洛克沙胂完全抗原的制備及其單克隆抗體的研制

劉紅亮，王奇奇，張改平，祁艷華，周景明，劉燕凱，馬麗萍，王愛萍

（鄭州大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，河南鄭州 450000）

洛克沙胂（Roxarsone，ROX），化學(xué)名為3-硝基-4-羥基苯胂酸，是一種人工合成的有機砷化物，也是在世界范圍內(nèi)應(yīng)用非常廣泛的一種飼料添加劑[1]，在提高飼料轉(zhuǎn)化率、促進動物生長、增加體質(zhì)量等方面具有重要作用[2]，同時還有抗菌、抗球蟲作用[3]。有人認(rèn)為，As3+、As5+在動物體內(nèi)同時存在時可以相互轉(zhuǎn)化[4]，起著氧化劑和還原劑的雙重作用，從而影響機體的物質(zhì)代謝。ROX大量使用后會被動物機體吸收，可蓄積在動物的肝臟、腎臟、脾臟以及骨骼中，導(dǎo)致細(xì)胞代謝紊亂，使動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)失調(diào)，并隨著人類對畜產(chǎn)品的攝入進入人體內(nèi)，最終對人體健康造成嚴(yán)重危害[5]。如果一些含砷的畜禽排泄物進入環(huán)境，也會對環(huán)境（水、土壤）造成巨大污染[6]。鑒于以上危害，我國農(nóng)業(yè)農(nóng)村部2018年發(fā)布公告[7]，禁止在食品動物中使用ROX。因此，建立有效的ROX檢測方法十分必要。

目前最常用的ROX檢測方法是高效液相色譜法[8]、氣相色譜法[9]、高效液相色譜-氫化物發(fā)生-原子熒光聯(lián)用法[10]等。但這些方法對儀器設(shè)備和樣品的前處理要求較高，不適合對樣品的大批量快速檢測[11]。而免疫分析法對樣品要求低，且靈敏度高[12]、特異性強[13-14]。已有研究人員制備了針對ROX的多抗，并且建立了檢測方法[15]。但多克隆抗體批間差異較大，非特異性反應(yīng)強，并且穩(wěn)定性較差[16]。而單克隆抗體可以克服以上缺點，但單抗的研制是建立免疫分析法的關(guān)鍵，因此抗ROX單克隆抗體研制十分必要。

1 材料與方法

1.1 儀器

分光光度計：美國Thermo fisher公司產(chǎn)品；高速冷凍離心機：德國Eppendorf公司產(chǎn)品；磁力攪拌器：德國IKA公司產(chǎn)品；Gel DocTMXR+凝膠成像系統(tǒng)：美國Bio-Rad公司產(chǎn)品。

1.2 試劑

洛克沙胂（ROX，純度≥97.9%）：德國Dr.Ehrenstorfer標(biāo)準(zhǔn)品；3-氨基-4羥基苯胂酸（HAPA）、碳二亞胺（EDC）：國藥集團化學(xué)試劑有限公司產(chǎn)品；N-羥基琥珀酰亞胺（NHS）、牛血清白蛋白（BSA）、雞卵清白蛋白（OVA）、胎牛血清：美國Sigma公司產(chǎn)品。

1.3 實驗動物

6～8周齡BALB/c雌性小鼠：本實驗室飼養(yǎng)。

1.4 人工抗原合成與鑒定

1.4.1 半抗原設(shè)計 HAPA與半抗原ROX的結(jié)構(gòu)類似，與ROX相比，HAPA 苯環(huán)上第3位碳原子的化學(xué)基團由亞硝基變?yōu)榘被▓D1）。亞硝基需要經(jīng)改造生成氨基后才能與蛋白質(zhì)進行偶聯(lián)，而與亞硝基相比，氨基可直接與BSA和OVA上的羧基反應(yīng)，因此最終選擇HAPA作為半抗原分子與BSA偶聯(lián)，合成完全抗原。

圖1 HAPA和ROX的結(jié)構(gòu)式

1.4.2 碳二亞胺法（EDC）法合成完全抗原及鑒定稱取20 mg BSA、55 mg EDC、33 mg NHS，充分溶解于2 mL PBS中，4 ℃條件下避光攪拌6 h，得到反應(yīng)液A；稱取10 mg HAPA，加入到3 mL的PBS中，滴加的同時進行攪拌，使其充分溶解，得到反應(yīng)液B；將B液逐滴加入到A液中，4 ℃攪拌過夜；4 ℃條件下用PBS透析3 d，離心棄去沉淀，上清即為免疫原HAPABSA。包被原HAPA-OVA的合成方法同上。分別采用SDS-PAGE和紫外分光光度法對合成的完全抗原進行鑒定。

1.5 免疫BALB/c小鼠及免疫效果評價

取 3只 6～8周 齡 雌 性 BALB/c小 鼠， 用HAPA-BSA免疫（20 μg/只）。首次免疫時將HAPA-BSA與等體積的弗氏完全佐劑混合，并用手持均質(zhì)機乳化后，對小鼠進行多點皮下注射；首次免疫后第3周進行第2次免疫，此后每隔2周將免疫原與弗氏不完全佐劑等體積混合乳化后對小鼠進行免疫；第4次免疫后1周，腹腔注射2倍皮下免疫劑量的完全抗原，進行加強免疫。

以HAPA-OVA為檢測原，在第4次免疫后1周斷尾取血，用間接ELISA法測定免疫血清效價、間接競爭ELISA測敏感性。

間接ELISA法測定血清效價：HAPA-OVA包被濃度為2.0 ng/μL，以斷尾采血的不同稀釋度血清為第一抗體，HRP標(biāo)記的羊抗小鼠抗體為第二抗體，未免疫小鼠血清為陰性對照。間接競爭ELISA測定敏感性：方法同上，但在加入50 μL一定稀釋度的血清之前，預(yù)先在孔內(nèi)加入50 μL濃度 分別為 1 000、500、250、125、62.5、31.25、15.5、7.75、3.9、2.0 ng/μL 的 ROX 標(biāo)準(zhǔn)液。

1.6 細(xì)胞融合及亞克隆篩選陽性單克隆細(xì)胞株

加強免疫3 d后，對小鼠眼球采血并將其脫頸處死，取脾臟進行細(xì)胞融合。將骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾臟細(xì)胞按一定比例進行細(xì)胞融合，在融合后第10天對融合細(xì)胞進行檢測；將篩選到的陽性細(xì)胞進行敏感性檢測，選擇效價高且敏感性強的細(xì)胞株進行亞克??；三輪亞克隆后篩選得到可以穩(wěn)定分泌單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株，測定其細(xì)胞上清效價及IC50值。

1.7 單克隆抗體大量制備、純化及初步鑒定

取雌性BLAB/c小鼠，腹腔注射500 μL液體石蠟，10 d后注射同樣體積的雜交瘤細(xì)胞（細(xì)胞數(shù)為106個）；10 d后抽取小鼠腹腔腹水，用辛酸-硫酸銨法對小鼠腹水進行純化，測定腹水效價和IC50值，并用SDS-PAGE鑒定純度，同時測定抗體對HAPA的IC50值，計算交叉反應(yīng)率。

2 結(jié)果

2.1 紫外光譜法鑒定人工合成抗原

紫外掃描結(jié)果顯示：HAPA-OVA紫外光譜最大吸收峰在228 nm左右，相比于載體蛋白OVA和半抗原HAPA的紫外最大吸收峰均有偏移（圖2-a），HAPA-BSA紫外光譜最大吸收峰與HAPAOVA相同（圖2-b），初步證明完全抗原合成成功。

圖2 HAPA-OVA和HAPA-BSA紫外掃描鑒定結(jié)果

2.2 SDS-PAGE鑒定人工合成抗原

HAPA-BSA蛋白濃度為0.237 mg/mL。電泳結(jié)果（圖3）顯示，與載體蛋白相比，合成的完全抗原HAPA-BSA有明顯的拖尾現(xiàn)象，表明HAPA與載體蛋白BSA偶聯(lián)成功。

圖3 HAPA-BSA的 SDS-PAGE鑒定

2.3 間接ELISA測定血清效價及敏感性

第3次免疫后1周，用間接ELISA測定的3只小鼠血清效價為1號小鼠1/6 400、2號1/12 800、3號1/3 200（圖4-a），選擇血清效價最高的2號小鼠，測定其IC50值為63.533 ng/μL（圖4-b）。

2.4 細(xì)胞融合及單克隆細(xì)胞株篩選

細(xì)胞融合后10 d，用ELISA檢測陽性細(xì)胞株，經(jīng)過3輪亞克隆后得到1株可以穩(wěn)定分泌抗ROX單克隆抗體的細(xì)胞株，命名為G12，細(xì)胞上清效價可達到1/512（圖5-a），IC50值為3.147 ng/μL（圖 5-b）。

2.5 單克隆抗體大量制備及純化

辛酸-硫酸銨法純化腹水后，測定純化前后腹水的效價均為1/102 400（圖6-a），純化后腹水IC50值為1.433 ng/μL（圖6-b）；SDS-PAGE鑒定結(jié)果顯示，純化后的腹水純度較高（圖6-c）。抗體對HAPA的IC50值為0.943 ng/μL，交叉反應(yīng)率為151.96 %。

圖4 小鼠多抗血清效價及2號小鼠血清IC50值

圖5 細(xì)胞上清效價及其IC50值

圖6 純化前后腹水效價、純化后腹水IC50值和純化后腹水純度鑒定

3 討論

ROX 是一種小分子半抗原，必須和大分子蛋白偶聯(lián)制備完全抗原后才能具有免疫原性。完全抗原合成是研制抗ROX單克隆抗體最基本的，也是最重要的一步。在進行偶聯(lián)方法選擇時，要避免破壞小分子半抗原結(jié)構(gòu)。與ROX相比，HAPA上的氨基可以直接與蛋白質(zhì)上的羧基在一定條件下脫水縮合生成肽鍵。因此，將ROX的結(jié)構(gòu)類似物HAPA分別與BSA、OVA偶聯(lián)并作為免疫原和包被原，通過紫外光譜掃描并利用SDS-PAGE方法，對合成的完全抗原進行鑒定，確定其合成成功。為了探索ROX與BSA、OVA的最佳偶聯(lián)方法，采用琥珀酸酐-混合酸苷法、1,4-丁二醚法和琥珀酸酐-EDC法，對ROX羥基進行改造。經(jīng)過對合成的完全抗原進行紫外光譜、SDS-PAGE凝膠鑒定分析，并對其免疫效果進行評價，發(fā)現(xiàn)免疫效果與預(yù)期不符。免疫后的小鼠血清不能產(chǎn)生識別ROX的抗體，推測可能是因為在對ROX苯環(huán)上的羥基進行改造時，破壞了砷酸基團上的羥基，從而導(dǎo)致ROX結(jié)構(gòu)被破壞，進而導(dǎo)致免疫后機體不能產(chǎn)生針對ROX的單克隆抗體。

4 結(jié)論

本研究最終研制出了可以識別ROX的單克隆抗體，其效價可達到1/102 400，IC50值為1.433 ng/μL，從而為建立更穩(wěn)定、準(zhǔn)確、快速的ROX免疫學(xué)快速檢測方法打下了基礎(chǔ)。