向尿路上皮細胞定向誘導分化的脂肪干細胞與小腸黏膜下層支架的生物相容性研究

王神香，高吳陽，熊少兵，熊云鶴，汪前亮

(1.三峽大學附屬仁和醫(yī)院泌尿外科，湖北宜昌 443000；2.武漢大學人民醫(yī)院泌尿外科，湖北武漢 430060)

先天性膀胱異常、感染、浸潤性膀胱腫瘤、膀胱外傷等上述疾病往往需要進行膀胱擴大成形手術或者膀胱替代治療。目前臨床上進行膀胱擴大成形手術或者膀胱替代的金標準為使用腸道進行膀胱擴大或尿流改道術[1]。但是，由于胃腸道組織與膀胱組織在結構和功能上存在明顯差異，用胃腸道組織修復膀胱并不是理想的方法，多數文獻報道了腸管代膀胱常常伴隨各種并發(fā)癥的發(fā)生[2]，如慢性反復的尿路感染、水電解質失衡、代膀胱吻合口狹窄、繼發(fā)惡性腫瘤、腸道黏液分泌以及結石形成等[3-4]。組織工程學的發(fā)展為膀胱組織的修復或重建帶來了希望，通過組織工程的方法構建具有類似膀胱組織結構的組織工程復合物進行膀胱修補，則可能避免上述問題。

尿路上皮層是被覆在膀胱腔內的具有防止尿液滲漏以及執(zhí)行黏膜免疫功能的重要屏障[5]，是尿路結構與其他組織最重要的區(qū)別所在。但是尿路上皮細胞作為一種分化成熟的細胞，在體外培養(yǎng)環(huán)境下難以大量擴增[6]。目前已有多項研究證明脂肪干細胞在體外環(huán)境下可以向尿路上皮細胞誘導分化[7]。本研究擬誘導脂肪干細胞向尿路上皮細胞分化，并將誘導后細胞與小腸黏膜下層(small intestinal submucosa,SIS)復合，評價細胞與支架材料的生物相容性，為進一步構建組織工程化組織提供實驗基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 清潔級雄性新西蘭大白兔6只，兔齡8周，體質量2.0～2.5 kg，購自湖北省預防疾控中心。所有動物處置均嚴格按照倫理審查標準執(zhí)行，符合動物倫理學要求。

1.1.2主要試劑 Ⅰ型膠原酶、胰酶、小牛血清、DMEM、雙抗、Percoll、KSFM培養(yǎng)基(Gibco公司)，抗UP1a抗體、抗CK-18抗體(Santa cruz公司)，FITC標記CD31、 FITC標記CD45、FITC標記CD29、FITC標記CD44(英國Abcam公司)，山羊抗小鼠熒光二抗(武漢谷歌生物科技有限公司)。其中尿路上皮細胞購自中國科學院細胞庫。

1.2方法

1.2.1兔脂肪干細胞的分離與培養(yǎng) 新西蘭兔進行耳緣靜脈麻醉。組織剪剪去腹股溝兔毛，用1%的消毒碘消毒腹股溝區(qū)皮膚，取無血管的脂肪組織20 g立即放置于含青霉素—鏈霉素的磷酸鹽緩沖液中。在層流超凈工作臺用無菌的眼科剪將上述脂肪組織完全剪成碎末狀。移至無菌離心管，加入濃度為0.1%的I型膠原酶進行消化，50 min后加入配置好的含胎牛血清的相同體積的L-DMEM培養(yǎng)基終止消化過程；通過目網(100和200)過濾后，將得到的濾過液移至無菌離心管中，以1 500 r/min 離心5 min，去掉上清液，PBS重懸，離心5 min，重復上述操作2次，最后用DMEM重懸制作細胞懸液。轉入10 cm培養(yǎng)皿內，置入37 ℃，飽和濕度的體積分數為5%的 CO2培養(yǎng)箱內靜置培養(yǎng)。隨后間隔2 d換液，7～10 d細胞80%左右融合即可常規(guī)胰酶消化傳代。

1.2.2兔ADSCs的流式鑒定方法 選取第3代ADSCs，并在倒置顯微鏡下觀察細胞融合達到90%時，棄掉培養(yǎng)液，并向培養(yǎng)瓶內加入0.25%的胰酶消化液(含有0.04% EDTA)，消化時間1～2 min，待細胞完全脫離瓶壁后，用等體積DMEM終止消化，1 500 r/min，離心5 min，棄上清，加入流式緩沖液離心后再次重懸，并用細胞計數板對細胞計數。取3×104細胞/mL，用4%的多聚甲醛固定30 min,使用流式緩沖液沖洗細胞2遍，每次1 min，離心后加入含有CD29、CD31、CD45、CD44一抗的流式緩沖液，在4 ℃條件下孵育1 h后用流式細胞儀檢測細胞表面標志物。

1.2.3脂肪干細胞的誘導分化 研究中選擇Transwell共培養(yǎng)小室模型，Transwell共培養(yǎng)系統由corning公司生產，分為上、下兩室，兩室之間由膜慮器隔開，膜慮器主要由一種聚碳酸酯膜構成，有不同孔徑類型，3 μm以下的孔徑細胞無法自由通過，而細胞因子等小分子物質可以自由通過。脂肪干細胞傳代到第3代，實驗過程中，將脂肪干細胞懸液以1×105/cm2密度種植于Transwell 共培養(yǎng)系統的下層，所用的培養(yǎng)基為DMEM培養(yǎng)基[含1%雙抗，10%(V/V)胎牛血清，低糖DMEM培養(yǎng)基]。同時將尿路上皮細胞以2×105/cm2種植于小室的上層，加入KSFM培養(yǎng)基，并設置下層種植脂肪干細胞，上層不種任何細胞作為實驗對照組。完成細胞分層種植后，將Transwell小室系統放置于37 ℃、CO2濃度為5%的細胞培養(yǎng)箱，間接共培養(yǎng)2周時間。

1.2.4小腸黏膜下層的制備方法 用手術方法取出兔的小腸，置于10 mmol/L PBS和0.1%疊氮鈉的混合溶液中浸泡，攪拌過夜，并用薄玻片刮去小腸黏膜層。然后將包有紗布的血管鉗揉搓的方式去除肌層及漿膜層組織，剩下小腸黏膜下層組織，PBS洗滌后繼續(xù)用0.5 mmol/L乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid,EDTA)和0.4%胰蛋白酶混合溶液在 37 ℃條件下浸泡攪拌5～10 h。用保護液(1%甲醛+ 0.2% 戊二醛保護液)交聯保護10 min。PBS漂洗后，用 1 mol/L NaCl加40 U/mL DNase溶液于37 ℃攪拌6～ 8 h。最后用4%脫氧膽酸鈉和0.1%疊氮鈉溶液浸泡和攪拌5～6 h，此過程必要時需重復1次。取少量制備的小腸黏膜下層組織進行蘇木精-伊紅染色及掃描電鏡觀察脫細胞效果，其余置于體積分數75%乙醇中消毒30 min， 冷凍干燥后密封，環(huán)氧乙烷消毒以用于后續(xù)實驗。

1.2.5誘導后脂肪干細胞種植于SIS復合培養(yǎng)及細胞相容性評估 取在Transwell共培養(yǎng)系統誘導分化14 d后的誘導后細胞，利用胰酶消化貼壁細胞，10%的胎牛血清中和后進行離心5 min，再用DMEM重懸，并通過細胞計數板計數，將細胞密度調到4×106/mL，在超凈工作臺上將上述密度的細胞懸液緩慢滴加于SF/CS支架一面，逐滴加入蓋滿整個支架材料，然后置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)4 h，促使誘導后細胞的貼壁生長，取出上述培養(yǎng)皿，在超凈工作臺中向培養(yǎng)皿繼續(xù)加入DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)基加到以剛好浸沒支架材料，立即停止滴注，小心將培養(yǎng)皿轉移至37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)，每2 d換液一次。

將兔SIS剪成直徑約1 cm的圓形小塊12 塊，PBS清洗2次后置入24孔板的其中12孔內，加 DMEM/F12完全培養(yǎng)基孵育48 h。將誘導后細胞以1.0×109/L的濃度接種到置有SIS的12孔內，其余12孔加等量同期培養(yǎng)的誘導后細胞作為對照，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。從培養(yǎng)第2 d起每天各取每組的1孔消化離心進行細胞計數，連續(xù)12 d。據兩組所得細胞數繪制細胞生長曲線，對比兩組細胞生長曲線。

1.2.6主要觀察指標 ①倒置顯微鏡下觀察第3代脂肪干細胞形態(tài)，流式檢測第3代脂肪干細胞的表面標記物；②細胞免疫熒光和Western blot 對細胞誘導后效果進行檢測；③檢測小腸黏膜下層脫細胞情況；④掃描電鏡和組織學檢測誘導后細胞和SIS復合培養(yǎng)狀況；⑤觀察分析誘導后細胞和SIS復合培養(yǎng)后的生長曲線圖。

2 結 果

2.1脂肪干細胞形態(tài)學觀察及流式細胞鑒定本實驗通過膠原酶消化法成功分離出ADSCs，6 h出現細胞貼壁生長，24 h后細胞貼壁數目明顯增多；2 d后細胞形態(tài)多樣，表現為圓形、多角形、長梭形等不一；3 d后以長梭狀細胞形態(tài)為主，可見少量不規(guī)則細胞(圖1A)，每2 d換液一次，原代細胞生長速度較緩慢，一般需要培養(yǎng)7 d，細胞的相互融合度才能達到80%，而到第10 d，細胞融合度可達到90%，倒置鏡下觀察可見細胞呈典型的紡錘樣形態(tài)，形成多個細胞集落并相互融合，細胞形態(tài)均一(圖1B)。經初次按1∶2比例傳代后，傳代后細胞增殖速度較原代細胞明顯加快，傳代細胞培養(yǎng)4～5 d即可達到80%細胞融合度，傳代過程有純化細胞能力，經傳代后脂肪干細胞的純度提高，傳至第3代細胞獲得了較高的純化，脂肪干細胞連續(xù)傳代至第10代仍然保持較好的增殖狀態(tài)。

圖1 ADCSs原代培養(yǎng)

經傳代培養(yǎng)，獲取P3代純化的細胞，用于流式術檢測表面抗原CD分子，結果顯示，細胞高表達CD29 (99.6%)、CD44 (98.2%)；低表達CD31 (1.9%)、CD45(1.6%)(圖2)。上述流式結果與間充質干細胞的表型相符合，證明我們成功獲取的是ADSCs細胞，排除了造血干細胞或者成纖維細胞。

圖2 ADCSs流式細胞術鑒定直方圖

A：ADCSs 細胞表面標志CD29 99.6%;B：ADCSs 細胞表面標志CD44 98.2%;C：ADCSs 細胞表面標志CD31 1.9%;D：ADCSs 細胞表面標志CD45 1.6%。

2.2誘導分化后細胞的特征及表型鑒定為進一步確認ADSCs誘導后分化的效果，本實驗中通過免疫熒光檢測誘導后細胞尿路上皮細胞特異性蛋白UPIa的表達，將誘導后細胞爬片行免疫熒光檢測，結果提示：未誘導分化的ADSCs不表達特異性UPIa蛋白(圖3A、B)，而進行共培養(yǎng)誘導后細胞可出現UPIa的表達(圖3C、D)。通過Western Blot檢測尿路細胞特異性蛋白UPIa的表達水平，經誘導培養(yǎng)后，誘導后細胞的尿路上皮細胞特異性蛋白UPIa表達上調，而未誘導的ADSCs這兩種特異性蛋白呈低表達狀態(tài)(圖4)，結果與免疫熒光的結果相符。上述這些結果表明，脂肪干細胞在共培養(yǎng)體系的誘導下，誘導后的細胞已向尿路上皮細胞分化，具有尿路上皮的表型。

圖3未誘導的ADSCs和誘導后細胞(ISCs)UPIa蛋白表達情況(×200)

A:未誘導分化的ADSCs胞質不表達特異性UPIa蛋白；B：DAPI顯示未誘導分化的ADSCs胞核；C：誘導后細胞胞質可出現UPIa的表達；D：DAPI顯示誘導分化的ADSCs胞核。

圖4Westernblot顯示誘導后細胞(ISCs)表達UPIa

2.3兔小腸黏膜下層(SIS)的組織學觀測結果SIS呈白色半透明狀，蘇木精-伊紅染色顯示未見細胞核的殘留，細胞外基質依然保持波浪狀的纖維形態(tài)，且能繼續(xù)維持相互交聯的狀態(tài)(圖5A)。Masson染色未見明顯的細胞核結構，藍染的纖維樣結構同HE染色相似，亦呈現出波浪分布、縱橫交錯的現象(圖5B)。電鏡下觀察SIS，SIS表面未見明顯的細胞殘留，而可見大量的纖維樣組織交錯分布，形成一種三維立體的網狀結構。纖維樣基質相互交織成孔隙樣結構(圖5C)。

圖5腸管脫細胞處理后無細胞殘留

A：SIS蘇木精-伊紅染色呈紅色細絲狀，內無細胞殘余(×100)；B：Masson染色(×200)；C：掃描電鏡下觀，可見交錯排列成網狀的白色膠原纖維，未見細胞碎裂殘片。

2.4掃描電鏡和組織學檢測誘導后細胞和SIS復合培養(yǎng)情況兔誘導后脂肪干細胞可成功種植于SIS上，倒置顯微鏡下可見SIS邊緣有細胞爬出，SIS周邊有大量細胞生長。行蘇木精-伊紅染色可見細胞散在分布于SIS表面，細胞核染色呈藍色(圖6A)。掃描電鏡觀察發(fā)現，誘導后細胞能夠均勻地平鋪于SIS上，細胞在支架表面融合良好，能夠較好地黏附于支架材料上(圖6B)。

2.5誘導后細胞與SIS的生物相容性實驗結果實驗組與對照組細胞的生長曲線基本相似，種植后3 d內細胞生長曲線相對平緩，可能為細胞的適應期，而4～10 d生長曲線變陡峭，細胞呈倍數分裂生長，11～12 d曲線又趨于平緩，可能為細胞生長達到飽和狀態(tài)，互相之間產生生長抑制。從繪制的生長曲線可推斷誘導后細胞在SIS表面能夠很好地粘附、增殖及分裂生長，說明誘導后細胞在SIS表面生長良好，兩者相容性較好(圖7)。

圖6 SIS負載誘導后細胞

A：SIS負載誘導后細胞的HE染色(×200)；B：SIS負載誘導后細胞的掃描電鏡觀察(×1 000)。

圖7 實驗組和對照組誘導后細胞的生長曲線圖

3 討 論

構建組織工程化組織主要涉及到兩個核心問題：種子細胞和支架材料。目前應用于泌尿系組織工程的細胞主要是來自自體器官的特異性細胞：尿路上皮細胞和平滑肌細胞。自體尿路上皮細胞和SMCs細胞用于泌尿系組織工程的相關研究較多，包括基礎研究和臨床研究[8]，有研究者用胰酶消化的方法獲得尿路上皮細胞[9]，經體外培養(yǎng)、擴增，然后與SIS支架復合制成細胞-支架復合移植物，再植入兔皮下觀察復合物生物相容性，術后取組織標本觀察組織再生情況，同時行免疫組化了解尿路上皮的增殖情況，研究表明尿路上皮構建組織工程可以獲得較好的效果。在臨床應用方面取得了一定成果，在2006年，ATALA[10]用膀胱穿刺活檢方法從7例脊髓脊膜突出患兒(4～19歲)膀胱組織獲取尿路上皮細胞和平滑肌細胞，并將細胞體外培養(yǎng)擴增后種植于膠原支架或膠原-PGA復合支架構建了組織工程化復合移植物，最后將復合移植物行膀胱擴大成形術，研究結果顯示平均膀胱漏尿點壓明顯下降，而膀胱容量及順應性增加，術后無尿結石形成，穿刺活檢顯示修復的膀胱結構與正常膀胱組織相似。以上兩種自體種子細胞避免了與宿主發(fā)生排斥反應。采用自體種子細胞在客觀上是理想的選擇，可以達到組織再生的要求。但自體細胞存在以下問題：①成體細胞在體外培養(yǎng)過程中增殖能力及功能逐漸減弱，出現細胞老化現象；②對于膀胱腫瘤的患者，無法獲得高純度的正常膀胱細胞；③一些先天性泌尿系疾病也可導致無法獲取大量的UCs或SMCs細胞。因此，找到一種合適的種子細胞，并能夠適用于組織工程大規(guī)模應用的需求是問題的關鍵。

ADSCs獲取于脂肪組織，同其他眾多的干細胞不同的是，ADSCs適應性強，來源極為豐富，獲取簡單，增值能力佳。本實驗即采用了膠原酶消化法進行了ADSCs的原代培養(yǎng)，也證實了這種方法的有效性和高效性。通過流式術檢測表面抗原CD分子，細胞高表達CD29 (99.6%)、CD44 (98.2%)，低表達CD31 (1.9%)、CD45(1.6%)。上述流式結果與間充質干細胞的表型相符合，證明我們成功獲取的是ADSCs細胞，排除了造血干細胞或者成纖維細胞。與其他干細胞相似的是，ADSCs分化能力強，可分化為多種細胞系。有多項研究發(fā)現ADSCs可誘導分化為多種類型的體細胞，如心肌細胞[11]、平滑肌細胞[12]、脂肪細胞[13]、軟骨細胞[14]。另外，有學者發(fā)現，ADSCs可誘導向上皮細胞方向分化。LI等[15]利用體外3D培養(yǎng)系統，通過添加表皮生長因子、角質細胞生長因子等誘導ADSCs向上皮細胞方向分化，誘導實驗后，可以發(fā)現誘導的細胞展現出分層上皮狀形態(tài)，同時可以檢測到上皮細胞特異性標志物的表達，從而證實了在特定微環(huán)境中ADSCs可被誘導向上皮細胞方向分化。ZHANG等[16]將ADSCs置入培養(yǎng)過永生化尿路上皮細胞的條件培養(yǎng)基中進行誘導培養(yǎng)和通過Transwell共培養(yǎng)系統將ADSCs與永生化尿路上皮細胞共培養(yǎng)，兩種方法誘導ADSCs分化21 d，可以檢測到相關尿路上皮細胞蛋白的表達，因此作者認為ADSCs有誘導分化為成熟尿路上皮細胞的潛力。然而，精確的分子調控ADSCs向尿路上皮細胞分化的機制還處于探索階段。本實驗誘導培養(yǎng)ADSCs后通過免疫熒光和Western blot檢測發(fā)現，誘導后的細胞在形態(tài)上向尿路上皮細胞靠近，并且能夠表達尿路上皮細胞特異性蛋白，這不僅證實了上述ADSCs具有向尿路上皮細胞方向分化的潛能，也為下一步種子細胞的種植奠定了基礎。

理想的支架材料應該具有生物兼容性，支持細胞生長，擁有三維結構，無毒性，可降解，降解產物可吸收，易塑形，有一定的強度，能調節(jié)細胞粘附、遷移、增殖和分化，同時不會誘導嚴重的炎性反應。SIS是一種天然的、以膠原蛋白為主要成分的細胞外基質，是將小腸組織的黏膜、漿膜及肌層通過機械作用進行脫離后剩下的黏膜下層組織。HURST等[17]通過免疫組化的方法分析SIS支架材料，檢測出多種生長因子的存在，包括硫酸類肝素蛋白多糖、成纖維細胞生長因子、血管內皮生長因子，但轉化生長因子并沒有被檢測出。多項研究顯示SIS能夠較好地支持細胞增殖，遷移和分化。SHUKLA等[18]分離培養(yǎng)豬骨髓間充質干細胞，并誘導其向尿路SMCs方向分化。其后將分化的細胞和未進行誘導的骨髓間充質干細胞接種到SIS，將復合物進行自體膀胱擴大術。實驗結果顯示SIS可較好地支持細胞的生長和分化，進一步有助于膀胱擴大術中膀胱組織的再生。YANG等[19]研究發(fā)現SIS內成分有促進人膀胱SMCs和人臍靜脈內皮細胞粘附、增殖、遷移的作用。

在本實驗中將誘導后的脂肪干細胞種植于SIS上，通過蘇木精-伊紅染色發(fā)現SIS表面有細胞生長，說明細胞可種植于SIS上。掃描電鏡觀察發(fā)現，誘導后細胞能夠均勻地平鋪于SIS上，細胞在支架表面融合良好，能夠較好地粘附于支架材料上。進一步將SIS剪成小塊置入24孔板的其中12孔內，接種誘導后細胞到24孔板內，通過繪制兩組細胞生長曲線圖，測得實驗組與對照組細胞的生長曲線相似，進一步說明誘導后細胞在SIS表面能夠很好地貼附、分裂生長，二者的組織相容性較好。

總之，本研究探討了脂肪干細胞向尿路上皮細胞分化的可行性，誘導后細胞表達尿路上皮細胞特有標記物，具有尿路上皮細胞表型，可作為構建泌尿系組織工程組織的種子細胞。在實驗過程中進一步探討了誘導后細胞與SIS的生物相容性，通過組織學檢查和掃描電鏡證實了細胞可以在SIS材料上粘附和生長，且實驗組與對照組具有相似的生長曲線，說明SIS有利于促進細胞增殖，無細胞毒性作用，該項研究為進一步構建泌尿系組織工程組織奠定了試驗基礎。