復(fù)方黃芪養(yǎng)心合劑對大鼠缺血心肌縫隙連接蛋白CX43磷酸化的影響

閃書華 李夢茜 祝 丹 陳啟蘭

心肌缺血（myocardial ischemia）是指在各種因素作用下心肌血供減少，或者心肌最大供血量無法滿足需氧量，引起心肌能量代謝、心臟功能、結(jié)構(gòu)發(fā)生異常的病理狀態(tài)[1]。冠狀動脈粥樣硬化性心臟病簡稱冠心病（coronary heart disease，CHD）又被稱為缺血性心臟病，臨床上心肌缺血主要是由于冠狀動脈病變所致，而心肌缺血的發(fā)展則可加重CHD的進程嚴(yán)重者可引起猝死。本研究觀察復(fù)方黃芪養(yǎng)心合劑（compound astragalus mixture nourishing heart，CAMNH）對大鼠心肌缺血后心肌縫隙連接蛋白CX43的預(yù)干預(yù)作用。

1 實驗材料

1.1 實驗動物 清潔級雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠50只，體質(zhì)量180～200g，由上海斯萊克公司提供，合格證號：SCXK（滬）2017-0005。委托浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心飼養(yǎng)，實驗動物許可證號：SYXK（浙）2018-0012。

1.2 實驗藥品 CAMNH：黃芪、黨參、太子參、苦參、丹參、甘松各20g，炙甘草10g，生山楂15g。制備成生藥濃度為2g/mL的生藥煎劑。中藥飲片由杭州市中醫(yī)院西藥庫房提供。琥珀酸美托洛爾緩釋片（Metoprolol Succinate Sustained-release Tablets，MSSRT）[47.5mg/片，批號 J20150044，阿斯利康（無錫）制藥有限公司]。

1.3 主要試劑和儀器 CX43（磷酸化位點s368）抗體（abcam,美國，ab30559）；蛋白 Marker（Thermo,美國，26617）；BCA 試劑盒（普利萊，北京，PLL-2016-11）；Western Blot膜再生液（普利萊，北京，2018J1KP1650）；蛋白磷酸酶抑制劑（普利萊，北京，21171126）；戊巴比妥鈉（上海西唐生物科技有限公司，30102LD）；酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（R&D公司，R1080115、R9080115）；DH-150動物人工呼吸機（浙江大學(xué)醫(yī)學(xué)儀器廠）；Medlab-U/4CS生物信號采集儀（南京美易科技有限公司）；酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（R&D公司）。

2 實驗方法

2.1 冠狀動脈結(jié)扎術(shù)后心肌缺血模型大鼠的建立急性心肌缺血模型大鼠制作參考Supinsk等[2]的方法并加以改進。大鼠用2%戊巴比妥鈉（2mL/kg）麻醉后，固定于鼠板，氣管插管連接動物呼吸機，逐層開胸，剪斷第3～4肋骨，以擴胸器撐開胸腔，撕破心包膜，輕輕掀起左心耳，結(jié)扎冠狀動脈左前降支，結(jié)扎1h后留取標(biāo)本。假手術(shù)組除不結(jié)扎外其余步驟相同。全程記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。

2.2 分組及給藥 50只大鼠按隨機數(shù)字表法分為CAMNH大劑量組、CAMNH小劑量組、MSSRT組、模型組、假手術(shù)組，每組10只。CAMNH大劑量組中藥按 28g（14mL·kg-1·d-1）劑量灌胃；CAMNH 小劑量組中藥按 7g（3.5mL·kg-1·d-1） 劑量灌胃；MSSRT 組：MSSRT 蒸餾水溶解后按 9.5g（7mL·kg-1·d-1）劑量灌胃；模型組和假手術(shù)組用生理鹽水按7mL·kg-1·d-1劑量灌胃，共計2周。

2.3 指標(biāo)檢測

2.3.1 心電圖 大鼠麻醉固定后連接心電圖，造模過程中全程記錄Ⅱ?qū)?lián)心電圖。

2.3.2 心肌肌鈣蛋白T（cTn-T）和肌鈣蛋白I（cTn-I） 造模結(jié)束后腹主動脈取血3mL，離心之后取血清。根據(jù)ELISA試劑盒的說明書進行操作，測定cTn-T和cTn-I水平。

2.3.3 HE染色觀察 造模完成，取血結(jié)束后，下腔靜脈注入2%Evans blue，取下大鼠心臟組織，生理鹽水沖洗干凈后，僅保留左心室，沿與心肌長軸垂直的方向切開，將心肌組織分為3塊，厚度約2～3mm，取1個組織塊置于福爾馬林溶液內(nèi)固定24h。其余組織塊放于凍存管中-80°保存。

HE染色：組織固定好后，置于病理組織脫水機中進行脫水、透明、浸蠟，然后取出標(biāo)本進行石蠟包埋，切片，70℃烤箱烤片1h，二甲苯脫蠟，各級酒精脫二甲苯，蘇木素染色，鹽水乙醇分化，伊紅復(fù)染，常規(guī)脫水、透明，中性樹脂封片，光學(xué)顯微鏡讀片。病理圖文系統(tǒng)采集圖像（40×）。

2.3.4 WB法測定CX43表達量 蛋白提?。悍Q取100mg心肌組織，放于玻璃研磨棒內(nèi)，加入400μL已加蛋白酶抑制劑和蛋白磷酸酶抑制劑的蛋白裂解液（RIPA）中，冰上研磨至組織完全裂解，倒入EP管中，冰上靜置 30min。4℃，10 000g，離心 20min，取上清。采用BCA法測定蛋白濃度，取適量蛋白加入上樣緩沖液和RIPA配平蛋白濃度后，100℃水浴5～10min，冷卻至室溫后-20℃保存。

蛋白電泳：制作5%分離膠、10%濃縮膠加入蛋白樣品進行電泳，電泳結(jié)束制作“三明治”將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF膜上，5%牛血清白蛋白（BSA）封閉2h，加入一抗4℃過夜，TBST洗膜3次，每次10min，加入熒光二抗封閉1.5h，再次TBST洗膜后顯影儀顯影,膜再生后加入內(nèi)參GAPDH顯影，計算條帶灰度值進行比較。

2.3.5 統(tǒng)計學(xué)方法 應(yīng)用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3 實驗結(jié)果

3.1 實驗動物存活情況 大鼠灌胃過程中死亡2只，造模過程中死亡10只，總存活率為76%。每組留取6只血標(biāo)本及心臟組織，其余大鼠造模結(jié)束后留取心臟組織進行心臟雙染。

3.2 心電圖改變 冠脈結(jié)扎前，大鼠心率在300次/min以上，心電圖波形正常；冠狀動脈左前降支結(jié)扎即刻Ⅱ?qū)?lián)心電圖可見R波振幅抬高，ST段上抬明顯，甚至T波、ST段與R波融合成單向曲線，持續(xù)至手術(shù)結(jié)束，證明造模成功，見插頁圖1。

3.3 各組大鼠cTn-I、cTn-T比較 cTn-I：模型組與假手術(shù)組相比，cTn-I值明顯增高（P＜0.01）；MSSRT組與模型組、假手術(shù)組比較均減少（P＜0.05，P＜0.01）；CAMNH小劑量組與假手術(shù)組相比明顯增高（P＜0.01），與模型組相近，兩者差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），與 MSSRT 組相比增高（P＜0.05）；CAMNH 大劑量組與模型組相比明顯減少（P＜0.01），與CAMNH小劑量組相比增加幅度減少（P＜0.05），與MSSRT組相當(dāng)，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。cTn-T：模型組與假手術(shù)組相比明顯增高，（P＜0.01）；MSSRT組與模型組比較明顯降低（P＜0.01）；CAMNH小劑量組與假手術(shù)組相比明顯增高（P＜0.01），與模型組相比增加程度減?。≒＜0.01），與 MSSRT 組相比增高（P＜0.05）；CAMNH大劑量組與假手術(shù)組相比明顯升高（P＜0.01），與模型組相比明顯減少（P＜0.01），與 CAMNH小劑量組相比減少（P＜0.05），與MSSRT組作用相近（P＞0.05）。見表 1。

表1 各組冠狀動脈結(jié)扎術(shù)后心肌缺血模型大鼠血 cTn-I、cTn-T 比較（ng/L±s）

表1 各組冠狀動脈結(jié)扎術(shù)后心肌缺血模型大鼠血 cTn-I、cTn-T 比較（ng/L±s）

注：與假手術(shù)組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01；與 MSSRT 組比較，▲P＜0.05；與 CAMNH 小劑量組比較，☆P＜0.05；CAMNH：復(fù)方黃芪養(yǎng)心合劑；MSSRT：琥珀酸美托洛爾；cTn-I：心肌肌鈣蛋白I；cTn-T：心肌肌鈣蛋白T

組 別CAMNH大劑量組CAMNH小劑量組MSSRT組模型組假手術(shù)組鼠數(shù)6 6 6 6 6 cTn-I 81.63±16.89△△☆115.07±21.34**▲85.48±24.06*△△144.94±28.83**58.50±9.53 cTn-T 100.20±5.66**△△☆121.33±15.02**△△▲97.89±11.78*△△144.33±20.29**77.40±12.52

3.4 病理形態(tài)觀察 摘取大鼠心臟時肉眼可見假手術(shù)組大鼠整顆心臟藍染，其余各組心臟缺血心肌未藍染，與正常心肌組織區(qū)分明顯。HE染色光鏡下可見CAMNH大劑量組、CAMNH小劑量組、MSSRT組、模型組心肌缺血出現(xiàn)細胞形態(tài)學(xué)改變，細胞界限不清，胞質(zhì)彌散，出現(xiàn)核固縮及溶解，甚至肌細胞排列結(jié)構(gòu)消失；非缺血區(qū)細胞結(jié)構(gòu)清晰，心肌纖維排列整齊；缺血區(qū)與非缺血區(qū)區(qū)分明顯。假手術(shù)組心肌細胞胞漿染色均勻，未見胞質(zhì)溶解，胞核清楚，心肌纖維排列整齊，無炎性細胞浸潤，毛細血管正常。見插頁圖2。

3.5 各組大鼠心肌組織磷酸化CX43變化 模型組與假手術(shù)組相比磷酸化CX43蛋白的表達量明顯降低（P＜0.01）；MSSRT 組與假手術(shù)組、模型組相比蛋白磷酸化表達明顯增加（P＜0.01）；CAMNH小劑量組與假手術(shù)組磷酸化表明顯減少（P＜0.01），在抑制磷酸化蛋白表達減少方面明顯較MSSRT組差（P＜0.01），與模型組相比磷酸化表達增加（P＜0.05）；CAMNH大劑量組與假手術(shù)組比表達量明顯減少（P＜0.01），與MSSRT組在減少磷酸化蛋白表達降低的作用上程度相當(dāng)（P＞0.05），與CAMNH小劑量組、模型組比增加了磷酸化的蛋白量（P＜0.05）。見插頁圖3、表2。

表2 各組冠狀動脈結(jié)扎術(shù)后心肌缺血模型大鼠心肌組織磷酸化 CX43（ser368）蛋白表達量比較（±s）

表2 各組冠狀動脈結(jié)扎術(shù)后心肌缺血模型大鼠心肌組織磷酸化 CX43（ser368）蛋白表達量比較（±s）

注：與假手術(shù)組比較，★★P＜0.01；與模型組比較，☆P＜0.05，☆☆P＜0.01；與MSSRT 組比較，△△P＜0.01；與 CAMNH 小劑量組比較，▲P＜0.05；CAMNH：復(fù)方黃芪養(yǎng)心合劑；MSSRT：琥珀酸美托洛爾；CX43：心肌縫隙連接蛋白43

組 別CAMNH大劑量組CAMNH小劑量組MSSRT組模型組假手術(shù)組鼠數(shù)6 6 6 6 6 CX43 0.13±0.02★★☆▲0.10±0.02★★☆△△0.13±0.01★★☆☆0.07±0.01★★0.18±0.02

4 討論

心肌缺血是多種心臟疾病發(fā)生的主要原因，隨著缺血時間的延長，可出現(xiàn)急性冠脈綜合征、心力衰竭等癥狀，嚴(yán)重者可發(fā)生猝死。本實驗采用結(jié)扎冠狀動脈左前降支的方法制造急性心肌缺血模型大鼠，與臨床發(fā)生心肌缺血的機制最為接近，造模成功率和大鼠存活率也高，是一種比較成熟的造模方法[3-5]。采用在體注射Evans blue的方法進行染色，比離體染色更能反映心肌缺血的程度[6]。多項研究證明琥珀酸美托洛爾緩釋片用于早期急性心肌缺血，可以減少心律失常的發(fā)生，縮小梗死面積，降低死亡率[7-8]。溫華知等[9]研究證實美托洛爾能夠改善梗死區(qū)縫隙連接蛋白，發(fā)揮其抗心律失常的作用。

肌鈣蛋白是心肌損傷的標(biāo)志物，其敏感性、穩(wěn)定性遠高于心肌酶譜[10]，cTn-I是診斷心肌損傷的“金指標(biāo)”[11]，美國心臟病學(xué)會（ACC）在對急性心肌梗死的定義中也將cTn-T增高作為心肌損傷的最主要條件。郝迪等[12]的研究經(jīng)證實冠心蘇合膠囊可以降低急性心肌梗死大鼠的cTn-T，降低梗死心肌質(zhì)量百分比。曹志偉[13]的研究證實參麥注射液對于冠心病所造成的心肌缺血情況可以降低肌鈣蛋白，減少心肌損傷，改善微循環(huán)。本研究發(fā)現(xiàn)復(fù)方黃芪養(yǎng)心合劑大劑量組可以降低心肌肌鈣蛋白升高的程度，其作用效果與琥珀酸美托洛爾緩釋片相當(dāng)，其作用效果或與劑量有一定相關(guān)性。

縫隙連接由連接蛋白（connexins，Cxs）構(gòu)成，又稱間隙連接（gap junction，GJ）。相鄰的細胞可以通過縫隙連接進行信息、物質(zhì)和能量的交換，對細胞的新陳代謝、內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、增值和分化等生理過程起著重要的調(diào)控作用[14-15]。Cx43在心臟中主要分布于心室肌細胞中，Cx43是最易降解的結(jié)構(gòu)蛋白之一，在正常狀態(tài)下以磷酸化的形式存在，當(dāng)心肌缺血發(fā)生時，心肌細胞中的Cx43被大量降解，發(fā)生去磷酸化，從而導(dǎo)致心肌細胞間失電耦聯(lián)，引起傳導(dǎo)阻滯和折返性傳導(dǎo)，繼發(fā)心律失常，甚者可導(dǎo)致死亡[16-17]。龔一萍等[18]研究證實復(fù)脈湯等益氣活血藥物可以通過抑制心肌梗死后CX43去磷酸化，穩(wěn)定心梗后細胞間電耦聯(lián)，從而對梗死后缺血心肌起到保護作用。李真真等[19]研究證實黃芪甲苷可以通過逆轉(zhuǎn)CX43去磷酸化及表達分布紊亂，發(fā)揮抗心律失常作用，對心肌梗死起到保護作用。CAMNH由八味中藥組成，方中黃芪、黨參、太子參可補益心氣，丹參、生山楂活血，甘松、苦參理氣清熱，炙甘草可益氣和中、調(diào)和諸藥，全方起到益氣活血化瘀之功效。本研究證明與模型組相比CAMNH可以減小磷酸化CX43的降低幅度，作用與MSSRT相當(dāng)。其改善心肌缺血的癥狀或與維持CX43磷酸化狀態(tài)，穩(wěn)定細胞間電耦聯(lián)有關(guān)。

本研究結(jié)果顯示，復(fù)方黃芪養(yǎng)心合劑能顯著降低結(jié)扎冠狀動脈左前降支所致的心肌缺血模型大鼠心肌肌鈣蛋白升高幅度，減少CX43去磷酸化程度，其作用強度或與劑量大小存在一定關(guān)系。