Claudin-14在納米細(xì)菌腎結(jié)石形成中表達(dá)的動(dòng)態(tài)研究

申茂磊，王勤章，錢 成，徐 浩，郝志強(qiáng)，李 鵬，錢 彪

(1.新疆維吾爾自治區(qū)石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院泌尿外科，新疆石河子 832000；2.解放軍69235部隊(duì)，新疆奎屯 833200)

有研究顯示，納米細(xì)菌可能是引起泌尿系結(jié)石的因素之一，在泌尿系結(jié)石的發(fā)病當(dāng)中扮演著重要的角色[1-2]。SHIEKH等[3]認(rèn)為，納米細(xì)菌可通過誘發(fā)腎臟發(fā)生慢性炎癥反應(yīng)進(jìn)而引起腎臟腎小管上皮細(xì)胞損傷鈣化，提示納米細(xì)菌引起的結(jié)石可能是含鈣結(jié)石。泌尿系結(jié)石是由多種因素相互作用所導(dǎo)致的，而尿液中的游離鈣增高與泌尿系含鈣結(jié)石形成有重要關(guān)系[4-5]。研究表明，緊密連接蛋白-14(Claudin-14)的表達(dá)增強(qiáng)可抑制腎小管對(duì)鈣離子的重吸收，從而導(dǎo)致高鈣尿，影響結(jié)石的形成[6-7]。本課題組推測Claudin-14表達(dá)異?？赡苁羌{米細(xì)菌引起結(jié)石的原因之一，通過注射納米細(xì)菌，連續(xù)10周動(dòng)態(tài)檢測Wistar雄性大鼠腎臟Claudin-14的表達(dá)情況，初步探討Claudin-14在納米細(xì)菌形成結(jié)石中的作用。

1 材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)材料無特定病原體動(dòng)物(specific pathogen free，SPF)級(jí)雄性Wistar大鼠60只，6周齡左右，體質(zhì)量(210±15)g，購自新疆醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心[合格證號(hào)SCXK(新)2013-0001]。用B超等方法確診的患者尿液培養(yǎng)而來的納米細(xì)菌懸濁液，多功能光學(xué)顯微鏡及圖像采集系統(tǒng)(BX40，日本Olympus公司)，Claudin-14抗體(Abcam公司)。

1.2方法

1.2.1大鼠腎結(jié)石模型建立及實(shí)驗(yàn)取材 參照褚浩等[8]的方法制作大鼠腎結(jié)石模型。60只SPF級(jí)Wistar雄性大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，采用隨機(jī)數(shù)字列表法分為2組，即對(duì)照組和納米細(xì)菌組，每組30只。對(duì)照組的大鼠一次性給予尾靜脈注射0.9%氯化鈉注射液1.2 mL，納米細(xì)菌組大鼠一次性給予尾靜脈注射納米細(xì)菌懸濁液1.2 mL。兩組Wistar雄性大鼠注射后的1～10周每周處死3只，收集左右雙側(cè)腎臟待測。

1.2.2病理學(xué)檢查 水合氯醛麻醉處死實(shí)驗(yàn)大鼠，手術(shù)切取雙側(cè)腎，兩側(cè)腎臟各取一部分用甲醛溶液固定，石蠟包埋后切片行常規(guī)蘇木精-伊紅染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)染色，普通光學(xué)顯微鏡下觀察腎組織形態(tài)學(xué)變化及腎小管區(qū)有無結(jié)石結(jié)晶，以判斷腎結(jié)石模型是否成功建立。按照安瑞華等[9]提供的判定腎臟結(jié)石標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)：0級(jí)判為陰性結(jié)果；Ⅰ～Ⅳ級(jí)判為陽性結(jié)果；若雙側(cè)腎臟同時(shí)出現(xiàn)陽性結(jié)果時(shí)，僅計(jì)1次。統(tǒng)計(jì)1～10周后兩組Wistar雄性大鼠腎臟晶體顆粒陽性情況。

1.2.3實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)檢測Clanudin-14mRNA表達(dá) 獲取大鼠腎臟組織后，在超凈臺(tái)下剪取約100 mg腎臟組織，放置于1.5 mL無酶離心管中；經(jīng)Trizol裂解以及3次4 ℃高速離心后，冰上空干，加入20 μL焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate，DEPC)水，利用核酸蛋白檢測儀測定RNA濃度并配平，以cDNA為模版按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，放入-20 ℃冰箱中備用， PCR反應(yīng)采用20 μL體系，反應(yīng)條件95 ℃×1 min,預(yù)變性，95 ℃×15 s，60 ℃×30 s，72 ℃×30 s，一共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品重復(fù)3次進(jìn)行定量。結(jié)果用3次測定平均Ct值來表示。所用引物序列見表1。

1.2.4免疫組化檢測Clanudin-14蛋白表達(dá) 取病理鑒定模型成功的另一部分腎臟用于做免疫組化。免疫組化采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結(jié)(streptavidin-perosidase，SP)法，石蠟包埋后切片4 μm，常規(guī)脫蠟， H2O2處理清除內(nèi)源性過氧化物酶，枸緣酸緩沖液抗原修復(fù)，血清封閉。滴加Clanudin-14抗體(1∶200)，4 ℃孵育過夜，滴加二抗，二氨基聯(lián)苯胺(dimoinobenzidine，DAB)顯微鏡下控制顯色，蘇木素復(fù)染，不同濃度乙醇和二甲苯脫水，樹膠封片，顯微鏡下觀察1～10周兩組Wistar雄性大鼠腎臟Clanudin-14免疫組織化學(xué)染色情況。

表1用PrimerPremier5.0軟件設(shè)計(jì)引物，內(nèi)參、緊密連接蛋白-14引物序列

基因引物序列內(nèi)參上游序列CAACCTTCTTGCAGCTCCTC下游序列CGGTGTCCCTTCTGAGTGTT緊密連接蛋白-14上游序列CTCTGCATGGTGGCTGTCT下游序列GGAGATGAAGCCGAGGTACA

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)方法采用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)數(shù)資料比較采用兩獨(dú)立樣本比較的Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)，計(jì)量資料采用均數(shù)加減標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較用t檢驗(yàn)。P≤0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1病理組織學(xué)檢查1～3周納米細(xì)菌組未發(fā)現(xiàn)晶體顆粒沉積，第4周以后納米細(xì)菌組Wistar雄性大鼠腎小管內(nèi)發(fā)現(xiàn)晶體顆粒沉積，且主要分布于近、遠(yuǎn)曲小管，晶體顆粒大多呈零星散在分布，少部分晶體互相連接成片狀分布。第1～10周，對(duì)照組Wistar雄性大鼠腎臟內(nèi)未見晶體顆粒沉積(圖1)。1～10周，納米細(xì)菌組Wistar雄性大鼠腎臟晶體顆粒陽性11只(50%)，因納米細(xì)菌組Wistar雄性大鼠在第4周開始成石，而前3周已處死的Wistar雄性大鼠也存在結(jié)石的可能，所以在計(jì)算成石率時(shí)將前兩周已處死的大鼠排除在大鼠總計(jì)數(shù)之外，對(duì)照組均為陰性。納米細(xì)菌組Wistar雄性大鼠腎臟晶體顆粒陽性率高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.001，表2)。

表2兩組Wistar雄性大鼠腎組織結(jié)晶分級(jí)(例)

組別n0ⅠⅡⅢⅣ成石率(%)納米細(xì)菌組2211641050對(duì)照組303000000

納米細(xì)菌組與對(duì)照組相比，P<0.05。

圖1兩組Wistar雄性大鼠第8周腎臟組織HE染色圖(HE，×100)

A：對(duì)照組；B：納米細(xì)菌組。

2.2qRT-PCR檢測腎組織Clanudin-14mRNA表達(dá)結(jié)果第1～3周Claudin-14 mRNA在納米細(xì)菌組中幾乎未見表達(dá)，第4～10周納米細(xì)菌組中Claudin-14 mRNA表達(dá)量增多并且較對(duì)照組明顯增多(P<0.05，圖2)。

2.3腎組織Clandin-14蛋白免疫組化檢查結(jié)果由2位病理科老師共同鑒定。普通光學(xué)顯微鏡下可觀察顯示：1～3周Claudin-14蛋白在納米細(xì)菌組中幾乎未見表達(dá)，從第4周起納米細(xì)菌組中Claudin-14表達(dá)強(qiáng)度逐漸增強(qiáng)并且表達(dá)強(qiáng)度較對(duì)照組增高，同樣呈棕褐色集中分布在腎小管上皮細(xì)胞的細(xì)胞膜上，1～10周Claudin-14在對(duì)照組中幾乎未見表達(dá)(圖3)。

圖2 兩組Wistar雄性大鼠腎臟組織Claudin-14mRNA的表達(dá)

3 討 論

泌尿系結(jié)石是泌尿外科住院患者中最常見的病因，其中腎結(jié)石是最常見的病因之一。腎結(jié)石發(fā)病率及流行率在世界范圍內(nèi)有增加的趨勢，有研究顯示可能與肥胖、Randall斑塊、骨橋蛋白、性別、年齡、種族密切相關(guān)[10-14]，但其發(fā)病機(jī)制仍不明確。大量研究顯示納米細(xì)菌在泌尿系結(jié)石形成中扮演重要的角色[15-19]。納米細(xì)菌是KAJANDER等[20]在調(diào)查牛血清培養(yǎng)失敗時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)的，在特殊的培養(yǎng)條件下，產(chǎn)生了一種具有細(xì)胞毒性作用的生物被膜，這種生物被膜包含了一種革蘭染色陰性顆粒，其基因序列為16sr RNA。這些顆粒被命名為“納米細(xì)菌”。納米細(xì)菌是革蘭氏陰性菌，其直徑大約為80～500 nm，約為普通細(xì)菌的1%。納米細(xì)菌一般呈球狀樣或球桿狀樣，有較厚的細(xì)胞壁，無鞭毛和莢膜。因此本課題組推測納米細(xì)菌在泌尿系結(jié)石的形成過程中可能起到了病因?qū)W作用，但是以往研究都只是用腎結(jié)石患者尿液或者結(jié)石培養(yǎng)出納米細(xì)菌或者通過鼠尾靜脈注射納米細(xì)菌誘導(dǎo)結(jié)石形成，但是納米細(xì)菌引起結(jié)石具體作用機(jī)制仍不清楚且未進(jìn)行動(dòng)態(tài)觀察研究。近年來眾多學(xué)者對(duì)Claudin-14的研究為我們研究納米細(xì)菌的作用機(jī)制提供了新思路。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示第4周以后納米細(xì)菌組Wistar雄性大鼠腎小管內(nèi)發(fā)現(xiàn)晶體顆粒沉積，而對(duì)照組Wistar雄性大鼠未見上述改變；且納米細(xì)菌組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明納米細(xì)菌確實(shí)能夠引起結(jié)石的形成。Claudin-14作為緊密連接蛋白家族的一員，嚴(yán)格定位于腎臟的髓袢升支粗段(thick ascendinglimb,TAL)[21]，是構(gòu)成TAL細(xì)胞旁途徑的重要組成蛋白，可通過調(diào)節(jié)細(xì)胞旁途徑的緊密連接蛋白-16(Claudin-16)和緊密連接蛋白-19(Claudin-19)構(gòu)成的雜聚肽陽離子通道滲透率來影響腎小管對(duì)鈣的重吸收[22-24]。腎臟對(duì)于鈣離子排泄是極為重要的，以此來穩(wěn)定血鈣水平，Claudin-14作為腎臟排泄鈣離子的重要影響因子，在此過程中扮演極其重要的作用[25]。qRT-PCR和免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示：納米細(xì)菌組Claudin-14基因和蛋白從第4周起表達(dá)水平增高并且較對(duì)照組明顯增多。其升高機(jī)制可能是納米細(xì)菌激活位于近端腎單位的基底外側(cè)的血漿細(xì)胞膜上的鈣敏感受體(calcium sensitive receptor，CaSR)，而升高的CaSR可通過調(diào)節(jié)位于TAL的Claudin-14的表達(dá)來增強(qiáng)CaSR-Claudin-14通道的功能，抑制腎小管對(duì)鈣離子的重吸收，從而導(dǎo)致高鈣尿，影響結(jié)石的形成[6-7]。這表明Claudin-14表達(dá)增強(qiáng)可能在納米細(xì)菌結(jié)石形成中起重要作用。與以往乙二醇建立腎結(jié)石模型觀察Claudin-14的表達(dá)相比較，本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用納米細(xì)菌建立腎結(jié)石模型，動(dòng)態(tài)觀察Claudin-14的表達(dá)。

綜上所述，Wistar雄性大鼠在注射納米細(xì)菌4周后，Claudin-14的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，可能是納米細(xì)菌通過調(diào)控Claudin-14的表達(dá)，抑制腎小管對(duì)鈣離子的重吸收，增加尿鈣，促進(jìn)結(jié)石的形成。但是納米細(xì)菌是如何影響Claudin-14的表達(dá)，其具體作用機(jī)制仍有待進(jìn)一步深入研究。