豬圓環(huán)病毒2型感染對(duì)豬小腸上皮細(xì)胞Claudin-1蛋白和閉鎖小帶蛋白-1基因mRNA表達(dá)的影響

楊昕坦，阮 崢，李煥榮

(北京農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，北京 102206)

豬圓環(huán)病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)感染引起的腸炎可威脅斷奶仔豬生長，腸炎過程伴隨腸黏膜屏障功能損傷[1]和小腸黏膜免疫系統(tǒng)功能的下降。小腸腸道黏膜屏障可防止致病性物質(zhì)的侵入和阻止腸道內(nèi)細(xì)菌及內(nèi)毒素的移位[2]，對(duì)保護(hù)機(jī)體腸道健康具有重要的作用。腸道黏膜上皮的完整性及正常的再生能力是腸黏膜屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)，腸黏膜屏障功能的損害可引起通透性增高，誘發(fā)炎癥反應(yīng)[3]。緊密連接在腸壁通透性、阻止內(nèi)毒素和毒性大分子物質(zhì)進(jìn)入體內(nèi)發(fā)揮著尤為重要的作用[4]。Claudins等4種跨膜蛋白與連接復(fù)合物蛋白、細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)共同構(gòu)成緊密連接復(fù)合物[5]，Claudin-1蛋白(Claudin-1)和閉鎖小帶蛋白-1(ZO-1)在細(xì)胞緊密連接蛋白的表達(dá)和合成中發(fā)揮重大作用[6]。

IPEC-J2細(xì)胞系(Intestinal porcine epithelial cell line)具有完整的上皮細(xì)胞特征，PCV2可感染IPEC-J2并增殖[7]。本研究基于熒光定量PCR方法，通過基因克隆構(gòu)建Claudin-1和ZO-1重組質(zhì)粒的標(biāo)準(zhǔn)曲線，探索PCV2感染的IPEC緊密連接蛋白的mRNA動(dòng)態(tài)變化，為PCV2感染損傷腸黏膜屏障的機(jī)制提供試驗(yàn)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 毒株、細(xì)胞及主要試劑

PCV2 SD/2008株：第3代(TCID50為105.25/mL)；豬小腸上皮細(xì)胞系(IPEC-J2.ACC701，DSMZ)中國農(nóng)業(yè)大學(xué)惠贈(zèng)；TRIzol LS Reagent購自Invitrogen；HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒、DNA快速膠回收試劑盒、高純度質(zhì)粒小提中量試劑盒等均購自北京博爾優(yōu)公司。

1.2 方法

1.2.1 PCV2感染豬小腸上皮細(xì)胞病毒載量的測定 參考文獻(xiàn)方法[8]，將處于對(duì)數(shù)生長期的IPEC接種于6孔板中，每孔細(xì)胞數(shù)為3×105個(gè)，用10%DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)60%，感染組以MOI=0.1感染PCV2毒株。分別于感染后4、12、24、48、72 h收集相應(yīng)的小腸上皮細(xì)胞。每個(gè)時(shí)相設(shè)3個(gè)重復(fù)。用實(shí)驗(yàn)室建立的PCV2實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測IPEC中PCV2核酸載量變化。

1.2.2 Claudin-1和ZO-1重組質(zhì)粒的構(gòu)建 參考文獻(xiàn)方法[9]，由上海生物工程公司合成Claudin-1和ZO-1目的基因的引物。研究所用引物序列和反應(yīng)條件如表1所示。

用Claudin-1和ZO-1特異性引物對(duì)IPEC的cDNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，瓊脂糖凝膠電泳觀察，回收純化PCR產(chǎn)物，克隆目的片段，構(gòu)建重組質(zhì)粒進(jìn)行PCR驗(yàn)證、測序比對(duì)及OD值的測定。

表1 Claudin-1、ZO-1、PCV2及看家基因Real-time FQ PCR的引物和PCR條件Tab.1 Real-time FQ-PCR primersand condition of Claudin-1, ZO-1, PCV2 and β-actin

1.2.3 Claudin-1、ZO-1 mRNA熒光定量PCR方法的建立 將Claudin-1和ZO-1重組質(zhì)粒10倍系列稀釋為108～103copies/μL，進(jìn)行SYBR Green I 熒光定量PCR擴(kuò)增，建立Claudin-1和ZO-1的標(biāo)準(zhǔn)曲線。參考文獻(xiàn)方法[9]，反應(yīng)條件稍加改動(dòng)：95℃ 10 min(預(yù)變性)，95℃ 30 s，55℃/51℃，30 s(退火)，72℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)，50～95℃進(jìn)行讀板。

1.2.4 PCV2感染的IPEC中Claudin-1和ZO-1 mRNA的檢測 收集感染4、12、24、48、72 h的IPEC，每個(gè)時(shí)相3個(gè)重復(fù)。按TRIzol LS Reagent 說明書提取RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，用建立的熒光定量PCR檢測Claudin-1和ZO-1 mRNA的動(dòng)態(tài)變化。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

經(jīng)Real-time FQ-PCR反應(yīng)后，獲得每個(gè)樣品中Claudin-1、ZO-1基因及看家基因β-actin的拷貝數(shù)。將Claudin-1、ZO-1 cDNA拷貝數(shù)除以同一樣品中看家基因β-actin的cDNA拷貝數(shù)，得到Claudin-1、ZO-1基因與看家基因的一個(gè)倍比值，用于表示感染組Claudin-1、ZO-1 mRNA水平的動(dòng)態(tài)變化。采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法，分析感染組與對(duì)照組各個(gè)時(shí)相IPEC中Claudin-1和ZO-1 mRNA表達(dá)量，并進(jìn)行差異顯著性分析。P<0.05為差異顯著，在圖中用*表示；P<0.01為差異極顯著，圖中用**表示差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 PCV2感染豬小腸上皮細(xì)胞病毒載量的動(dòng)態(tài)變化

PCV2感染IPEC后，用Real-time FQ PCR檢測5個(gè)時(shí)相IPEC中PCV2的核酸含量。感染后4 h即可在IPEC中檢測到病毒核酸，48 h時(shí)病毒含量達(dá)到最高，至72 h時(shí)病毒核酸載量曲線呈下降趨勢，表明PCV2可在IPEC中72 h內(nèi)持續(xù)存在，且可增殖(圖1)。

2.2 Claudin-1和ZO-1標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

質(zhì)粒PCR擴(kuò)增結(jié)果分別可見唯一的特異性目的片段，測序結(jié)果經(jīng)比對(duì)顯示與參考序列100%相同，OD260/280值為1.97和1.94(1.8～2.0)，表明Claudin-1和ZO-1基因片段的重組質(zhì)粒構(gòu)建成功，可用于標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行稀釋并進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增曲線顯示，Claudin-1和ZO-1相同濃度梯度質(zhì)粒的擴(kuò)增曲線基本重合，相鄰濃度梯度質(zhì)粒曲線的間距均勻(圖2A)；溶解曲線(圖2B和2C)顯示，所有產(chǎn)物具單一整齊的峰。兩基因標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系均良好(圖2D)，可用于后續(xù)研究。

圖1 PCV2接種后不同時(shí)間IPEC中病毒核酸動(dòng)態(tài)Fig.1 Dynamics of viral nucleic acid in IPEC at different time after inoculated with PCV2

圖2 Claudin-1和ZO-1熒光定量標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 The standard curves of fluorescence quantitative RT-PCR of Claudin-1 and ZO-1

2.3 Claudin-1和ZO-1 mRNA表達(dá)的動(dòng)態(tài)變化

熒光定量RT-PCR檢測和數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，Claudin-1和ZO-1 mRNA表達(dá)變化如圖3。Claudin-1和ZO-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平在4、12、24、48、72 h這五個(gè)時(shí)相內(nèi)全部下降，且ZO-1 mRNA表達(dá)差異均極顯著，12、48和72 h三個(gè)時(shí)相Claudin-1 mRNA表達(dá)極顯著下降，表明PCV2感染可抑制Claudin-1和ZO-1 mRNA表達(dá)。

圖3 PCV2感染后IPEC中claudin-1與ZO-1 mRNA 表達(dá)變化Fig.3 Changes of Claudin-1 and ZO-1 mRNA expression in IPEC after infected with PCV2

3 討 論

PCV2可感染IPEC并在其中增殖。病毒的感染可顯著下調(diào)IPEC緊密連接蛋白Claudin-1和ZO-1 mRNA的表達(dá)，提示PCV2感染可以抑制豬小腸上皮細(xì)胞緊密連接蛋白相關(guān)基因的表達(dá)，破壞細(xì)胞間的緊密連接，增加腸道通透性。

有報(bào)道[5]，PCV2感染IPEC，病毒載量從6 h開始呈現(xiàn)逐漸上升趨勢，在96 h時(shí)達(dá)頂峰，之后下降。本研究結(jié)果顯示，病毒載量從4 h上升至48 h達(dá)到峰值，之后呈下降趨勢。盡管趨勢有差異，但也說明PCV2可在IPEC中增殖。

腸道黏膜上皮的完整性及正常的再生能力是腸黏膜屏障的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)。緊密連接受損，腸上皮細(xì)胞間隙通透性增加，細(xì)菌或毒素借此進(jìn)入體循環(huán)，引起腸道感染[6]?；蛐酒Y(jié)果顯示PCV2感染可引起Claudin等相關(guān)緊密連接蛋白表達(dá)的下降，提示PCV2感染可增強(qiáng)小腸腸壁通透性，黏膜組織屏障功能降低，便于毒性大分子和微生物通過，降低了機(jī)體的防御能力，為PCV2感染機(jī)體提供便利條件[11]。

Claudin對(duì)維持和調(diào)節(jié)緊密連接屏障功能有重要作用[12, 13]，Claudin蛋白之間鏈鎖連接形成的細(xì)胞旁路途徑是影響緊密連接通透性的主要因素，炎癥性腸病(IBS)就是腸上皮細(xì)胞旁路通透性增高[14]。Claudin 24種異構(gòu)體中除Claudin-2、5、6表達(dá)增加能降低腸壁屏障功能外，其他Claudin蛋白的缺失能增加腸壁的通透性[15]。本研究發(fā)現(xiàn)PCV2感染的IPEC表達(dá)Claudin1能力降低，提示PCV2可增加腸道上皮的通透性，進(jìn)而影響腸道黏膜屏障。緊密連接蛋白1(ZO-1)是組成緊密連接的蛋白，廣泛存在于脊椎動(dòng)物的緊密連接中[16, 17]。大多數(shù)Claudin蛋白通過羧基端與ZO-1、ZO-2、ZO-3的C端連接構(gòu)成連接復(fù)合體，ZO-1從連接復(fù)合體移位會(huì)導(dǎo)致腸黏膜緊密連接松弛[18]。肌動(dòng)蛋白絲將連接復(fù)合體與肌動(dòng)蛋白環(huán)相連，通過收縮可以調(diào)節(jié)腸壁的通透性[19]。細(xì)菌侵襲、細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)的刺激均可導(dǎo)致Claudin和ZO-1表達(dá)的下降，影響緊密連接的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致腸壁通透性的增加，引起細(xì)菌的移位及炎癥反應(yīng)等[9]。腸黏膜受到損傷分泌的TNF-α、INF-γ等炎性細(xì)胞因子作用于細(xì)胞間的緊密連接結(jié)構(gòu)，降低緊密連接蛋白ZO-1的表達(dá)，導(dǎo)致緊密連接的瓦解，破壞腸道屏障，增強(qiáng)黏膜通透性[20]。本研究顯示PCV2感染不僅降低Claudin-1表達(dá)，同時(shí)也降低ZO-1表達(dá)，而有報(bào)道感染的細(xì)胞微絲骨架呈現(xiàn)聚合現(xiàn)象，應(yīng)力纖維減少，細(xì)胞界限明顯[7]，可見多重因素同時(shí)影響IPEC結(jié)構(gòu)完整性，導(dǎo)致腸道黏膜損傷。