D-半乳糖聯(lián)合脫氫表雄酮誘導(dǎo)小鼠多囊卵巢綜合征模型

史成良，宋春雨，王單，齊曉娟

(齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院，齊齊哈爾 161006)

多囊卵巢綜合征(PCOS)是育齡期婦女最常見的內(nèi)分泌紊亂，也是引起不孕的常見病因，其發(fā)病率約占育齡期女性的5%～10%，主要以卵巢形態(tài)學(xué)改變?yōu)榛A(chǔ)、并且伴有長期排卵和月經(jīng)失調(diào)以及高雄激素血癥等癥狀[1]。PCOS還與很多疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，如肥胖癥、2型糖尿病、血脂異常、高血壓等，因此該綜合征已經(jīng)成為婦科內(nèi)分泌領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[2]。PCOS臨床表現(xiàn)為高度的異質(zhì)性，其發(fā)病因素涉及下丘腦、垂體、胰腺、腎上腺、卵巢及遺傳等諸多因素，但其發(fā)病機(jī)制目前尚無定論，為探究PCOS的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)防、治療，已建立了很多種動物模型，但由于PCOS具有高度的異質(zhì)性，目前尚無能夠囊括PCOS全部特征而被公認(rèn)的標(biāo)準(zhǔn)動物模型。因此，仍然需要科研工作者去尋找能夠符合PCOS特征的更加理想的實(shí)驗(yàn)動物模型。

D-半乳糖通?？梢鸫竽X、腎臟、肝臟、血細(xì)胞等多種器官組織的損傷及衰老，常用于多種器官早衰動物模型的制備[3]。國外學(xué)者Park等[4]提出：D-半乳糖也可誘導(dǎo)ICR雌性小鼠PCOS表型;國內(nèi)學(xué)者周越等[5]也報(bào)道了D-半乳糖可誘導(dǎo)建立ICR雌性小鼠PCOS模型，本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上采用D-半乳糖聯(lián)合脫氫表雄酮(DHEA)誘導(dǎo)小鼠PCOS模型，探討能夠符合PCOS特征更理想的動物造模方法以滿足臨床研究的需要。

材料和方法

一、實(shí)驗(yàn)動物

清潔級ICR小鼠48只，雌性，20周齡，體重(40±2)g，購于哈爾濱醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物部(許可證號SCXK(黑)2013-001)。所有實(shí)驗(yàn)動物均分籠飼養(yǎng)于齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心(許可證號SYXK(黑)2016-001)。按照3R原則給予使用的實(shí)驗(yàn)動物人道主義關(guān)懷，環(huán)境溫度為(22±2)℃，相對濕度40%～60%，所有小鼠均可自由飲水及進(jìn)食，并且每天給予12 h日光燈照明。

二、儀器與試劑

D-半乳糖、DHEA、注射用大豆油(武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技)；血糖試紙和血糖儀(上海強(qiáng)生醫(yī)療器械)；石蠟包埋機(jī)、旋轉(zhuǎn)切片機(jī)、烘片機(jī)(Leica，德國)；光學(xué)顯微鏡(Nikon，日本)；圖像采集分析系統(tǒng)(Leica，德國)。

三、藥物的制備及儲存

將4克D-半乳糖溶于100 ml生理鹽水制備成工作液，4℃儲存，以200 mg/kg劑量腹腔注射；將1.4克DHEA溶于100 ml注射用大豆油中制備成工作液，4℃儲存，以70 mg/kg劑量頸背部皮下注射，注射前充分?jǐn)嚢琛?/p>

四、實(shí)驗(yàn)方法

1.動物模型制備和實(shí)驗(yàn)分組：48只ICR小鼠隨機(jī)分成正常對照組、DHEA組、D-半乳糖組和D-半乳糖聯(lián)合脫氫表雄酮組(D+D聯(lián)合組)，每組各12只。D+D聯(lián)合組在頸背部皮下注射DHEA 70 mg/kg及腹腔注射D-半乳糖200 mg/kg，D-半乳糖組腹腔注射D-半乳糖200 mg/kg，DHEA組頸背部皮下注射DHEA 70 mg/kg，正常對照組在頸背部皮下注射等量的注射用大豆油及腹腔注射等量的生理鹽水，每日1次，連續(xù)注射21 d。

2.取材：實(shí)驗(yàn)小鼠處死方法采用頸椎脫臼法，解剖取卵巢并觀察卵巢的變化。以4%多聚甲醛固定卵巢后，石蠟包埋、切片、HE染色并做光鏡檢查。

3.飲食量及體重的測定：每周測定兩次飲食消耗量及體重。

4.血糖值的測定：所有實(shí)驗(yàn)小鼠于實(shí)驗(yàn)的第21天隔夜禁食，次日用血糖儀在剪斷的尾尖部取血，測定空腹血糖值。

5.動情周期的檢查：自開始給藥的第11天采集陰道脫落細(xì)胞涂片，連續(xù)10 d。每天下午5點(diǎn)用吸管吸取生理鹽水約0.1～0.2 ml，輕輕插入小鼠的陰道內(nèi)約0.5～1 cm，連續(xù)抽吸2～3次，再將吸液滴于載玻片上，滴入適量的95%乙醇溶液用以固定細(xì)胞，晾干后放置于普通光學(xué)顯微鏡下行細(xì)胞學(xué)檢查。

五、統(tǒng)計(jì)方法

結(jié) 果

一、進(jìn)食量變化結(jié)果

D+D聯(lián)合組、DHEA組、D-半乳糖組與對照組相比進(jìn)食量均有所降低，且D+D聯(lián)合組、DHEA組顯著低于對照組(P<0.05)(圖1)。

圖1 不同造模方法對攝食量的影響

二、體重變化結(jié)果

D+D聯(lián)合組、DHEA組與對照組相比體重稍有增高，而D-半乳糖組與對照組相比體重稍有降低，但均無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P>0.05)(圖2)。

圖2 不同造模方法對體重的影響

三、血糖值測定

D-半乳糖組、DHEA組及D+D聯(lián)合組空腹血糖值與正常對照組相比無顯著差異(P>0.05)(圖3)。

圖3 造模21 d后空腹血糖值

四、動情周期的檢測

經(jīng)過連續(xù)10 d的涂片及鏡下觀察發(fā)現(xiàn)，各組動情周期變化如下(圖4)。(1)對照組：呈明顯的4～5 d的動情周期變化。(2)造模各組：DHEA組沒有明顯的動情周期的變化，表現(xiàn)為持續(xù)的動情間期，偶爾有動情后期的表現(xiàn)，提示沒有排卵發(fā)生；D-半乳糖組無明顯的動情周期的變化，表現(xiàn)為持續(xù)的動情間期，也提示沒有排卵發(fā)生；D+D聯(lián)合組無明顯的動情周期的變化，表現(xiàn)為持續(xù)的動情間期或動情后期，亦提示無排卵發(fā)生。

五、病理學(xué)改變

(1)大體觀察：對照組小鼠的卵巢形態(tài)正常，色澤紅潤；DHEA組小鼠、D-半乳糖組小鼠、D+D聯(lián)合組小鼠的卵巢偏大，表面蒼白，卵巢表面可見單個(gè)或較多的囊性擴(kuò)張卵泡。(2)組織學(xué)：對照組100%(12/12)小鼠的卵巢在光鏡下可見多個(gè)不同發(fā)育階段的卵泡及黃體，顆粒細(xì)胞形態(tài)完整且排列整齊，多為8～9層(圖5A)；DHEA組50%(6/12)小鼠的卵巢可見顆粒細(xì)胞層數(shù)變薄，排列松散，可減少至5～6層，黃體形成較少(圖5B)；D-半乳糖組50%(6/12)小鼠的卵巢閉鎖增多并且呈囊狀擴(kuò)張，卵泡膜細(xì)胞增生，卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞消失，卵巢顆粒細(xì)胞排列松散，層數(shù)減少至3～4層(圖5C)；D+D聯(lián)合組91.7%(11/12)小鼠卵巢可見較多囊狀擴(kuò)張的卵泡，較少見到黃體，卵泡內(nèi)卵母細(xì)胞消失，顆粒細(xì)胞層數(shù)可減少至2～3層(圖5D)。

每組展示4只小鼠的動情周期變化。E：動情期；P：動情前期；D：動情間期；M：動情后期圖4 各組小鼠動情周期變化

A：對照組；B：DHEA組；C：D-半乳糖組；D：D+D聯(lián)合組圖5 各組動物卵巢形態(tài)學(xué)(HE染色 ×100)

討 論

D-半乳糖通?？梢鸫竽X、腎臟、肝臟、血細(xì)胞等多種器官組織的損傷及衰老，常用于多種器官早衰動物模型的制備[3，6]。然而D-半乳糖對雌性生殖器官的影響鮮有報(bào)道[1，4]。我們采用D-半乳糖聯(lián)合DHEA誘導(dǎo)小鼠PCOS的模型顯示能夠使小鼠產(chǎn)生典型的PCOS特征，并且這些特征與單純應(yīng)用D-半乳糖或DHEA產(chǎn)生的PCOS特征更為符合其臨床特征。

DHEA是一種雄性激素，主要在腎上腺合成，大部分可被硫酸化為硫酸鹽釋放進(jìn)入血液[7]。王玉閣等[8]研究顯示DHEA聯(lián)合高脂飲食可誘導(dǎo)C57BL/6J雌鼠表現(xiàn)為空腹血糖及胰島素水平升高，表現(xiàn)為胰島素抵抗現(xiàn)象。有研究顯示，DHEA處理的動物在代謝方面的表現(xiàn)更接近于PCOS患者，可導(dǎo)致體重增加、糖耐量異常及胰島素抵抗等代謝特征[9-10]。周越等[5]研究顯示D-半乳糖誘導(dǎo)ICR中年雌性小鼠PCOS動物模型，顯示模型組小鼠卵巢重量顯著高于對照組，單側(cè)或雙側(cè)卵巢呈現(xiàn)多囊性擴(kuò)張，卵巢閉鎖增多及顆粒細(xì)胞層數(shù)減少，并表現(xiàn)為紊亂的動情周期。Park等[4]研究報(bào)道應(yīng)用D-半乳糖可誘導(dǎo)小鼠PCOS綜合征樣表型，模型小鼠動情周期紊亂及卵巢呈囊性擴(kuò)張，AMH及雄激素水平升高。

雖然PCOS的病因復(fù)雜，臨床表現(xiàn)具有明顯的異質(zhì)性。主要表現(xiàn)為生殖及代謝兩個(gè)方面，生殖方面的表現(xiàn)主要體現(xiàn)為多囊性卵巢，代謝方面的表現(xiàn)主要是血脂異常、肥胖以及胰島素抵抗等。多囊性卵巢的病理學(xué)改變是臨床上診斷PCOS 的最重要的依據(jù)之一[11]。本研究發(fā)現(xiàn)D-半乳糖聯(lián)合DHEA可明顯引起ICR小鼠單側(cè)或雙側(cè)卵巢囊腫以及多囊性改變，而正常對照組并未出現(xiàn)卵巢多囊樣特征，且D-半乳糖聯(lián)合DHEA能夠明顯誘發(fā)卵巢卵泡發(fā)生閉鎖及囊狀擴(kuò)張卵泡改變，實(shí)驗(yàn)組91.7%小鼠可見此變化，與PCOS患者卵巢病理改變非常相似。單純應(yīng)用D-半乳糖或DHEA引致小鼠單側(cè)或雙側(cè)卵巢囊腫及多囊性改變不甚明顯，只有50%的小鼠可見此改變。另外，本研究發(fā)現(xiàn)D-半乳糖聯(lián)合DHEA明顯引致小鼠動情周期紊亂，表現(xiàn)為卵泡發(fā)育障礙、不排卵或稀發(fā)排卵，表現(xiàn)出明顯的生殖方面的改變。本研究發(fā)現(xiàn)D+D聯(lián)合組、DHEA組、D-半乳糖組與對照組相比進(jìn)食量均有所降低，但D+D聯(lián)合組、DHEA組與對照組相比有顯著差異，D-半乳糖組與對照組相比無顯著差異。本研究中，D+D聯(lián)合組與DHEA組與對照組相比體重稍有增高，與Solano等[9]及Dowling等[10]的研究結(jié)果一致；D-半乳糖組與對照組相比體重稍有降低，與李婧等[6]的研究結(jié)果一致。另外，在分析攝食量與體重的關(guān)系時(shí)發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用DHEA的PCOS模型組小鼠與對照組相比攝食量減少，但體重卻有增加的趨勢；而應(yīng)用D-半乳糖的PCOS模型組小鼠與對照組相比攝食量沒有顯著差異，但體重卻有減少的趨勢。說明DHEA和D-半乳糖在誘導(dǎo)PCOS模型中代謝方面的表現(xiàn)是有一定差別，但并未表現(xiàn)出非常明顯的變化。本研究發(fā)現(xiàn)D-半乳糖組、DHEA組及D+D聯(lián)合組空腹血糖數(shù)值與正常對照組相比沒有顯著差異。說明DHEA和D-半乳糖在誘導(dǎo)PCOS模型中并未改變胰島素敏感指數(shù)，其機(jī)制需進(jìn)一步研究。

盡管目前國內(nèi)外已經(jīng)建立了很多種PCOS實(shí)驗(yàn)動物模型，例如雄激素造模法、雌激素造模法、來曲唑造模法、芳香化酶抑制劑造模法、胰島素聯(lián)合HCG造模法、孕激素聯(lián)合HCG造模法等[12-13]。但是這些模型仍然存在著不同程度的局限性，如可以誘發(fā)出卵巢的多囊性改變的注射外源性雄激素造模法，在形態(tài)學(xué)和激素的改變等方面與人的PCOS癥狀還是有很大的差別[14]；另外硫酸普拉睪酮鈉、硫酸普拉睪酮鈉聯(lián)合HCG、來曲唑雖然也可誘導(dǎo)出PCOS模型，但臨床上PCOS患者的胰島素抵抗現(xiàn)象卻未能體現(xiàn)[15]。所以科研工作者們?nèi)孕璨粩嗟膰L試和探索新的造模方法，以求建立更加理想及更符合臨床癥狀的PCOS動物模型。

本研究采用了D-半乳糖聯(lián)合DHEA處理中年ICR小鼠誘導(dǎo)建立一種新的PCOS動物模型，結(jié)果發(fā)現(xiàn)實(shí)驗(yàn)小鼠呈典型的PCOS卵巢多囊性改變，無排卵等表現(xiàn)，聯(lián)合組在生殖方面的改變比D-半乳糖組及DHEA組更明顯，其特點(diǎn)與PCOS臨床癥狀非常相似，符合臨床研究需要。該方法操作簡單、結(jié)果可靠，是一種建立PCOS動物模型理想的選擇。