冷鮮豬肉中單增李斯特菌快速檢測(cè)試紙條的初步研制

趙 鑫,張 帥,祁文婧,齊穎穎,張紅星

(北京農(nóng)學(xué)院食品科學(xué)與工程學(xué)院/食品質(zhì)量與安全北京實(shí)驗(yàn)室/北京市食品安全免疫快速檢測(cè)工程技術(shù)研究中心/微生態(tài)制劑關(guān)鍵技術(shù)開(kāi)發(fā)北京市工程實(shí)驗(yàn)室，北京102206)

單增李斯特菌(Listeriamonocytogenes, LM)是革蘭氏陽(yáng)性菌，無(wú)芽孢和莢膜，具有很強(qiáng)的環(huán)境耐受力，在弱酸性、中性乃至弱堿性條件下皆可存活，其生長(zhǎng)溫度范圍可達(dá)0～50℃，具有低溫存活生長(zhǎng)性，因此，單增李斯特菌是為數(shù)不多的低溫致病菌之一[1,2]。

單增李斯特菌已成為繼大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌的第四大食源性致病菌，它在自然界中廣泛存在，能對(duì)水源、飼料及各類(lèi)食品造成污染，尤其是冷藏食品[3]。單增李斯特菌污染的食物會(huì)導(dǎo)致細(xì)菌性食物中毒，感染者會(huì)出現(xiàn)嘔吐、腹痛等常見(jiàn)癥狀，嚴(yán)重時(shí)可引發(fā)嬰兒化膿性腦膜炎、成人敗血癥和孕婦流產(chǎn)等李斯特氏菌病[4]。

為降低單增李斯特菌對(duì)人類(lèi)健康的威脅，國(guó)內(nèi)外學(xué)者進(jìn)行許多針對(duì)性的研究，如添加細(xì)菌素等安全的新型天然防腐劑、采用現(xiàn)代物理化學(xué)聯(lián)合殺菌技術(shù)、研究綠色包裝材料等。此外，對(duì)食品安全性的檢測(cè)也是其中重要的一環(huán)。目前檢測(cè)單增李斯特菌的方法主要有傳統(tǒng)國(guó)標(biāo)法、分子生物學(xué)法、免疫法、生物傳感器法等[5]。傳統(tǒng)的檢測(cè)方法由于檢測(cè)用時(shí)長(zhǎng)，無(wú)法應(yīng)對(duì)突發(fā)性的食品安全事件；分子生物學(xué)法，在靈敏度和特異性方面有明顯優(yōu)勢(shì)，但對(duì)工作人員和檢測(cè)設(shè)備的要求較高，成本較高；生物傳感器法還處于起步階段，未得到廣泛推廣；而免疫學(xué)法基于抗原抗體特異性結(jié)合的原理，能快速、簡(jiǎn)便的得出結(jié)果，適用于大批量樣品的快速檢測(cè)?；诿庖呒夹g(shù)的快速檢測(cè)產(chǎn)品在市場(chǎng)上越來(lái)越受歡迎，以Faulk和Taytor在1971年將膠體金作為一種標(biāo)記示蹤物而發(fā)展起來(lái)的免疫膠體金技術(shù)為起點(diǎn)，一種新的免疫學(xué)檢測(cè)方法逐漸建立起來(lái),因其結(jié)果直觀、操作簡(jiǎn)便的優(yōu)勢(shì)在各檢測(cè)領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用[6-8]。基于該技術(shù)開(kāi)發(fā)的膠體金試紙條可滿(mǎn)足快速檢測(cè)的要求，在幾分鐘之內(nèi)就可得到肉眼可見(jiàn)的結(jié)果，適用于動(dòng)植物檢疫、食品安全監(jiān)督等領(lǐng)域的現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。劉美辰等[9]利用單增李斯特菌的內(nèi)化素A(lnlA)蛋白制備單克隆抗體并研制出靈敏度為106CFU/mL的膠體金免疫層析試紙條。熊?chē)?guó)華等[10]針對(duì)單增李斯特菌制備的膠體金免疫層析試紙條的靈敏度為106CFU/mL。謝士嘉[11]等以膠體金免疫層析技術(shù)為基礎(chǔ)建立快速定量檢測(cè)單增李斯特菌的方法，其定量檢測(cè)靈敏度可達(dá)到3.5×103CFU/mL，線(xiàn)性范圍3.5×105～3.5×103CFU/mL。中國(guó)對(duì)于檢測(cè)單增李斯特菌試紙條的研究并未達(dá)到成熟階段，用于快速檢測(cè)的試紙條也沒(méi)有大范圍進(jìn)行推廣。本試驗(yàn)以期制備出能快速檢測(cè)冷鮮豬肉中單增李斯特菌的膠體金試紙條。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

單增李斯特菌、腸炎沙門(mén)氏菌、福氏志賀氏菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌、SP2/0骨髓瘤細(xì)胞均來(lái)自實(shí)驗(yàn)室保存，BALB/c小鼠購(gòu)自北京維通利華動(dòng)物中心。

胎牛血清、DMEM培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)GIBCO公司，HAT培養(yǎng)基、HT培養(yǎng)基、PEG2000、氯金酸購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，HRP標(biāo)記山羊抗小鼠IgG購(gòu)自北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司，檸檬酸三鈉購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，其他試劑均為分析純。

酶標(biāo)測(cè)試儀購(gòu)自美國(guó)Bio Rad公司，4MK2型洗板機(jī)購(gòu)自美國(guó)Theromo公司，二氧化碳培養(yǎng)箱購(gòu)自江蘇Heal Force公司，倒置顯微鏡購(gòu)自日本奧林巴斯公司，XYZ3050噴金劃膜儀購(gòu)自美國(guó)Bio-Dot公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 制備抗原 單增李斯特菌標(biāo)準(zhǔn)株活化后于固體培養(yǎng)基劃線(xiàn)培養(yǎng)，37℃靜置24 h，挑取單菌落接種于5 mL液體培養(yǎng)基中，置于180 r/min、37℃搖床中培養(yǎng)12 h，之后按2%的接種量擴(kuò)大培養(yǎng)至1 L，分別取少量菌液，進(jìn)行平板計(jì)數(shù)。取5 mL菌液12 000 r/min離心5 min，收集菌體，分別用無(wú)菌生理鹽水洗滌菌體3次，之后用生理鹽水重懸，121℃、30 min滅活后，再次用生理鹽水洗滌3次，并調(diào)節(jié)抗原為1×109CFU/mL，于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 免疫小鼠 將制備好的抗原采用背部皮下多點(diǎn)注射方式免疫小鼠，首次免疫為抗原與完全弗氏佐劑等量混合，之后則與等量不完全弗氏佐劑混合。免疫劑量為100 μL/只，每14天免疫1次，3～4次后取血并用間接ELISA法檢測(cè)血清效價(jià)。

1.2.3 制備單克隆抗體[12]選擇效價(jià)較高的小鼠采用腹腔注射對(duì)其進(jìn)行加強(qiáng)免疫，免疫劑量為100 μL。3 d后取其脾臟與培養(yǎng)好的SP2/0骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行融合，篩選出陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，置于液氮中保存。將石蠟油注射進(jìn)小鼠腹腔內(nèi)致敏，之后將生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的雜交瘤細(xì)胞株注射到致敏的小鼠腹腔內(nèi)，誘導(dǎo)腹水產(chǎn)生單克隆抗體并于7 d后收集腹水，離心去除脂肪及其他雜質(zhì)。用間接ELISA法檢測(cè)抗體效價(jià)，用SDS-PAGE法測(cè)定單克隆抗體的純度。

1.2.4 單克隆抗體特性分析 通過(guò)雙抗夾心ELISA體系[13]和抗體相加試驗(yàn)[14]篩選出一對(duì)穩(wěn)定、高效的最佳配對(duì)抗體，并檢測(cè)單抗的特異性和靈敏度。取滅活的單增李斯特菌、大腸桿菌、志賀氏菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌，分別用PBS稀釋到108CFU/mL，以檢測(cè)單抗的特異性。用PBS將單增李斯特菌進(jìn)行10倍梯度稀釋?zhuān)来握{(diào)整為108、107、106、105、104、103、102CFU/mL以檢測(cè)單抗的靈敏度。分別進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

1.2.5 免疫膠體金試紙條的制備 采用檸檬酸三鈉還原法制備膠體金：取100 mL0.01%的氯金酸溶液于錐形瓶中，置于電磁爐上邊攪拌邊加熱至沸騰，立即加入檸檬酸三鈉，繼續(xù)加熱至溶液變?yōu)橥噶恋募t色，冷卻至室溫，定容到100 mL，4℃避光保存[15]。

金標(biāo)抗體制備及鑒定：取9個(gè)1.5 mL的離心管，分別加入1 mL膠體金溶液，用0.1 mol/L的K2CO3將pH值分別調(diào)節(jié)至6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0，之后加入制備好的1.0 mg/mL的LM單抗50 μL，充分震蕩，靜置15 min，觀察顏色變化，保持紅色的最低pH值即為最適pH值；取7個(gè)1.5 mL的EP管分別加入1 mL膠體金溶液，用0.1 mol/L的K2CO3調(diào)至其最適pH值，按表1操作。

表1 抗體最佳標(biāo)記量Tab.1 The optimal amount of antibody

試紙條的組裝：使用三維噴金劃膜儀，分別在硝酸纖維素膜(NC膜)的檢測(cè)線(xiàn)(T線(xiàn))和質(zhì)控線(xiàn)(C線(xiàn))位置噴涂適宜的金標(biāo)抗體和1 mg/mL的山羊抗小鼠IgG，將噴好的NC膜放置于30℃真空干燥箱干燥25 h以上。將樣品墊、NC膜、結(jié)合墊、吸水墊粘于PVC支撐板上，然后用可編程切割機(jī)將組裝好的條子切割成39 mm寬度的試紙條，置于常溫干燥缸中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.6 試紙條靈敏度試驗(yàn) 取滅活的LM標(biāo)準(zhǔn)菌株，按照1.2.4用PBS進(jìn)行梯度稀釋,測(cè)試試紙條的靈敏度并進(jìn)行3次重復(fù)試驗(yàn)。

1.2.7 試紙條特異性試驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)室保存的其他致病菌(大腸桿菌、志賀氏菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌)稀釋成106CFU/mL，測(cè)定試紙條的特異性，重復(fù)3次。

1.2.8 試紙條實(shí)用性的驗(yàn)證 在本地市場(chǎng)和超市中隨機(jī)購(gòu)買(mǎi)一定數(shù)量的新鮮冷鮮豬肉樣品，滅菌后在無(wú)菌條件下切碎樣品，稱(chēng)取25 g于均質(zhì)袋中，每袋加225 mL已滅菌的液體培養(yǎng)基，均質(zhì)1～2 min，分別添加不同稀釋(108、107、106、105、104、103CFU/mL)的LM菌液，37℃培養(yǎng)12 h。用本試驗(yàn)制備的試紙條進(jìn)行檢測(cè)。

2 結(jié)果分析

2.1 單克隆抗體的制備

在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的篩選，通過(guò)有限稀釋法進(jìn)行亞克隆至陽(yáng)性率達(dá)到100%。最終通過(guò)間接ELISA法篩選出2株穩(wěn)定的最佳配對(duì)抗體，命名為3B7、5C9，其效價(jià)均達(dá)到1∶102 400。將得到的分泌抗體的雜交瘤細(xì)胞注射入石蠟油致敏的小鼠腹腔內(nèi)，收集腹水20 mL，辛酸硫酸銨法[16]純化后得到單克隆抗體，用聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)法測(cè)定單克隆抗體純度高于95%(圖1)。

M:Marker;1:3B7;2:5C9圖1 3B7、5C9單克隆抗體SDS-PAGE電泳圖Fig.1 SDS-PAGE of 3B7、5C9 monoclonal antibody

2.2 單克隆抗體的特性分析

用間接ELISA法檢測(cè)單抗對(duì)單增李斯特菌、大腸桿菌、志賀氏菌、阪崎腸桿菌、金黃色葡萄球菌的特異性(如圖2)，結(jié)果表明：?jiǎn)慰寺】贵w與單增李斯特菌表現(xiàn)出顯著的陽(yáng)性反應(yīng)，與其他菌株無(wú)交叉反應(yīng)，特異性良好。對(duì)單克隆抗體的靈敏度檢測(cè)結(jié)果表明該體系的靈敏度可達(dá)到104CFU/mL(圖3)。

圖2 ELISA法檢測(cè)單克隆抗體的特異性(***,P≤0.001)Fig.2 The specificity ofmonoclonal antibody by ELISA (***,P≤0.001)

圖3 單克隆抗體對(duì)單增李斯特菌的靈敏度檢測(cè)結(jié)果Fig.3 The sensitivity ofmonoclonal antibody against L. monocytogenes

2.3 金標(biāo)抗體的最適pH值

pH值為8.0的樣品經(jīng)肉眼觀察仍保持透亮的紅色，顏色變化最小，確定最適pH為8.0(圖4)。

2.4 金標(biāo)抗體的最適抗體標(biāo)記

在最佳pH條件下，當(dāng)抗體含量≥20 μg時(shí)，溶液穩(wěn)定沒(méi)有藍(lán)色沉淀現(xiàn)象，仍保持紅色。在此基礎(chǔ)上將抗體含量增加20%為穩(wěn)定膠體金的最適抗體標(biāo)記，即24 μg(圖5)。

2.5 試紙條特異性檢測(cè)

陽(yáng)性對(duì)照，即單增李斯特菌，正常顯色，陰性對(duì)照及其他檢測(cè)菌株均無(wú)顯色，說(shuō)明此試紙條特異性良好，與其他檢測(cè)菌株無(wú)交叉反應(yīng)(圖6)。

2.6 試紙條靈敏度檢測(cè)

當(dāng)待測(cè)菌液達(dá)到106CFU/mL時(shí)，C線(xiàn)與T線(xiàn)均顯示紅色條帶，而菌液低于106CFU/mL時(shí)試紙條呈陰性反應(yīng)，因此，該試紙條靈敏度確定為106CFU/mL(圖7)。

圖4 目測(cè)法確定膠體金標(biāo)記抗體最適pH值Fig.4 The optimization pH determination of gold colloid binding antibody by visual observation

圖5 目測(cè)法確定金標(biāo)記最適抗體Fig.5 The optimization concentration determination of gold colloid binding antibody by visual observation

圖6 試紙條對(duì)單增李斯特菌的特異性檢測(cè)Fig.6 The soecificity of strips on testing L. monocytogenes

圖7 試紙條檢測(cè)單增李斯特菌的靈敏度Fig.7 The sensitivity of strips on testing L. monocytogenes

2.7 試紙條實(shí)用性驗(yàn)證

對(duì)處理過(guò)的豬肉樣品的檢測(cè)結(jié)果表明，當(dāng)LM菌液高于106CFU/mL時(shí)，試紙條檢測(cè)結(jié)果呈陽(yáng)性反應(yīng)，低于106CFU/mL時(shí)，試紙條呈陰性反應(yīng)，與試驗(yàn)結(jié)果保持一致。該試紙條具有一定的實(shí)用性。

3 討 論

單增李斯特菌是李斯特菌屬中唯一具有致病性的菌種，尤其易出現(xiàn)在低溫制品中。為了能快速、簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確檢測(cè)食品中的單增李斯特菌，利用膠體金免疫層析技術(shù)的試紙條應(yīng)運(yùn)而生。免疫膠體金試紙條應(yīng)用前景廣闊，既能快速直觀看到檢測(cè)結(jié)果，又不會(huì)對(duì)食品品質(zhì)造成影響，是現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的最佳方法。本試驗(yàn)制備抗單增李斯特菌的單克隆抗體，通過(guò)建立雙抗夾心ELISA體系初步制備出可檢測(cè)單增李斯特菌的膠體金免疫層析試紙條，具良好的特異性，檢測(cè)限可達(dá)到106CFU/mL，與常見(jiàn)的食源性致病菌無(wú)交叉反應(yīng)。在實(shí)際生產(chǎn)和應(yīng)用中，膠體金的制備和試紙條的組裝條件是試紙條成功與否的關(guān)鍵步驟，此步驟需要大量實(shí)踐數(shù)據(jù)的支撐，需要通過(guò)多次重復(fù)試驗(yàn)進(jìn)一步調(diào)試。本試驗(yàn)受材料、經(jīng)驗(yàn)及時(shí)間等條件限制，僅僅初步制備出實(shí)驗(yàn)室條件下模擬檢測(cè)的試紙條，雖然距離實(shí)際生產(chǎn)應(yīng)用的要求還有一定差距，但也為日后該類(lèi)試紙條的推廣奠定基本理論基礎(chǔ)，積累寶貴經(jīng)驗(yàn)。