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    地鱉肽對H2O2刺激雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響

    2019-02-22 05:39:46李靜怡徐小艾晁雨竹李向東張永紅
    關(guān)鍵詞:貼壁骨骼肌活力

    李靜怡,徐小艾,晁雨竹,李向東,沈 紅*,張永紅*

    (1.北京農(nóng)學(xué)院動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/動物類國家級實驗教學(xué)示范中心(北京農(nóng)學(xué)院)/北京農(nóng)學(xué)院獸醫(yī)學(xué)(中醫(yī)藥)北京市重點實驗室,北京 102206;2.中國科學(xué)院動物研究所,北京 100101)

    肌肉是畜禽胴體的重要組成部分,肌纖維是骨骼肌的基本單位。動物骨骼肌纖維數(shù)目在出生前已確定,出生后骨骼肌發(fā)育和肌肉的再生主要依賴于肌衛(wèi)星細(xì)胞[1]。當(dāng)機體受到外界刺激(損傷、鍛煉等)時,處于靜息狀態(tài)的骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞就會被激活,從肌纖維肌膜與基底膜之間游離出來,經(jīng)歷增殖和定向分化形成完整的新的肌纖維或修復(fù)受損肌纖維[2]。衛(wèi)星細(xì)胞從靜止?fàn)顟B(tài)到被激活的過程中,受到眾多因子及信號通路的精準(zhǔn)調(diào)控,其中主要調(diào)控因子包括Pax3/7、生肌調(diào)節(jié)因子(Myogenic Regulatory Factors,MRFs)家族等。增殖調(diào)控因子Pax7對肌衛(wèi)星細(xì)胞靜息狀態(tài)中的自我更新、肌肉形成、損傷后修復(fù)等過程中都起重要作用,Pax7在胚胎發(fā)育期的缺乏會導(dǎo)致肌衛(wèi)星細(xì)胞數(shù)量大量減少[3]。此外,Pax7作為肌衛(wèi)星細(xì)胞特異性標(biāo)志之一,可通過免疫熒光等方法用于衛(wèi)星細(xì)胞的鑒定。MRFs家族在肌肉發(fā)育、分化和功能完善的各個環(huán)節(jié)都發(fā)揮調(diào)控作用,包括MyoD、Myf5、myogenin和MRF4[4]。Myf5和MyoD作為肌細(xì)胞增殖期的標(biāo)志,二者的表達(dá)代表肌衛(wèi)星細(xì)胞處于活化狀態(tài)[5]。研究骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖分化過程對提高動物產(chǎn)肉能力及肉品質(zhì)具有非常重要的意義。

    地鱉(EupolyphagasinensisWalker, ESW)作為中國傳統(tǒng)中藥材,具有藥食兼用的特性[6]?,F(xiàn)代藥理學(xué)研究證明地鱉具有廣泛的藥理作用,但對于其有效活性成分的深入研究還相當(dāng)薄弱[7]。地鱉富含蛋白質(zhì),其酶解產(chǎn)物多肽具有一定的抗氧化活性,但研究還較為淺顯,有關(guān)作用機制的研究及對其他動物的作用仍未見報道。本試驗通過體外分離培養(yǎng)雞胸肌衛(wèi)星細(xì)胞,建立H2O2刺激細(xì)胞模型,分析肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖及調(diào)控基因的相對表達(dá),初步探討地鱉肽(ESWP)對H2O2刺激下衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響,以期為研究地鱉肽在肌肉發(fā)育中的功能提供試驗依據(jù)。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    Ⅰ型膠原酶、胰蛋白酶、DAPI等購自北京索萊寶科技有限公司,鼠抗雞Pax7單克隆抗體購自美國Santa Cruze公司,F(xiàn)ITC-羊抗鼠IgG購自武漢博士德生物科技有限公司,TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit 購自北京艾德萊生物科技有限公司,SYBR? Premix Ex TaqTM(TliRnaseH Plus)(RR420A)購自日本TaKaRa公司,所用引物由華大科技公司合成。熒光倒置顯微鏡購于日本Olympus公司,全自動酶聯(lián)免疫檢測儀和核酸蛋白測定儀購于美國Merinton公司,熒光PCR儀購自美國Applied Biosystems公司。1日齡雛雞購自北京富佳種禽中心。

    1.2 方法

    1.2.1 雞胸肌衛(wèi)星細(xì)胞(SCs)分離純化與鑒定 1日齡雛雞心臟采血處死,酒精浸泡后置于超凈臺中,取其胸部肌肉PBS洗滌,剔除血管和脂肪等,用剪刀將其剪至肉糜狀,分別加入Ⅰ型膠原酶和胰蛋白酶消化,然后加入等體積完全培養(yǎng)基終止消化,過細(xì)胞篩后收集離心并重懸細(xì)胞,加入培養(yǎng)皿中置于培養(yǎng)箱培養(yǎng)備用。

    采用差速貼壁法去除細(xì)胞懸液中的成纖維細(xì)胞,將細(xì)胞加入細(xì)胞板內(nèi),待細(xì)胞貼壁后用PBS清洗,4%多聚甲醛固定,加入0.1% TritonX-100靜置10 min,10%山羊血清室溫封閉,棄上清,加入一抗Pax7,4℃過夜,加入FITC標(biāo)記的二抗,37℃避光孵育1 h,加入DAPI染色液,避光孵育5 min,PBS沖洗后,熒光倒置顯微鏡下觀察及拍照。

    1.2.2 MTT法檢測細(xì)胞存活情況 SCs細(xì)胞貼壁密度達(dá)80%~90%左右,收集細(xì)胞加入含有不同濃度地鱉肽(0、50、100、200、400 μg/mL),96孔板培養(yǎng)細(xì)胞24 h,然后加入不同濃度H2O2(0、50、100、200、300、400、500 μmol/L),繼續(xù)培養(yǎng)2、4、8、16 h。每孔加入MTT 37℃避光培養(yǎng)4 h后棄去上清液,每孔加入DMSO后振蕩,置于酶標(biāo)儀570 nm處測吸光度值,計算細(xì)胞存活率。

    1.2.3 RT-PCR檢測增殖因子表達(dá)水平 試驗分為對照組、H2O2組和地鱉肽組。地鱉肽處理細(xì)胞培養(yǎng)24 h后,除對照組外,其余各組加入200 μmol/L H2O2刺激細(xì)胞8 h,然后每孔加入1 mL Trizol試劑,收集細(xì)胞懸液到EP管并加入0.2 mL氯仿,劇烈震蕩后靜置,4℃ 12 000 r/min離心15 min,將上層透明水相層吸到新EP管中,加入0.5 mL異丙醇,靜置后離心棄上清,75%乙醇(DEPC水配制)洗3次,空氣中干燥,加入少量DEPC水,溶解RNA并混勻,核酸蛋白測定儀檢測RNA濃度和OD260/280值。

    按照TUREscript 1st Strand cDNA Synthesis Kit說明,制備20 μL反應(yīng)體系,RNA模板3 μL、Oligo(dT)18 1 μL、Rtase 0.8 μL、5×RTRraction Mix 4 μL、Rnase free H2O 補齊20 μL,置于PCR儀內(nèi)進行反轉(zhuǎn)錄,42℃ 50 min、65℃ 15 min、4℃維持,即得cDNA。

    建立20 μL PCR反應(yīng)體系:cDNA 2 μL、上下引物各1 μL、SYBR Premix Ex Taq(2×)10 μL、ROX Reference Dye (50×) 0.4 μL、滅菌蒸餾水5.6 μL,反應(yīng)條件為95℃ 30 s,95℃ 5 s,49~57℃(引物最適溫度)30 s,95℃ 15 s,60℃ 1 min,95℃ 15 s,共40個循環(huán)。采用Step One Software v2.1分析PCR數(shù)據(jù),按2-ΔΔCt法分析基因相對表達(dá)量。引物根據(jù)GenBank中的序列用Primer5.0軟件設(shè)計,由北京華大科技有限公司合成(表1)。

    表1 SYBR real-time PCR 反應(yīng)引物序列Tab.1 Sequences of the primers in SYBR real-time PCR

    1.2.4 統(tǒng)計分析 試驗數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示,先用Microsoft Excel作初步整理,然后使用Graph pad Prism6.0軟件進行方差分析,差異顯著時進行LSD各組間多重比較,P<0.05為差異顯著,P<0.01為差異極顯著。

    2 結(jié) 果

    2.1 肌衛(wèi)星細(xì)胞分離培養(yǎng)與鑒定

    采用兩步酶消化法分離獲得肌衛(wèi)星細(xì)胞,差速貼壁法純化細(xì)胞,倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài),結(jié)果剛分離的P0代肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)24 h后開始貼壁,為梭形或紡錘形(圖1A);繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞48 h貼壁完全,細(xì)胞數(shù)目不斷增多、相互接觸并聯(lián)結(jié)成網(wǎng);隨著細(xì)胞培養(yǎng)時間的延長,細(xì)胞逐漸匯合并有規(guī)律平行排列,直至形成分布均勻的單層細(xì)胞;細(xì)胞傳代培養(yǎng)后形態(tài)飽滿且折光性較強(圖1B);細(xì)胞凍存復(fù)蘇后培養(yǎng)細(xì)胞在形態(tài)上無明顯差異(圖1C)。Pax7是肌衛(wèi)星細(xì)胞靜息期和增殖期表達(dá)標(biāo)志基因,采用細(xì)胞免疫化學(xué)染色肌衛(wèi)星細(xì)胞檢測基因,結(jié)果陽性細(xì)胞細(xì)胞核表達(dá)Pax7,DAPI染核疊加觀察肌衛(wèi)星細(xì)胞Pax7陽性率可達(dá)95%以上(圖2)。

    圖1 原代肌衛(wèi)星細(xì)胞培養(yǎng)過程中的細(xì)胞形態(tài)(A、B、C分別為P0代、P1代、復(fù)蘇的肌衛(wèi)星細(xì)胞;100×)Fig.1 Cell morphological state during primary SCs culture (ABC mean P0, P1 SCs and recovery SCs.100×)

    圖2 肌衛(wèi)星細(xì)胞免疫熒光染色鑒定(100×)Fig.2 Immunofluorescence staining of muscular satellite cells (100×)

    2.2 不同處理條件對肌衛(wèi)星細(xì)胞活力的影響

    采用MTT法檢測不同時間不同濃度H2O2對SCs細(xì)胞活力的影響,結(jié)果隨著H2O2濃度的增加,細(xì)胞活力逐漸降低,當(dāng)H2O2濃度為200 μmol/L時刺激細(xì)胞8 h其活力顯著降低為65.16%,此時細(xì)胞受損但并未大量死亡,后續(xù)試驗選取H2O2作用條件為200 μmol/L為受處理細(xì)胞8 h(圖3)。地鱉肽在50~200 μg/mL范圍內(nèi)單獨處理肌衛(wèi)星細(xì)胞,其對細(xì)胞活力影響不明顯,但濃度在400 μg/mL時細(xì)胞活力稍有下降但差異不顯著(圖4A);當(dāng)?shù)伧M肽濃度在50~200 μg/mL時預(yù)處理細(xì)胞,然后200 μmol/L H2O2刺激細(xì)胞8 h,此時細(xì)胞活力從77.73%升高至83.89%,與H2O2組相比差異極顯著,且地鱉肽劑量依賴性緩解H2O2導(dǎo)致的細(xì)胞活力下降(圖4B)。

    圖3 不同濃度H2O2作用不同時間對肌衛(wèi)星細(xì)胞活力的影響(與0 μmol/L相比,*P<0.05,** P<0.01)Fig.3 Effects of different concentrations of H2O2 on the viability of SCs cells at different time(Note: Compared with 0 μmol/L, * P<0.05, ** P<0.01)

    圖4 地鱉肽對雞衛(wèi)星細(xì)胞活力的影響(與對照組相比**P<0.01;與H2O2組相比++P<0.01,+P<0.05)Fig.4 Effects of ESWP on the viability of chicken satellite cells viability (Compared with the control group, **P<0.01.Compared with H2O2 group, ++P<0.01, + P<0.05)

    2.3 地鱉肽對H2O2刺激后肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖因子表達(dá)的影響

    RT-PCR檢測地鱉肽對H2O2刺激后肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖因子表達(dá),結(jié)果與正常組相比,H2O2顯著降低細(xì)胞中Pax7、Myf5和MyoD基因的相對表達(dá)量;與H2O2組相比,不同濃度地鱉肽預(yù)處理細(xì)胞可不同程度的促進增殖因子基因表達(dá),其中低濃度地鱉肽顯著增加Pax7和MyoD基因表達(dá)量,Myf5基因表達(dá)稍有增加,但不具有顯著性差異;中濃度地鱉肽組細(xì)胞內(nèi)基因表達(dá)均有顯著提高,高濃度地鱉肽組MyoD基因表達(dá)量顯著高于H2O2組(圖5)。

    3 討 論

    出生后骨骼肌組織中的成肌細(xì)胞是以肌衛(wèi)星細(xì)胞的形式存在,肌衛(wèi)星細(xì)胞是肌組織的前體細(xì)胞,在骨骼肌的生長、發(fā)育、損傷及移植中具有重要作用。已經(jīng)報道有多種分離純化骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞的方法,包括肌組織塊酶消化、直接分離單根肌纖維培養(yǎng)和根據(jù)細(xì)胞表面分子標(biāo)志的流式細(xì)胞和免疫磁珠分選等[8, 9],本試驗采用酶消化法獲得肌衛(wèi)星細(xì)胞。肌衛(wèi)星細(xì)胞處于肌膜與基底膜之間,細(xì)胞連接緊密,普通的單種酶處理沒有辦法完全釋放它,所以必須首先將基膜分解[10]。I型膠原酶可消化組織中連接部分使其成為單個細(xì)胞,之后再用胰蛋白酶使肌衛(wèi)星細(xì)胞從肌纖維上充分解離,分離的肌衛(wèi)星細(xì)胞中混有大量成纖維細(xì)胞,通過差速貼壁法對肌衛(wèi)星細(xì)胞進行純化[11, 12]。本試驗采用兩步酶消化法,三次差速貼壁后能獲得陽性率在95%以上的肌衛(wèi)星細(xì)胞(SCs)。

    注:ABC分別為Pax7、MyoD和Myf5基因;與對照組相比**P<0.01;與H2O2組相比++P<0.01,+P<0.05。Note: A B CmeanPax7; MyoDand Myf5gene respectively; Compared with the control group, **P<0.01. Compared with H2O2 group, ++ P<0.01, + P<0.05.圖5 地鱉肽對H2O2刺激肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖的影響Fig.5 Effect of ESWP on the proliferation of chicken satellite cells stimulated by H2O2

    肌衛(wèi)星細(xì)胞可以通過特殊的分子標(biāo)記物來鑒定,標(biāo)志性基因有Pax7、M-Cadherin、Desmin、MyoD等[13, 14]。本試驗中選用Pax7單克隆抗體,用間接法對肌衛(wèi)星細(xì)胞靜息期和增殖期特異表達(dá)的標(biāo)志蛋白Pax7進行細(xì)胞免疫化學(xué)染色,結(jié)果Pax7在胞核染色呈陽性,表明分離培養(yǎng)獲得骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞。MRFs家族是啟動和維持骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分化、發(fā)育和生長的一個主要調(diào)控基因家族,在骨骼肌的生長、發(fā)育、損傷及修復(fù)中具有重要作用,Myf5和MyoD是肌細(xì)胞增殖期的標(biāo)志,只在激活的肌衛(wèi)星細(xì)胞中表達(dá),能將多種類型細(xì)胞轉(zhuǎn)化為成肌細(xì)胞,并調(diào)控MyoG促使成肌細(xì)胞融合為肌管[15]。Calor等對小鼠衛(wèi)星細(xì)胞永生化得來的細(xì)胞株C1C12進行病理性缺氧處理,結(jié)果缺氧能顯著抑制MyoD、Myf5和myogenin的表達(dá),阻斷細(xì)胞分化等生命進程[16]。本試驗發(fā)現(xiàn)H2O2刺激會引起肌衛(wèi)星細(xì)胞內(nèi)Pax7、MyoD和Myf5基因表達(dá)的降低,地鱉肽的添加能緩解這一影響,促進受損細(xì)胞的增殖過程。

    本研究通過兩步酶消化法體外分離獲得雞骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(SCs),肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖期表達(dá)標(biāo)志基因Pax7的陽性細(xì)胞率達(dá)95%以上。

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