

但是菜薹乳白色花的遺傳也表現(xiàn)出一定的復(fù)雜性。本試驗中，在F2群體中發(fā)現(xiàn)1株黃花和乳白色花嵌合體，這株嵌合體表現(xiàn)為：同一植株的不同分枝花序的顏色不同，包括4個黃花枝條和4個乳白色花枝條（彩色圖版5）；同一花序的不同花朵顏色不同；同時，在這株上也發(fā)現(xiàn)1朵花的4個花瓣中，2個花瓣為黃色，2個花瓣為乳白色（彩色圖版6）。此外，筆者2018年在引進的菜薹資源材料引心-635中也發(fā)現(xiàn)了1株具有黃花和乳白色花的嵌合體，這株嵌合體表現(xiàn)為：同一植株的不同分枝花序的顏色不同（彩色圖版7），同一花序中出現(xiàn)了不同顏色的花朵（彩色圖版8）。從2011年到現(xiàn)在，筆者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)4份具有黃花和乳白色花的菜薹嵌合體材料。

2.2 2種花色菜薹主要營養(yǎng)成分比較

從表2可以看出，超級80天菜心的蛋白質(zhì)含量極顯著高于坡頭70天油青菜心，可溶性糖含量和纖維素含量顯著高于坡頭70天油青菜心，水分含量和VC含量與坡頭70天油青菜心無顯著差異。

表2 黃花和乳白色花菜薹的主要營養(yǎng)成分比較

2.3 菜薹瓣化型細胞質(zhì)不育系18NBCC的性狀表現(xiàn)

經(jīng)田間性狀比較和實體解剖鏡下觀察，菜薹瓣化型細胞質(zhì)不育系18NBCC的主要性狀表現(xiàn)為：在現(xiàn)蕾期和初花期，花蕾不黃化、不脫落；花瓣為復(fù)花瓣，花藥和花絲嚴(yán)重退化，變成瓣化狀花瓣（彩色圖版9、10），蜜腺正常（彩色圖版11），不育株率和不育度均達到100%。在田間，18NBCC不育系可以吸引蜜蜂訪花，經(jīng)昆蟲輔助授粉后結(jié)實正常。

3 結(jié)論與討論

3.1 菜薹乳白色花的遺傳規(guī)律

花色性狀的遺傳一直是甘藍型油菜（Brassica napus，4n=38，AACC）性狀的研究熱點，一般認為甘藍型油菜的白花基因來源于甘藍C基因組或蘿卜R基因組。戚存扣和傅壽仲（1992）報道，甘藍型油菜白花性狀對黃花呈不完全顯性遺傳，花瓣顏色受1對基因控制。鄧昌蓉等（2014）開展了人工合成甘藍型油菜花色變異后代的遺傳研究。以黃花的大黃油菜（Brassica rapa，2n=20，AA）為母本，白花的中遲芥藍（Brassica oleracea，2n=18，CC）為父本，通過有性雜交共獲得10個人工合成的甘藍型油菜S0單株，其中9株S0單株的花色為白色，而1株（B9）的花色表現(xiàn)為花色嵌合體。進一步以人工合成的甘藍型油菜B9花色嵌合體自交后代的白花及突變的黃花株系為材料，構(gòu)建BC1和F2分離群體，研究花色的遺傳規(guī)律。結(jié)果表明白花突變體的遺傳是由1對不完全顯性基因控制的質(zhì)量性狀，白花（WW）對黃花（ww）表現(xiàn)為不完全顯性。

菜薹的花色以黃色為主，白花對黃花為隱性，由1對等位基因控制（張華和劉自珠，1999）。研究表明，利用菜薹白花材料配制的F1具有較強的雜種優(yōu)勢，株型緊湊、采收期集中、抽薹性比較理想、帶有全套育性恢復(fù)基因，有可能作為父本系材料與不育系配制一代雜種，用于遺傳研究（張華和劉自珠，1999）。菜薹橘紅色花的遺傳規(guī)律與白花一致，橘紅色花對黃花為隱性，由1對等位基因控制（張德雙 等，2013）。本試驗中，在超級80天菜心自交分離后代中發(fā)現(xiàn)1株乳白色花突變體，經(jīng)過自交6代，單株性狀純合穩(wěn)定，花色表現(xiàn)為乳白色，葉色為淺綠色。該菜薹的乳白色花不同于白色花，不是單純的白色，其花色明顯混有淺黃色，因此取名為乳白色。菜薹乳白色花與白花的遺傳規(guī)律相似，乳白色花對黃花為隱性，由1對等位基因控制，但乳白色花的遺傳也表現(xiàn)出一些復(fù)雜性和特殊性。本試驗在501株F2群體中發(fā)現(xiàn)了1株黃花和乳白色花嵌合體。

3.2 同一株菜薹出現(xiàn)乳白色花和黃花分枝花序、同花序的不同花瓣顏色花朵以及同花朵的不同顏色花瓣嵌合體的原因

花色嵌合體是由不同遺傳性狀的細胞共同發(fā)育形成的同一個體或器官，細胞突變是嵌合體形成的基礎(chǔ)。鄧昌蓉等（2014）發(fā)現(xiàn)1株（B9）花色嵌合體，即同一植株的不同花或同一朵花上出現(xiàn)黃、白2種顏色；B9單株自交得到的S1性狀發(fā)生了分離，出現(xiàn)白、乳白和黃3種花色的植株。

從2011年到現(xiàn)在，筆者在菜薹育種材料中先后發(fā)現(xiàn)了4份黃花和乳白色花的嵌合體，它們的共同點是：同一個體同時具有黃花和乳白色花分枝花序、同花序的黃花和乳白色花花朵以及同花朵的黃色和乳白色花瓣。菜薹乳白色花和黃花嵌合體發(fā)生原因不詳，說明黃花或乳白色花基因具有易變傾向。2018年秋季，將超級80天菜心×坡頭70天油青菜心F2群體和引心-635中發(fā)現(xiàn)的2株嵌合體分別單獨套袋、自交，獲得2份材料的同一植株上黃花、乳白色花和同一花序的黃色和乳白色花朵的自交后代種子，2019年春季將繼續(xù)播種乳白色花和黃花嵌合體的后代，調(diào)查花瓣顏色和花色分離比例，進一步驗證乳白色花的遺傳規(guī)律。同時，黃花和乳白色花嵌合體為同一植株的不同花序，也是近等基因系（near isogenic lines，NIL）材料，今后將通過菜薹乳白色花和黃花F2分離群體和NIL材料，初步開展菜薹乳白色花的染色體定位和遺傳等分子標(biāo)記研究。

3.3 BC1′群體中菜薹乳白色花單株存在的原因

本試驗發(fā)現(xiàn)，在超級80天菜心×坡頭70天油青菜心回交BC1′群體330株中出現(xiàn)了14株乳白色花植株，黃花植株與乳白色花植株的比例為158∶7?？赡艿脑蚴?，在獲得F1×坡頭70天油青菜心回交一代BC1′時，F(xiàn)1作為母本沒有徹底去雄，導(dǎo)致F1的極少量花粉可能自交，所以在BC1′群體中出現(xiàn)乳白色花的植株。張德雙等（2013）研究了菜薹橘紅色花的遺傳規(guī)律，在2份菜薹橘紅色花BC1回交群體（F1×橘紅色花菜薹）中發(fā)現(xiàn)具有橘紅色子葉的個別單株，橘紅色子葉與綠色子葉的比例分別是6∶85和2∶101，隱性性狀橘紅色子葉發(fā)生的原因可能是F1自交結(jié)實的結(jié)果。本試驗乳白色花出現(xiàn)的原因與其相似。

3.4 菜薹乳白色花與黃花材料的主要營養(yǎng)成分

本試驗結(jié)果表明，超級80天菜心的蛋白質(zhì)含量極顯著高于坡頭70天油青菜心，可溶性糖含量和纖維素含量顯著高于坡頭70天油青菜心。這可能是由于乳白色花和黃花花色不同，也可能是因為超級80天菜心和坡頭70天油青菜心品種不同而導(dǎo)致的差異。目前還不能確定花色和品種如何決定蛋白質(zhì)、可溶性糖、纖維素含量的顯著或極顯著差異，只能初步認為這組數(shù)據(jù)說明花色有可能與主要營養(yǎng)成分有關(guān)。張德雙等（2004）研究表明，控制大白菜橘紅色花與橘紅心球色的基因完全相同，橘紅色葉球大白菜的VC含量和β-胡蘿卜素含量極顯著高于普通白心大白菜。今后將進一步選取菜薹核心材料與乳白色花超級80天菜心雜交、多代回交和自交，創(chuàng)制菜薹乳白色花和黃花的近等基因系，這些材料除了花色不同外，遺傳背景相似，測定其主要營養(yǎng)成分含量，將有助于闡明花色與營養(yǎng)品質(zhì)的可能關(guān)系，為菜薹的種質(zhì)資源創(chuàng)制和品種選育提供指導(dǎo)。此外，將乳白色花菜薹與普通大白菜雜交、多代回交和自交，獲得轉(zhuǎn)育乳白色花的大白菜材料，觀察大白菜的花色，比較乳白色花的大白菜材料、白花大白菜材料以及黃花大白菜材料之間主要營養(yǎng)成分等性狀的異同，也將為大白菜的種質(zhì)資源創(chuàng)制和品種選育提供參考。

3.5 菜薹瓣化型CMS不育系18NBCC的應(yīng)用

目前，菜薹的不育系主要有玻里馬pol CMS、改良的蘿卜胞質(zhì)Ogu CMS、甘藍型油菜CMS96細胞質(zhì)不育系和隱性細胞核雄性不育系。玻里馬pol CMS不育性不穩(wěn)定，在一定溫度條件下可能出現(xiàn)有粉株，影響F1的純度。利用隱性細胞核雄性不育系生產(chǎn)菜薹雜交種時，必須拔除50%的可育株，不僅增加了制種成本和工作量，也可能存在因為沒有徹底拔除可育植株而導(dǎo)致自交的隱患。相比較而言，改良的蘿卜胞質(zhì)Ogu CMS不育系和甘藍型油菜CMS96細胞質(zhì)不育系為普遍應(yīng)用的細胞質(zhì)不育系，二者的不育株率和不育度均為100%。但是，一旦Ogu CMS不育系和CMS96不育系得到廣泛應(yīng)用，可能存在多代自交后生長勢退化的風(fēng)險。同時，由于單一細胞質(zhì)可能導(dǎo)致雜交菜薹對病害、蟲害的脆弱性，在大面積生產(chǎn)中一旦遇到病害、蟲害流行的年份，可能存在菜薹絕收的更大風(fēng)險。因此，必須尋找多種類型的不育源，以豐富菜薹的不育系種類。瓣化型不育系18NBCC可能為新的不育系類型，表現(xiàn)為細胞質(zhì)遺傳的特點，其不育株率和不育度均為100%，將有利于豐富菜薹的細胞質(zhì)不育系種類。下一步，將利用orf138、orf222、orf224、atp6、atp9、atpA、NADH 和 coxI等 線 粒體不育基因設(shè)計引物，擴增18NBCC線粒體基因組，尋找差異帶型，驗證18NBCC不育系的所屬類型。