一種玉米赤霉烯酮免疫磁珠分離富集試劑盒的研制

劉玉梅 王兆芹 賈芳芳 萬宇平杜美紅 張 瑜 馮月君 張 穎 何方洋*

玉米赤霉烯酮(Zearalenone，ZEN)為一種白色結(jié)晶，又稱F-2毒素，是由禾谷鐮刀菌等菌種產(chǎn)生的有毒代謝產(chǎn)物。ZEN主要污染玉米、高粱、小麥、大麥等糧谷類作物及其制品。受到ZEN污染的乳制品、肉制品等動(dòng)物源性食品，會(huì)對(duì)動(dòng)物及人類造成危害，主要表現(xiàn)在影響和破壞生長(zhǎng)發(fā)育及生殖系統(tǒng)方面，人畜誤食含有該毒素的食物后，會(huì)引起雌性激素中毒癥，造成生殖系統(tǒng)的嚴(yán)重?fù)p傷。此外，ZEN及其衍生物對(duì)肝臟系統(tǒng)，免疫系統(tǒng)均有很大的危害，并且有引發(fā)腫瘤的可能性[1-2]。目前大多數(shù)國(guó)家對(duì)食品、谷物、飼料中的玉米赤霉烯酮含量都有十分嚴(yán)格的規(guī)定。例如澳大利亞規(guī)定谷物中玉米赤霉烯酮的含量不能超過0.05mg/kg；意大利規(guī)定在谷物和谷類產(chǎn)品中玉米赤霉烯酮的含量不能超過0.1mg/kg；而在法國(guó)，植物油和谷類當(dāng)中玉米赤霉烯酮的含量必須低于0.2mg/kg。中國(guó)則規(guī)定配合飼料、玉米中的玉米赤霉烯酮含量不得超過500ng/g。

玉米赤霉烯酮的分析測(cè)定一般采用薄層色譜法(TLC)、酶聯(lián)吸附免疫法(ELISA)和高效液相色譜法(HPLC)[3-9]。TLC法繁瑣費(fèi)時(shí)，且靈敏度、特異性較差，提取過程中所需有機(jī)溶劑品種多且量大，易污染環(huán)境，對(duì)人體有較大危害。常規(guī)的HPLC法雖然比TLC靈敏度高，但由于樣品前處理手續(xù)繁瑣，操作復(fù)雜，不宜推廣。本文研究的玉米赤霉烯酮免疫磁珠分離富集方法是通過內(nèi)含四氧化三鐵的納米磁珠表面修飾官能團(tuán)與玉米赤霉烯酮抗體結(jié)合，在外加磁場(chǎng)作用下，從混合溶液中富集、分離玉米赤霉烯酮，操作步驟簡(jiǎn)單，實(shí)驗(yàn)成本較低。本研究利用免疫磁珠分離技術(shù)檢測(cè)谷物中的玉米赤霉烯酮?dú)埩袅?，為致力于食品安全檢測(cè)的基層實(shí)驗(yàn)室提供檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品CAS：17924-92-4：購自北京標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)研究中心；對(duì)苯二胺、乙酸乙酯、亞硝酸鈉、鹽酸、牛血清白蛋白(SA)、魯米諾：購自北京百欣試劑公司；玉米：市售；小鼠脾細(xì)胞、玉米赤霉烯酮?dú)埩裘嘎?lián)免疫檢測(cè)試劑盒(以下簡(jiǎn)稱ELISA試劑盒)：來自北京勤邦生物技術(shù)有限公司。

1.1.2 儀器與設(shè)備 MX-F渦旋儀(湖南湘立科學(xué)儀器有限公司)、MK3酶標(biāo)儀(上海雷勃分析儀器有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 制備抗原 （1）半抗原的制備：將110mg對(duì)苯二胺溶入15ml 0.2mol/L的HCl水溶液中，0～4℃下滴加70mg NaNO2的2ml水溶液，避光反應(yīng)0.5～1h，然后緩慢滴加110mg玉米赤酶烯酮在2ml 0.5mol/L醋酸鈉水溶液中的混合物。避光反應(yīng)1～3h。加入適量濃鹽酸酸化，產(chǎn)生沉淀，離心，水洗，乙酸乙酯提取，除去溶劑后得到玉米赤酶烯酮的偶氮衍生物，得到玉米赤霉烯酮半抗原，得率65%。玉米赤霉烯酮半抗原的合成路線見圖1。（2）免疫原的制備：取20mg玉米赤霉烯酮半抗原用2ml水溶解，得到溶液A，取50μl戊二醛逐滴加入到溶液A中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)24h。取BSA50mg用4ml水溶解，得到溶液B，將溶液A緩慢加入到溶液B中，室溫?cái)嚢璺磻?yīng)過夜。加入430mg NaBH還原，用0.02mol/L的PBS透析3d，更換透析液3次/d，得到所述玉米赤霉烯酮人工抗原，分裝后-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

附圖 玉米赤霉烯酮半抗原合成

1.2.2 制備單克隆抗體、偶聯(lián)單抗的磁珠 將1.3.1得到的玉米赤霉烯酮免疫原依次進(jìn)行動(dòng)物免疫、細(xì)胞融合、雜交瘤細(xì)胞篩選、單克隆抗體制備等操作[10]，最終得到玉米赤霉烯酮單克隆抗體。取100μl羧基磁珠(購于DYNAL，粒徑為2.8μm，含量是0.15eq/g)于離心管中，用100μl含0.05%吐溫-20的pH5.0、25mmol/L的MES溶液洗滌2次，磁分離后移除上清；用4℃貯存的pH5.0、25mmol/L MES溶液分別配制50mmol/L的EDC、NHS溶液；分別加入50μl新配制的EDC和NHS溶液到裝有磁珠的離心管中，渦旋混勻，室溫活化30min，磁分離后移除上清，MES溶液洗滌2～3次；將玉米赤霉烯酮單克隆抗體溶解到60μl pH5.0、25mmol/L MES溶液中，用所述MES溶液調(diào)節(jié)總體積至100μl，輕柔加入到已活化磁珠中，室溫偶聯(lián)30min或4℃偶聯(lián)2h，期間使磁珠保持混勻狀態(tài)；磁分離后移除上清，加入100μl pH7.4的TRIS溶液反應(yīng)15min封閉磁珠；磁分離后移除上清，用100μl含0.1%～0.3%BSA、0.1%吐溫-20的TRIS溶液洗滌封閉好的磁珠3～5次，磁分離后移除上清，將磁珠復(fù)溶于含0.1%～0.5%BSA、0.01%～0.1%吐溫-20、0.02% NaN3的TRIS溶液中(濃度為10mg/ml)，2～8℃保存?zhèn)溆谩Ｋ霭俜趾繛橘|(zhì)量百分含量。

1.2.3 試劑盒對(duì)樣本中玉米赤霉烯酮的分離富集方法（1）樣品前處理：用均質(zhì)器均質(zhì)樣品；稱取5.0±0.05g樣品至樣品瓶中，分別加入1.0±0.05g氯化鈉，25ml 60%甲醇溶液，用渦旋儀渦旋5min，或者搖床震蕩20min，3000g以上，室溫(20～25/68℃～77)℉離心5min；(如不具備離心條件，該步驟也可用如下操作替代：靜置后取10ml上清液過濾)吸取5ml(相當(dāng)于1g樣品)離心上清液/濾液，加入5ml去離子水，混勻，待用(用于磁珠捕獲)。（2）免疫磁珠捕獲：取玉米赤霉烯酮免疫磁珠0.2ml于10ml離心管中，用5ml去離子水潤(rùn)洗磁珠2次，每次用磁分離架分離洗液(每次在磁分離架上靜置3min，確保磁珠全部吸附)；向潤(rùn)洗好的玉米赤霉烯酮免疫磁珠中加入處理好的樣本5ml，混勻，25℃，20min，期間5min混勻一下磁珠；用磁分離架分離免疫磁珠，用去離子水液沖潤(rùn)洗免疫磁珠2次，每次5ml(方法同免疫磁珠潤(rùn)洗)。（3）免疫磁珠洗脫：用1ml甲醇洗免疫磁珠，混勻，靜置1min，用磁分離架分離免疫磁珠，回收甲醇液，即為富集凈化后的玉米赤霉烯酮樣品，應(yīng)用于酶聯(lián)免疫吸附法檢測(cè)的快速測(cè)試。

1.2.4 試劑盒的捕獲量和回收率測(cè)定方法 試劑盒的捕獲量的定義為：每毫克偶聯(lián)玉米赤霉烯酮單克隆抗體的磁珠可以捕獲玉米赤霉烯酮的最大量。取上述步驟制備的富集玉米赤霉烯酮的免疫磁珠0.1ml(濃度為10mg/ml)于10ml離心管中，用5ml去離子水潤(rùn)洗磁珠2次，磁分離后移除上清；然后加入1ml待測(cè)樣品(將玉米赤霉烯酮標(biāo)準(zhǔn)品用PBS緩沖液分別配制成濃度為10、20、30、40、50、60、70、80ng/ml的玉米赤霉烯酮溶液作為待測(cè)樣品，并以PBS緩沖液作為空白待測(cè)樣品)，混勻，25℃捕獲20min，期間5min混勻一下磁珠；磁分離后移除上清，用5ml去離子水潤(rùn)洗磁珠2次，除去干擾雜質(zhì)。最后加入1ml甲醇洗脫，收集洗脫液，用ELISA試劑盒檢測(cè)待測(cè)樣品中玉米赤霉烯酮的含量。

1.2.5 試劑盒的特異性測(cè)定方法 以玉米赤霉烯酮作為標(biāo)準(zhǔn)，設(shè)玉米赤霉烯酮的交叉反應(yīng)率為100%，用于試劑盒交叉反應(yīng)性研究的藥物均為與玉米赤霉烯酮結(jié)構(gòu)或者功能相似的競(jìng)爭(zhēng)藥物：黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素M1、T-2毒素、赭曲霉毒素A、展青霉素。玉米樣本中分別添加上述6種藥物(包括玉米赤霉烯酮)濃度為50ng/ml，按照試劑盒步驟操作，對(duì)樣本中玉米赤霉烯酮進(jìn)行分離富集后，利用ELISA試劑盒方法對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果與分析

2.1 試劑盒的捕獲量

樣本中玉米赤霉烯酮濃度為10、20、30、40、50ng/ml時(shí)，經(jīng)玉米赤霉烯酮免疫磁珠分離富集試劑盒對(duì)樣本中玉米赤霉烯酮分離富集后，再經(jīng)ELISA試劑盒進(jìn)行檢測(cè)，得出玉米赤霉烯酮添加回收率范圍為85.4%～93.8%；樣本中玉米赤霉烯酮濃度為60、70、80ng/ml時(shí)，得出玉米赤霉烯酮添加回收率范圍為72.1%～82.9%，表明玉米赤霉烯酮免疫磁珠分離富集試劑盒對(duì)樣品中玉米赤霉烯酮的捕獲量為50ng/ml。

表1 偶聯(lián)玉米赤霉烯酮單克隆抗體的磁珠捕獲量和樣品添加回收率

2.2 特異性

按照1.2.5步驟，利用ELISA試劑盒方法對(duì)樣本進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果見表2。

表2 試劑盒特異性試驗(yàn) (ng/ml)

從表2可以看出，試劑盒對(duì)玉米赤霉烯酮具有較高的特異性，對(duì)與玉米赤霉烯酮結(jié)構(gòu)或者功能相似的競(jìng)爭(zhēng)藥物均無交叉反應(yīng)。

2.7 討論

目前，在檢測(cè)方法中，一般都需要對(duì)目標(biāo)物進(jìn)行前處理，達(dá)到分離富集的作用。較常用的前處理凈化裝置，包括免疫親和柱、C18固相萃取柱等[11-23]。以上凈化裝置費(fèi)用較高，不適于基層實(shí)驗(yàn)室大量使用。本研究的玉米赤霉烯酮免疫磁珠分離富集試劑盒價(jià)格合適，用于后期檢測(cè)的靈敏度也較好。

3 結(jié)論

本研究制備了抗玉米赤霉烯酮單克隆抗體，并研發(fā)出玉米赤霉烯酮免疫磁珠分離富集試劑盒，試劑盒對(duì)樣品中玉米赤霉烯酮的捕獲量為50ng/ml，與玉米赤霉烯酮結(jié)構(gòu)或者功能相似的競(jìng)爭(zhēng)藥物：黃曲霉毒素B1、黃曲霉毒素M1、T-2毒素、赭曲霉毒素A、展青霉素等5種藥物進(jìn)行特異性反應(yīng)時(shí)，均無交叉反應(yīng)，說明試劑盒對(duì)玉米赤霉烯酮具有較高的特異性。