復(fù)方健腎顆粒的質(zhì)量控制研究

陳平 米完完 應(yīng)園園 王航利 張夢(mèng)迪 黃繩武

[摘要] 目的 建立復(fù)方健腎顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，為其質(zhì)量控制提供依據(jù)。 方法 根據(jù)2010版藥典對(duì)于顆粒劑的質(zhì)量要求，主要從性狀、薄層鑒別、檢查、含量測(cè)定等方面對(duì)復(fù)發(fā)健腎顆粒進(jìn)行質(zhì)量評(píng)價(jià)，其中以黃芪甲苷、腺苷對(duì)照品和熟地、黃精對(duì)照藥材進(jìn)行制劑的鑒別研究;建立HPLC法，測(cè)定制劑中黃芪甲苷和腺苷的含量。 結(jié)果 黃芪、熟地、黃精、蟬花的薄層斑點(diǎn)清晰，圓整，陰性制劑無(wú)干擾。粒度、水分、溶化性、裝量差異符合要求。定量分析黃芪甲苷在2.70～9.45 μg范圍內(nèi)的回歸方程為：log（Y）=1.419log（X）+4.0412，R2=0.9993，平均回收率100.45%，RSD為2.81%。復(fù)方健腎顆粒中黃芪甲苷含量限度為0.0356%，定量分析腺苷在濃度0.628～7.536 μg/mL范圍內(nèi)的回歸方程為：Y=74.354x+14.256，R2=0.9993，平均回收率97.71%，RSD為1.95%。復(fù)方健腎顆粒中腺苷含量限度為0.005%。結(jié)論 方法穩(wěn)定可行，重復(fù)性好，操作簡(jiǎn)單、方便，適用于復(fù)方健腎顆粒的質(zhì)量控制。

[關(guān)鍵詞] 復(fù)方健腎顆粒;質(zhì)量評(píng)價(jià);薄層色譜;黃芪甲苷;腺苷;含量測(cè)定

[中圖分類(lèi)號(hào)] R286? ? ? ? ? [文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B? ? ? ? ? [文章編號(hào)] 1673-9701（2019）36-0037-07

Study on the quality control of compound Jianshen granules

CHEN Ping MI Wanwan YING Yuanyuan WANG Hangli ZHANG Mengdi HUANG Shengwu

Zhejiang University of Traditional Chinese Medicine， Hangzhou? ?311400， China

[Abstract] Objective To establish the quality standard of compound Jianshen granules and provide the basis for its quality control. Methods Inaccordance with the quality requirements of granules in Pharmacopoeia 2010， the quality of compound Jianshen granules was evaluated in terms of properties， thin-layer identification， inspection and content determination， among which the identification study was performed using Astragaloside， Adenosine as control herbs and Radix rehmanniae， Rhizomapolygonatumas control materialsrespectively.And High Performance Liquid Chromatography（HPLC） method was established for the determination of Astragaloside and Adenosine in preparations. Results The thin-layer chromatography（TLC） spots of Astragalus， Radix rehmanniae， Rhizomapolygonatum and Cordycepssobolifera were clear， round and normal， and the negative preparation had no interference. The differences of granules size， water content， solubility and loading amount met the requirements. The regression equation of Astragaloside in the range of 2.70～9.45 μg was log（Y）=1.419log（X）+4.0412， R2=0.9993， the average recovery rate was 100.45%， relative standard deviation（RSD） was 2.81%. The content limit of Astragaloside in compound Jianshen granules was 0.0356%. The regression equation of Adenosine in the range of 0.628-7.536 μg/mL was Y=74.354x+14.256， R2=0.9993， the average recovery rate was 97.71%， RSD was 1.95%. The content limit of Adenosine in compound Jianshen granules was 0.005%. Conclusion This method is stable， feasible， reproducible， easy to operate， facility and suitable for the quality control of compound Jianshen granules.

[Key words] Compound Jianshen granules; Quality evaluation; Thin-layer chromatography; Astragaloside; Adenosine; Content determination

隨著人們經(jīng)濟(jì)生活水平的提高，DM的患病率逐年增高，流行病學(xué)研究表明在非傳染性疾病中DM發(fā)病率僅次于腫瘤及心血管病變，已經(jīng)成為威脅人們生命健康的重要公共衛(wèi)生問(wèn)題之一[1]。預(yù)計(jì)到2030年全世界范圍內(nèi)2型糖尿病的患病率將達(dá)到500萬(wàn)[2-3]，其中將近1/4～1/3發(fā)展為DN[4-5]，在DN發(fā)病后，約20%將發(fā)展成終末期腎?。╡nd stage renal disease，ESRD）[6-7]。DN已逐漸取代DM急性并發(fā)癥成為嚴(yán)重影響患者生活生存質(zhì)量及威脅患者生命的主要因素，是導(dǎo)致ESRD的最重要病因[8]。

復(fù)方健腎方是名中醫(yī)臨床經(jīng)驗(yàn)方，具有降低血糖、保護(hù)腎臟的功能。組方為：熟地18 g、黃芪12 g、黃精12 g、蟬花6 g。前期工作已建立復(fù)方健腎顆粒提取工藝方法學(xué)以及提取工藝研究，并根據(jù)現(xiàn)代制劑的要求制備成顆粒劑。后期在此臨床經(jīng)驗(yàn)方的基礎(chǔ)上也進(jìn)行了小活絡(luò)緩釋微丸等制劑的研究，為后期實(shí)驗(yàn)提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。根據(jù)相關(guān)參考文獻(xiàn)[9-12]，黃芪和蟬花的鑒別以黃芪甲苷和腺苷標(biāo)準(zhǔn)品作為對(duì)照，熟地和黃精以其對(duì)照藥材作為對(duì)照。黃芪中的皂苷類(lèi)、多糖類(lèi)是黃芪的主要有效成分，黃芪甲苷為黃芪總皂苷的主要活性指標(biāo)成分之一[13-14]。熟地和黃精均為多糖類(lèi)成分[15-16]，蟬花主要為腺苷和多糖成分[17]，其中腺苷為蟬花的主要有效成分，故本實(shí)驗(yàn)以黃芪甲苷和腺苷為控制指標(biāo)對(duì)復(fù)方健腎顆粒進(jìn)行質(zhì)量監(jiān)控。

1 材料與儀器

1.1 實(shí)驗(yàn)藥品與試劑

熟地黃對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121196-201105）;制黃精對(duì)照藥材（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：121553-201101）;腺苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110879-200202）;硫酸（浙江中星化工試劑有限公司，批號(hào)：20140307）;黃芪甲苷對(duì)照品（成都曼斯特生物科技有限公司，批號(hào)：11092002）;正丁醇（杭州高晶精細(xì)化工有限公司，批號(hào)：20100909）;甲醇（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150620）;乙醇（上海凌峰化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20150726）;甲酸（永華化學(xué)科技有限公司，批號(hào)：20150530）;氨水（浙江中星化工試劑有限公司，批號(hào)：20101220）;三氯甲烷（西隴化工股份有限公司，批號(hào)：141016）;石油醚（60℃～90℃）（永華化學(xué)科技有限公司，批號(hào)：141016）;乙酸乙酯（永華化學(xué)科技有限公司，批號(hào)：20140917）;異丙醇（杭州雙林化工試劑廠，批號(hào)：20131219）;乙腈（天津市四友精細(xì)化學(xué)品有限公司，批號(hào)：100313）;磷酸二氫鉀（湖州湖試化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：100301）。

1.2 實(shí)驗(yàn)儀器

Waters e2695高效液相色譜儀（美國(guó)沃特世公司）;Shimadzu高效液相色譜儀（日本島津公司）;GoodSee-Ⅱ暗箱式薄層色譜攝影儀（上?？普苌萍加邢薰荆?KQ5200DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）;JA203H電子分析天平（常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司）;DF-101S集熱式恒溫加熱磁力攪拌器（鞏義市英峪予華儀器廠）;HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州市幸運(yùn)電子設(shè)備有限公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 性狀

本品外觀大小均勻，顏色呈褐色，味：甜，顆粒流動(dòng)性好。

2.2 鑒別

2.2.1 黃芪的薄層鑒別

2.2.1.1 對(duì)照品溶液的制備? 使用甲醇溶液將黃芪甲苷對(duì)照品配制成1 mg/mL的對(duì)照品溶液。

2.2.1.2 供試品溶液的制備? 取復(fù)方健腎顆粒5 g研成細(xì)粉，用50 mL甲醇超聲提取30 min，濾過(guò)，濾液蒸干。殘?jiān)铀?0 mL溶解，使用水飽和的正丁醇振搖提取3次，每次需要水飽和正丁醇20 mL，合并正丁醇液，用氨試液再次振搖提取2次，每次需要氨試液20 mL，棄去氨液，收集正丁醇液于蒸發(fā)皿中用水浴鍋蒸干，殘?jiān)蛹状? mL使溶解，作為供試品溶液。

2.2.1.3 陰性對(duì)照溶液的制備? 取除黃芪外的其余藥材，按照處方工藝制成不含黃芪的顆粒，同供試品溶液制備方法操作，制得黃芪陰性樣品溶液。

2.2.1.4 薄層展開(kāi)? 分別吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液和缺黃芪的陰性樣品溶液，在同一硅膠G薄層板上點(diǎn)樣，選擇展開(kāi)劑為三氯甲烷-甲醇-水的下層溶液，其中三種溶劑的比例是（13：7：2），將硅膠板放在展開(kāi)缸中進(jìn)行展開(kāi)，展開(kāi)完成后，取出硅膠板，通風(fēng)櫥中將展開(kāi)劑風(fēng)干，在硅膠板上適量噴灑10%硫酸乙醇溶液作為顯色劑，加熱直至斑點(diǎn)顯色清晰，在紫外光燈365 nm下觀察薄層板顯色現(xiàn)象，結(jié)果斑點(diǎn)清晰，圓整，陰性樣品無(wú)干擾。故可用于復(fù)方健腎顆粒中黃芪的薄層鑒別，見(jiàn)封三圖2。

2.2.2? 熟地的薄層鑒別

2.2.2.1 對(duì)照藥材溶液的制備? 稱(chēng)取熟地對(duì)照藥材粉末1 g于錐形瓶中，量取50 mL甲醇作為溶劑超聲提取30 min，過(guò)濾，濾液置于蒸發(fā)皿中于水浴鍋上蒸干，殘?jiān)铀? mL使溶解，用水飽和正丁醇振搖提取，合并正丁醇液，將正丁醇液置蒸發(fā)皿中于水浴鍋上蒸干，殘?jiān)鼈溆?。移液槍吸? mL甲醇將殘?jiān)芙?，作為?duì)照藥材溶液。

2.2.2.2 供試品溶液的制備? 取復(fù)方健腎顆粒粉末5 g，按照對(duì)照藥材溶液相同的處理方法制得供試品溶液。

2.2.2.3 陰性對(duì)照溶液的制備? 按照處方要求稱(chēng)取除熟地外的其余藥材，按照復(fù)方健腎顆粒的制備工藝制成不含熟地的樣品，同對(duì)照藥材溶液制備方法操作，得到缺熟地的陰性樣品溶液，備用。

2.2.2.4 薄層展開(kāi)? 分別吸取上述制備的對(duì)照藥材溶液、供試品溶液和缺熟地的陰性樣品溶液，在同一硅膠G薄層板上相應(yīng)的位置上點(diǎn)樣，選擇展開(kāi)劑為環(huán)己烷-三氯甲烷-乙醇-乙酸乙酯-水（4：10：1：5：2）的下層溶液，展開(kāi)，將硅膠板從展開(kāi)劑中取出，通風(fēng)櫥中晾干至硅膠板表面無(wú)明顯的溶劑殘留，置紫外光燈365 nm下觀察現(xiàn)象，結(jié)果陰性樣品無(wú)干擾。故可用于復(fù)方健腎顆粒中熟地的薄層鑒別，結(jié)果見(jiàn)封三圖3。

2.2.3 黃精的薄層鑒別

2.2.3.1 黃精對(duì)照藥材溶液的配制? 取黃精對(duì)照藥材粉末1 g置于錐形瓶中，使用70%乙醇20 mL，加熱回流提取1 h，抽濾，濾液蒸干，用10 mL水將殘?jiān)芙?，加正丁醇振搖萃取3次，每次20 mL，合并正丁醇液，將正丁醇液倒入蒸發(fā)皿中于水浴鍋上蒸干，殘?jiān)鼈溆?，用移液槍吸? mL甲醇將殘?jiān)芙?，作為?duì)照藥材溶液。

2.2.3.2 供試品溶液的制備? 取復(fù)方健腎顆粒粉末5 g，按照對(duì)照藥材溶液相同處理方法制得供試品溶液。

2.2.3.3陰性樣品溶液的制備? 按照已確定的處方取除黃精外的其余藥材，按照復(fù)方健腎顆粒的制備工藝制成不含黃精的顆粒，同供試品溶液相同的處理方法，制備缺黃精的陰性樣品溶液。

2.2.3.4 薄層展開(kāi)? 吸取上述對(duì)照藥材溶液、供試品溶液、陰性對(duì)照溶液各10 μL，在同一硅膠G薄層板上點(diǎn)樣，將石油醚（60℃～90℃）-乙酸乙酯-甲酸=（5：2：0.1）的溶液做為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，噴以適量5%香草醛硫酸溶液作為顯色劑，加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，日光燈下觀察薄層顯色現(xiàn)象，結(jié)果陰性樣品無(wú)干擾，故可用于復(fù)方健腎顆粒中黃精的薄層鑒別，結(jié)果見(jiàn)封三圖4。

2.2.4 蟬花的薄層鑒別

2.2.4.1 對(duì)照品溶液的制備? 取腺苷對(duì)照品，加甲醇制成2 mg/mL腺苷的溶液，作為對(duì)照品溶液。

2.2.4.2 供試品溶液的制備? 取復(fù)方健腎顆粒5 g置于錐形瓶中，將其用50 mL甲醇作為溶劑超聲提取30 min，將提取液過(guò)濾，濾液蒸干，殘?jiān)?0 ml水進(jìn)行溶解，使用水飽和的正丁醇振搖提取2次，每次需要水飽和正丁醇液20 mL，收集正丁醇液，于蒸發(fā)皿中在水浴鍋中蒸干，殘?jiān)鼈溆谩Ｒ埔簶屛〖状? mL將殘?jiān)芙?，作為供試品溶液?/p>

2.2.4.3 陰性樣品溶液的制備? 取除蟬花外的其余藥材，按照復(fù)方健腎顆粒的制備工藝制成不含蟬花的顆粒，按照供試品溶液同樣的處理方法，制備蟬花陰性樣品溶液。

2.2.4.4? 薄層展開(kāi)? 吸取對(duì)照品溶液、供試品溶液、陰性樣品溶液各5 μL，在同一硅膠GF254薄層板上點(diǎn)樣，以氯仿-醋酸乙酯-異丙醇-水-濃氨水（5：2：6：0.6：0.13）為展開(kāi)劑，展開(kāi)，取出，晾干，置紫外光燈254 nm下檢視，結(jié)果陰性樣品在同樣的位置無(wú)斑點(diǎn)，故可用于復(fù)方健腎顆粒中蟬花的薄層鑒別。結(jié)果見(jiàn)封三圖5。

2.3 檢查

2.3.1粒度? 分別取3批樣品各3袋，按《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄XIB第二法雙篩分法測(cè)定，不能通過(guò)一號(hào)篩與能通過(guò)五號(hào)篩的顆粒和粉末總和均小于15%，結(jié)果符合規(guī)定。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。

表1? ?3批樣品粒度檢查結(jié)果（n=3）

2.3.2 水分? 分別取3批樣品各3袋，按《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄IXH水分測(cè)定法第一法（烘干法）檢查，取供試品2～5 g，平鋪于干燥至恒重的扁形稱(chēng)量瓶中，厚度不超過(guò)5 mm，精密稱(chēng)定，打開(kāi)瓶蓋在100℃～105℃干燥5 h，將瓶蓋蓋好，移置干燥器中，冷卻30 min，精密稱(chēng)定，再在上述溫度干燥1 h，冷卻，稱(chēng)重，至連續(xù)兩次稱(chēng)重的差異不超過(guò)5 mg為止。根據(jù)減失的重量，計(jì)算供試品中的含水量（%）。規(guī)定水分不得超過(guò)6.0%。測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。

2.3.3 溶化性? 分別取3批樣品各3袋，加熱水200 mL，攪拌5 min，立即觀察，顆粒劑應(yīng)全部融化，允許有輕微渾濁。符合《中國(guó)藥典》2010年版一部的要求。結(jié)果見(jiàn)表3。

2.3.4 裝量差異? 分別取3批樣品各3袋，按《中國(guó)藥典》2010年版一部附錄顆粒劑項(xiàng)下檢查，分別稱(chēng)定每袋內(nèi)容物的重量，每袋裝量與標(biāo)示裝量相比較，超出裝量差異限度的不得多于2袋，并不得有1袋超出限度1倍。結(jié)果見(jiàn)表4。

表4? ?3批樣品裝量差異結(jié)果（n=3）

注：結(jié)果表明3批樣品裝量差異均小于士5%，符合藥典規(guī)定

2.4 含量測(cè)定

2.4.1 黃芪甲苷含量測(cè)定

2.4.1.1 對(duì)照品溶液的制備? 將黃芪甲苷用甲醇溶液配制成0.54 mg/mL的黃芪甲苷對(duì)照品溶液。

2.4.1.2? 供試品溶液的制備? 取自制復(fù)方健腎顆粒10 g，研缽研磨成細(xì)粉，混合均勻。稱(chēng)取細(xì)粉5 g，置于錐形瓶中，選擇100 mL甲醇作為提取溶劑，先進(jìn)行浸泡提取，提取時(shí)間2 h，再加熱回流提取，提取時(shí)間1 h。將提取液濾過(guò)，濾液蒸干，將蒸干后的物質(zhì)用10 mL水溶解，再依次用水飽和正丁醇和氨試液洗滌，保留的正丁醇液于蒸發(fā)皿中用水浴蒸干，殘?jiān)铀?0 mL使溶解，放冷后將樣品過(guò)D101大孔吸附樹(shù)脂柱（內(nèi)徑1.5 cm，長(zhǎng)12 cm），分別用水、40%乙醇、70%乙醇進(jìn)行洗脫，收集洗脫液。將洗脫液置于蒸發(fā)皿中用水浴鍋蒸干，殘?jiān)鼈溆?。用移液槍量取少量甲醇將殘?jiān)芙夂筠D(zhuǎn)移至5 mL容量瓶中，使用甲醇定容，搖勻，作為供試品溶液[18-20]。

2.4.1.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制? 分別精密移取黃芪甲苷對(duì)照品溶液，進(jìn)樣量范圍設(shè)置為：5～17.5 μL注入高效液相色譜儀，記錄峰面積，以黃芪甲苷進(jìn)樣量（μg）的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)（X），峰面積的對(duì)數(shù)值為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為log（Y）=1.419log（X）+4.0412，R2=0.9993，表明其在2.70～9.45 μg內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.4.1.4? 精密度試驗(yàn)? 將2.4.1.1 下配制的黃芪甲苷對(duì)照品溶液精密吸取10 μL，注入液相色譜儀，計(jì)算峰面積，連續(xù)進(jìn)樣6針，RSD為2.82%，表明本儀器的精密度良好。

2.4.1.5 重復(fù)性試驗(yàn)? 按照復(fù)方健腎顆粒的處方工藝制備成6批顆粒，按照供試品溶液相同的方法進(jìn)行處理，制備樣品溶液。設(shè)置進(jìn)樣的樣品量為10 μL，每份樣品均進(jìn)樣1次。注入液相色譜儀，計(jì)算色譜峰面積，RSD為1.79%，表明本實(shí)驗(yàn)使用的方法制備的黃芪甲苷重復(fù)性良好。

2.4.1.6 穩(wěn)定性試驗(yàn)? 精密吸取2.4.1.2項(xiàng)制備的黃芪甲苷供試品溶液20 μL，在24 h內(nèi)不同的時(shí)間點(diǎn)將對(duì)照品溶液注入高效液相色譜儀，記錄各時(shí)間點(diǎn)的峰面積，RSD為2.21%，表明復(fù)方健腎顆粒溶液中黃芪甲苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.4.1.7 加樣回收率試驗(yàn)? 精密吸取2.4.1.2項(xiàng)制備的供試品溶液，取6份于6個(gè)容量瓶中，分別加入黃芪甲苷對(duì)照品溶液0.27 mg，搖勻，用甲醇溶液定容至刻度，將樣品用0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，6份溶液各均取過(guò)濾后的樣品7.5 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，結(jié)果可知黃芪甲苷的平均加樣回收率為100.45%， RSD值為2.81%，表明該方法穩(wěn)定可行。結(jié)果見(jiàn)表5。

2.4.1.8 復(fù)方健腎顆粒中黃芪甲苷含量測(cè)定? 取自制的復(fù)方健腎顆粒3批（20151116～20151118），均按照供試品溶液的操作方法處理復(fù)方健腎顆粒，精密吸取適量樣品溶液（在標(biāo)準(zhǔn)曲線范圍內(nèi)的量）注入液相色譜儀，記錄色譜圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算黃芪甲苷含量為0.0445%。考慮到各種外界因素會(huì)影響含量，含量限度規(guī)定是均值的80%，故本實(shí)驗(yàn)暫定復(fù)方健腎顆粒中黃芪甲苷含量限度為0.0356%。結(jié)果見(jiàn)圖1、圖2、表6。

2.4.2 腺苷含量測(cè)定? 本課題采用HPLC測(cè)定蟬花藥材及復(fù)方健腎顆粒中腺苷的含量，色譜條件如下：色譜柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱（5 μm，150×4.6 mm）;流動(dòng)相：0.01 mol/L磷酸二氫鉀溶液;甲醇=90：10;檢測(cè)波長(zhǎng)：260 nm;流速：1.0 mL/min;柱溫：30℃;進(jìn)樣量：20 μL。

2.4.2.1 對(duì)照品溶液的配制? 精密稱(chēng)取腺苷標(biāo)準(zhǔn)品1.57 mg至25 mL容量瓶中，用10%甲醇溶解，定容，搖勻，制備成62.8 μg/mL的對(duì)照品溶液作為母液。

2.4.2.2 供試品溶液的配制? 精密稱(chēng)取復(fù)方健腎顆粒1 g于錐形瓶中，加入10%甲醇20 mL，稱(chēng)重，超聲處理30 min，用10%甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，過(guò)濾，用0.452 μm微孔濾膜過(guò)濾，即為樣品溶液[21-22]。

2.4.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制? 分別從母液中移取0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mL對(duì)照品溶液于10 mL容量瓶中，使用10%甲醇定容，搖勻，取20 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，以腺苷峰面積A對(duì)濃度C（μg/mL）進(jìn)行線性回歸?；貧w方程為：Y=74.354x+14.256，R2=0.9993，表明腺苷在0.628～7.536 μg/mL峰面積與濃度線性關(guān)系良好。

2.4.2.4精密度? ? 取2.4.2.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液20 μL注入液相色譜儀，高效液相色譜儀設(shè)置進(jìn)樣6針，記錄峰面積，RSD為2.18%，表明精密度良好。

2.4.2.5 重復(fù)性? 精密稱(chēng)取復(fù)方健腎顆粒1 g，平行6份，加入10%甲醇20 mL，稱(chēng)重，超聲處理30 min，用10%甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，過(guò)濾，取20 μL注入液相色譜儀，記錄峰面積，RSD為2.14%，表明重復(fù)性良好。

2.4.2.6 穩(wěn)定性? 取2.4.2.5項(xiàng)下溶液同法操作在第0、1、2、3、4、5、6 h時(shí)間內(nèi)測(cè)定供試品溶液的峰面積，RSD為2.63%，表明腺苷在6 h內(nèi)比較穩(wěn)定。

2.4.2.7 加樣回收率試驗(yàn)? 取已知含量的復(fù)方健腎顆粒溶液9份至5 mL容量瓶中，分別加入供試品溶液的80%、100%、120%的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，滴管吸取10%定容至刻度，搖勻，設(shè)置進(jìn)樣量為20 μL，將樣品注入液相色譜儀，計(jì)算平均回收率為97.71%，RSD為1.95%。結(jié)果見(jiàn)表7，可知加樣回收率符合要求。

2.4.2.8 復(fù)方健腎顆粒中腺苷含量測(cè)定? 取復(fù)方健腎顆粒1 g，平行3批，精密稱(chēng)定，加入10%甲醇20 mL，稱(chēng)重，超聲提取30 min，用10%甲醇補(bǔ)足重量，搖勻，過(guò)濾，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，取20 μL注入液相色譜儀，記錄色譜圖，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算腺苷含量為0.00627%?？紤]到各種外界因素作用會(huì)導(dǎo)致含量變化，含量限度規(guī)定是均值的80%，故本實(shí)驗(yàn)暫定復(fù)方健腎顆粒中腺苷含量限度為0.005%。結(jié)果見(jiàn)圖3、圖4、表8。

3討論

薄層點(diǎn)樣時(shí)，需要用鉛筆劃定供試品溶液、對(duì)照藥材或?qū)φ掌啡芤?，陰性?duì)照溶液的點(diǎn)樣位置，在劃定過(guò)程中不要太用力，防止破壞硅膠，影響點(diǎn)樣效果。薄層色譜展開(kāi)時(shí)，需要將展開(kāi)劑于展開(kāi)缸預(yù)飽和20～30 min，點(diǎn)樣時(shí)應(yīng)使斑點(diǎn)盡可能小，并且每次點(diǎn)樣盡可能在同一位置，需要做到多次少量點(diǎn)樣的原則，也可使用外界工具如吹風(fēng)機(jī)或者洗耳球使樣品溶液在短時(shí)間內(nèi)揮干，薄層板置于展開(kāi)缸中飽和30 min后再上行展開(kāi)。在噴灑顯色劑的過(guò)程中，顯色劑的量太少，則斑點(diǎn)顯色不清楚。若顯色劑的量過(guò)多，硅膠板容易出現(xiàn)碳化現(xiàn)象，故顯色劑需適量。

在黃芪甲苷的供試品處理過(guò)程中，多次需要使用水飽和正丁醇進(jìn)行振搖提取，需要注意振搖不要太劇烈，防止發(fā)生乳化現(xiàn)象。

在黃芪的薄層鑒別時(shí)，點(diǎn)樣量為10～20 μL時(shí)，斑點(diǎn)出現(xiàn)偏移，后改為5 μL，薄層展開(kāi)效果較好，符合要求。

在蟬花薄層鑒別時(shí)，曾用含4%磷酸氫二鈉的羧甲基纖維素鈉溶液為黏合劑自制硅膠GF254薄層板，以甲苯-乙酸乙酯-甲醇-異丙醇-濃氨試液（12：6：3：3：1） 為展開(kāi)劑，由于展開(kāi)效果不理想，后改為市售GF254板，分別以展開(kāi)系統(tǒng)1：環(huán)己烷-三氯甲烷-乙醇-乙酸乙酯-水（4：10：1：5：2）的下層液和展開(kāi)系統(tǒng)2：正己烷-三氯甲烷-乙醇-乙酸乙酯-水（2：11：1：5：2）的下層液進(jìn)行展開(kāi)，根據(jù)展開(kāi)效果最終確定展開(kāi)系統(tǒng)1為展開(kāi)劑。

對(duì)于復(fù)方健腎顆粒的質(zhì)量控制研究中，使用HPLC-ELSD對(duì)黃芪甲苷進(jìn)行定量測(cè)定，方法精密度高、準(zhǔn)確度好，能夠?qū)S芪甲苷的含量準(zhǔn)確測(cè)定;同時(shí)使用了薄層色譜法鑒定黃芪甲苷，方法可行。使用HPLC-UV對(duì)蟬花腺苷進(jìn)行定量測(cè)定，方法學(xué)重復(fù)性好，加樣回收率符合要求，能夠?qū)ο佘蘸窟M(jìn)行高效、準(zhǔn)確測(cè)定;使用薄層色譜法鑒定腺苷成分，斑點(diǎn)清晰圓整，可用于腺苷的定性測(cè)定。本實(shí)驗(yàn)同時(shí)使用薄層色譜法和高效液相色譜法同時(shí)對(duì)黃芪甲苷以及腺苷進(jìn)行測(cè)定，質(zhì)量評(píng)價(jià)方法準(zhǔn)確且完善。

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（收稿日期：2019-10-11）