MALDI-TOF-MS用于微生物鑒定的影響因素分析

徐淑菲，孔繁德，林雙慶，蔡紹鑫

（廈門(mén)出入境檢驗(yàn)檢疫局，福建廈門(mén) 361026）

基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（Matrixassisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS）是一種簡(jiǎn)單和高效的新型軟電離生物質(zhì)譜。MALDI-TOF-MS是依賴(lài)儀器的生物化學(xué)分析技術(shù)，儀器精準(zhǔn)度、樣品處理方法、基質(zhì)選擇以及一些人為因素都會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生直接影響[1-2]。

在進(jìn)行細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)，培養(yǎng)基可能會(huì)影響細(xì)菌性狀的變化。Holland等[3]研究了用3種培養(yǎng)基培養(yǎng)福氏志賀菌后得到的質(zhì)譜圖，發(fā)現(xiàn)變化很小，特有生物標(biāo)記物的峰沒(méi)有發(fā)生變化，不會(huì)影響細(xì)菌鑒別。

應(yīng)用MALDI-TOF-MS進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)時(shí)，細(xì)菌培養(yǎng)時(shí)間是一個(gè)非常重要的變量。Arnold等[4]研究了不同培養(yǎng)時(shí)期（6～84 h）細(xì)菌質(zhì)譜峰的變化，發(fā)現(xiàn)不同培養(yǎng)時(shí)期的細(xì)菌質(zhì)譜峰有明顯差異。同時(shí)他們對(duì)保存了30 d的細(xì)菌及初代培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜蜂有差異，而初代培養(yǎng)與再培養(yǎng)（Recultured bacteria）細(xì)菌質(zhì)譜蜂基本相同。不同生理?xiàng)l件下的細(xì)菌，如處于休眠、細(xì)胞分裂、老化等各狀態(tài)的細(xì)菌，其質(zhì)譜圖也會(huì)發(fā)生變化。

檢測(cè)細(xì)菌時(shí)，可以將未經(jīng)處理的細(xì)菌直接進(jìn)樣，但這樣會(huì)產(chǎn)生較少的質(zhì)譜蜂。為了獲得較多的生物標(biāo)記物，提高細(xì)菌檢測(cè)準(zhǔn)確率，需要在檢測(cè)前對(duì)細(xì)菌進(jìn)行處理。Ryzhov等[5]用有機(jī)溶劑裂解法、超聲波降解法等檢測(cè)了11種蠟樣芽胞桿菌，發(fā)現(xiàn)處理后的細(xì)菌可以產(chǎn)生較多質(zhì)譜蜂，而對(duì)未處理細(xì)菌直接進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)生的質(zhì)譜蜂較少，檢測(cè)特異性較低。

點(diǎn)樣誤差的影響：樣品厚度不均勻，影響細(xì)菌鑒定；雜質(zhì)以及雙層點(diǎn)樣時(shí)間間隔也將影響采集的質(zhì)譜峰優(yōu)劣。一般先點(diǎn)1 μL樣品溶液，放干后要馬上再點(diǎn)1 μL基質(zhì)溶液。激光能量的影響：如果因初始能量不均，導(dǎo)致質(zhì)譜峰變寬，分辨率降低，則可以延時(shí)提取激光功率；如果線性檢測(cè)模式無(wú)法鑒別樣品，則可以選擇反射檢測(cè)模式。線性模式是離子在飛行管中從一端飛到另一端后被檢測(cè)到；而反射模式是離子飛到飛行管頂端后，經(jīng)頂部反射器，將離子又折返回起點(diǎn)，這樣離子等于進(jìn)行了長(zhǎng)于線性模式的飛行，因而有利于提高分辨率?；|(zhì)峰的影響：樣品處理時(shí)，不僅會(huì)溶出試驗(yàn)所需的蛋白質(zhì)，還會(huì)出現(xiàn)其他干擾蛋白質(zhì)，因此若出現(xiàn)低質(zhì)量端的大量背景信號(hào)，則可以采用偏轉(zhuǎn)法或降壓法來(lái)抑制基質(zhì)峰。

本試驗(yàn)主要從微生物培養(yǎng)基、培養(yǎng)狀態(tài)、菌體前處理等方面進(jìn)行MALDI-TOF-MS方法探討，有助于減少該方法操作的盲目性，提高鑒定水平，也有利于今后操作的規(guī)范。

1 材料與方法

1.1 試劑

1.1.1 培養(yǎng)基 營(yíng)養(yǎng)肉湯、BP、TTB、SC、MM、Ec肉湯、營(yíng)養(yǎng)肉湯、腸道增菌液、LST、mTSB、LST-MUG、APW、XLD瓊脂、DHL瓊脂、BS瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基、HE瓊脂、SS瓊脂、TSI、副溶血弧菌顯色培養(yǎng)基、TCBS瓊脂、麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂：均購(gòu)自北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司。

1.1.2 其他主要試劑和儀器 無(wú)水乙醇、氯仿：購(gòu)自廈門(mén)綠茵化玻有限公司，均為分析純；甲酸、乙腈、三氟乙酸、甲醇、異丙醇，質(zhì)譜純：購(gòu)自Fisher Scientific；α-氰基-4-羥基肉桂酸（alpha-Cyano-4-hydroxycinnamic acid，CHCA）、質(zhì)譜純：購(gòu)自BRUKER DALTONICS公司；質(zhì)量矯正標(biāo)準(zhǔn)品（Bacterial test standard）：購(gòu)自BRUKER DALTONICS公司。高通量微生物鑒定儀，型號(hào)Mtcro flex LRF20：Bruker Daltonics公司生產(chǎn)；高速冷凍離心機(jī)，型號(hào)Allegra 64R：Beckman公司生產(chǎn)。

1.2 材料與方法

1.2.1 菌株 ETEC c83916：購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)微生物菌種保藏管理中心；沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌：為本項(xiàng)目組分離鑒定準(zhǔn)確的菌株。

1.2.2 不同培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)狀態(tài)、液體培養(yǎng)基的影響 將ETEC c83916分別接種兩管Ec肉湯、營(yíng)養(yǎng)肉湯、腸道增菌液、LST、mTSB、LST-MUG培養(yǎng)基，將沙門(mén)氏菌分別接種兩管營(yíng)養(yǎng)肉湯、BP、TTB、SC、MM培養(yǎng)基，將副溶血弧菌分別接種兩管APW、含3%NaCl的APW、含6%NaCl的APW、含8%NaCl的APW，將其中一管37 ℃靜置培養(yǎng)，另一管37 ℃搖床震蕩培養(yǎng)，然后分別取培養(yǎng)4、8、10、12、24、48、72 h的菌液1 mL，按照徐淑菲等[3]介紹的方法進(jìn)行菌液前處理，隨后進(jìn)行MALDI-TOF-MS鑒定。

1.2.3 不同固體培養(yǎng)基的影響 將ETEC c83916分別接種麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、TSI斜面，將沙門(mén)氏菌分別接種XLD瓊脂、DHL瓊脂、BS瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基、HE瓊脂、SS瓊脂、TSI斜面，將副溶血弧菌分別接種TCBS瓊脂、弧菌顯色培養(yǎng)基、含NaCl的TSI斜面，37 ℃培養(yǎng)24 h，各取一接種環(huán)的菌體置于含生理鹽水的離心管中備用。按照徐淑菲等[3]介紹的方法進(jìn)行菌體前處理，隨后進(jìn)行MALDI-TOF-MS鑒定。

1.2.4 殘存培養(yǎng)基的影響 將ETEC c83916接種于Ec肉湯、營(yíng)養(yǎng)肉湯、腸道增菌液、LST、mTSB、LST-MUG培養(yǎng)基，將沙門(mén)氏菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯、BP、TTB、SC、MM培養(yǎng)基，將副溶血弧菌接種于APW、含3%NaCl的APW、含6%NaCl的APW、含8%NaCl的APW，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，每種菌液各取2管，1 mL/管，將其中一管離心后的菌體用生理鹽水洗2遍，另外一管離心后棄上清，然后按照徐淑菲等[6]介紹的方法進(jìn)行后續(xù)試驗(yàn)和MALDI-TOF-MS鑒定。

1.2.5 溶出的蛋白放置于-20 ℃的影響 將ETEC c83916、沙門(mén)氏菌接種營(yíng)養(yǎng)肉湯，將副溶血弧菌接種APW，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。按照徐淑菲等[6]介紹的方法進(jìn)行菌液前處理，將溶出的蛋白存放于-20 ℃冰箱，隔一段時(shí)間進(jìn)行MALDI-TOF-MS檢測(cè)。

1.2.6 不同菌量的影響 將ETEC c83916、沙門(mén)氏菌接種于營(yíng)養(yǎng)肉湯，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h，然后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。各取1 mL菌液，對(duì)菌體進(jìn)行10-1～10-6梯度稀釋?zhuān)ㄏ喈?dāng)于 102～10-3μL 菌液），將菌體按照徐淑菲等[6]介紹的方法進(jìn)行前處理和MALDI-TOF-MS鑒定。將ETEC c83916、沙門(mén)氏菌接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，將副溶血弧菌接種TCBS，37 ℃培養(yǎng)24 h，挑取單個(gè)菌落，用生理鹽水洗滌，按照徐淑菲等[6]介紹的方法進(jìn)行后續(xù)步驟和MALDI-TOF-MS鑒定。

1.2.7 重現(xiàn)性試驗(yàn) 將ETEC c83916、沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌按照標(biāo)準(zhǔn)方法制樣，同一份樣品上清液分別重復(fù)點(diǎn)靶3次，自然干燥后加1 μL基質(zhì)，進(jìn)行MALDI-TOF-MS分析。

1.2.8 不同前處理的影響 將ETEC c83916和沙門(mén)氏菌分別接種營(yíng)養(yǎng)肉湯和營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，將副溶血弧菌分別接種APW和TCBS平板，37 ℃靜置培養(yǎng)24 h。本試驗(yàn)將每種細(xì)菌各分9組，各組試驗(yàn)操作方法見(jiàn)表1。

表1 分組試驗(yàn)的操作方法

1.2.9 不同上樣量的影響 將ETEC c83916、沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌，按照徐淑菲等[6]介紹的方法制樣，分別取上清1、2、3、4 μL點(diǎn)靶，各重復(fù)3孔。自然干燥后，各加1 μL基質(zhì)，進(jìn)行MALDI-TOFMS分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)狀態(tài)和液體培養(yǎng)基的影響

綜合表2～表4的數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，MALDI-TOFMS的鑒定分值并不會(huì)隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長(zhǎng)而變大，培養(yǎng)時(shí)間長(zhǎng)短和MALDI-TOF-MS的鑒定分值不成正比，且不影響鑒定結(jié)果，但是時(shí)間太長(zhǎng)會(huì)使細(xì)菌進(jìn)入衰亡期，此時(shí)菌體易變形或自溶，導(dǎo)致菌體蛋白成分有可能發(fā)生改變，因而難以得到確切的質(zhì)譜分析圖譜，從而影響鑒定。震蕩培養(yǎng)也不對(duì)鑒定分值的提高有任何明顯作用。非含鹽的培養(yǎng)基對(duì)細(xì)菌質(zhì)譜分析的鑒定沒(méi)有大的差異，但含鹽的培養(yǎng)基隨著鹽分濃度的增高，培養(yǎng)時(shí)間需提高，這樣才能進(jìn)行質(zhì)譜分析鑒定，得到的質(zhì)譜分值相對(duì)于鹽濃度低的培養(yǎng)基也低。

建議細(xì)菌鑒定培養(yǎng)時(shí)間為4～24 h，盡量選擇不含鹽的培養(yǎng)基。

表2 不同培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)狀態(tài)、液體培養(yǎng)基對(duì)MALDI-TOF-MS的影響分值（ETEC）

表3 不同培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)狀態(tài)、液體培養(yǎng)基對(duì)MALDI-TOF-MS的影響分值（沙門(mén)氏菌）

表4 不同培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)狀態(tài)、液體培養(yǎng)基對(duì)MALDI-TOF-MS的影響分值（副溶血弧菌）

2.2 不同固體培養(yǎng)基的影響

ETEC c83916接種麥康凱瓊脂、伊紅美藍(lán)瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂和TSI斜面的MALDITOF-MS分 值 分 別 為 2.627、2.566、2.439和2.597，沙門(mén)氏菌接種XLD瓊脂、DHL瓊脂、BS瓊脂、營(yíng)養(yǎng)瓊脂、沙門(mén)氏菌顯色培養(yǎng)基、HE瓊脂、SS瓊脂和TSI斜面的MALDITOF-MS分值分別為 2.172、2.200、2.328、2.214、2.183、2.258、2.434和 2.313， 副 溶血弧菌接種TCBS瓊脂、弧菌顯色培養(yǎng)基和含NaCl的TSI斜面的MALDI-TOF-MS分值分別為2.318、2.315和2.522。

固體培養(yǎng)基間的MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果一致，但鑒定分值不同。有色培養(yǎng)基培養(yǎng)的菌體用生理鹽水洗滌后，有些顏色能夠去除，有些無(wú)法去除，如用70%的甲酸、乙腈溶解后的上清仍有顏色，這樣會(huì)影響鑒定分值。

2.3 殘存培養(yǎng)基的影響

表5～表7的數(shù)據(jù)顯示，不含鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌，如果不經(jīng)生理鹽水洗滌直接進(jìn)行處理，則對(duì)鑒定分值影響很小，不會(huì)影響鑒定結(jié)果；含鹽的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌，如果不經(jīng)洗滌直接進(jìn)行處理，則對(duì)鑒定分值影響較大，有時(shí)得不到分值超過(guò)2的數(shù)據(jù)，最終影響細(xì)菌鑒定。

表5 ETEC殘存培養(yǎng)基對(duì)MALDI-TOF-MS的影響分值

表6 沙門(mén)氏菌殘存培養(yǎng)基對(duì)MALDI-TOF-MS的影響分值

表7 副溶血弧菌殘存培養(yǎng)基對(duì)MALDI-TOF-MS的影響分值

2.4 溶出的蛋白放置于-20℃的影響

由表8數(shù)據(jù)可見(jiàn)，對(duì)于不需要鹽的培養(yǎng)基培養(yǎng)的細(xì)菌，如ETEC、沙門(mén)氏菌，溶出的蛋白保存于-20 ℃，長(zhǎng)達(dá)16周即近4個(gè)月的時(shí)間，雖然鑒定分值有一定的波動(dòng)，呈現(xiàn)略微減小的趨勢(shì)，但都在2以上，而且對(duì)結(jié)果判定不產(chǎn)生影響；對(duì)于嗜鹽性細(xì)菌，如副溶血弧菌，隨著時(shí)間的推移，鑒定分值呈現(xiàn)明顯的下降趨勢(shì)，當(dāng)分值降到2以下，就無(wú)法正確做出細(xì)菌鑒定。

可見(jiàn)，只要放置于-20 ℃的時(shí)間不太長(zhǎng)，就能夠得到比較準(zhǔn)確的鑒定結(jié)果。

2.5 菌量的影響

經(jīng)平板計(jì)數(shù)，ETEC c83916、沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌菌落數(shù)分別為8.5×108、9.7×108、1.0×109CFU/mL（表9）。

表8 溶出的蛋白放置于-20 ℃對(duì)檢測(cè)結(jié)果的影響分值

梯度稀釋后菌液的最終MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果是一致的，但隨著菌量的減少，分值會(huì)減弱，10-4（0.1 μL菌液）稀釋后尤其明顯，即使稀釋到10-6，也不影響最終結(jié)果判定，但細(xì)菌的蛋白質(zhì)組指紋圖譜采集越來(lái)越難。綜合來(lái)說(shuō)，0.1 μL菌液也可以作為最低菌量的考量，ETEC c83916、49#沙門(mén)氏菌、3#副溶血弧菌的最低檢出量分別為8.5×104、9.7×104、1.0×105CFU。

表9 菌量對(duì)MALDI-TOF-MS結(jié)果的影響分值

ETEC c83916和沙門(mén)氏菌接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂平板，副溶血弧菌接種TCBS，挑取的單個(gè)菌落MALDI-TOF-MS鑒定分值分別為2.203、2.289和2.252。固體單菌落的MALDI-TOF-MS分值較液體培養(yǎng)的低，結(jié)果不如液體培養(yǎng)更可靠。

2.6 重現(xiàn)性

表10顯示的是3種菌的MALDI-TOF-MS重復(fù)性試驗(yàn)數(shù)據(jù)，1～9的編號(hào)與電泳圖譜（圖1）、指紋圖譜（圖2）編號(hào)一一對(duì)應(yīng)。ETEC c83916、沙門(mén)氏菌、副溶血弧菌3個(gè)重復(fù)靶孔的質(zhì)譜分值最高分別為2.555、2.532、2.469，2.314、2.289、2.245，2.284、2.345、2.391，相同菌種的質(zhì)譜分值很接近，最高都在2以上，且排在“Detected Species”前幾位或者說(shuō)分值較高的都是同一菌種，均可以進(jìn)行菌種判定。電泳圖譜和指紋圖譜顯示，相同菌、相同處理方式、不同靶孔的重現(xiàn)性很高，特征性蛋白條帶和蛋白質(zhì)譜峰幾乎完全一樣，每個(gè)樣品不必像其他一些方法那樣需要設(shè)置重復(fù)。

表10 MALDI-TOF-MS結(jié)果的重現(xiàn)性最高分值

圖1 MALDI-TOF-MS電泳圖譜

圖2 MALDI-TOF-MS指紋圖譜

2.7 不同前處理的影響

除了按照標(biāo)準(zhǔn)化前處理程序處理細(xì)菌外，還有幾種菌體前處理方法也能夠得到良好的鑒定結(jié)果（表11）：第2～5組菌液，經(jīng)生理鹽水洗滌后，直接加不同量的ddH2O制成混懸液后進(jìn)行點(diǎn)靶鑒定，即能得到良好的鑒定結(jié)果，1 mL菌液用200 μL左右的ddH2O溶解較佳（第3組）；第8組菌液，經(jīng)生理鹽水洗滌后，直接加50 μL 70%甲酸和50 μL乙腈，離心后上清點(diǎn)靶，可以得到較為理想的鑒定分值；第6、7組菌體，經(jīng)超聲波或凍融裂解后，得到的分值偏離標(biāo)準(zhǔn)組太大，有的細(xì)菌鑒定分值低于2，不可采用；第9組固體培養(yǎng)基的菌落，沒(méi)有經(jīng)過(guò)任何前處理，直接點(diǎn)靶，所得鑒定分值偏離標(biāo)準(zhǔn)組太大，不建議采用。

表11 不同前處理對(duì)MALDI-TOF-MS結(jié)果的影響分值

2.8 不同上樣量的影響

不同上樣量對(duì)結(jié)果影響不大，只要樣品均勻，就能得到m/z一致的峰（表12）。

3 討論

3.1 公共衛(wèi)生安全問(wèn)題

腸毒性大腸埃希桿菌攜帶不耐熱腸毒素（Heat labile toxin，LT） 和 耐 熱 腸 毒 素（Heat stable toxin，ST），可引起惡心、腹痛、低熱，以及急性發(fā)作的水樣腹瀉，是最為常見(jiàn)的一種致瀉性大腸埃希菌[7]。其定居于小腸表面，不損壞也不侵入腸黏膜上皮細(xì)胞，只通過(guò)產(chǎn)生腸毒素而引起分泌性腹瀉。近來(lái)在人類(lèi)霍亂病人大便中，新發(fā)現(xiàn)一組致腹瀉性大腸埃希桿菌，它是發(fā)達(dá)國(guó)家“旅游者腹瀉”的主要病原之一，是“成人霍亂綜合征”的常見(jiàn)原因，也是小兒腹瀉的重要病原，由其引起的發(fā)病率僅次于輪狀病毒。

沙門(mén)氏菌是腸桿菌科的一種具有重要公共衛(wèi)生意義的常見(jiàn)人獸共患病原菌，廣泛分布于自然界，目前在全世界已分離出2 523個(gè)血清型，不僅能導(dǎo)致雞白痢、雞傷寒、副傷寒、仔豬副傷寒、流產(chǎn)等多種動(dòng)物疾病，還能使人類(lèi)發(fā)生傷寒、副傷寒、敗血癥、胃腸炎、感染性腹瀉和食物中毒等疾病。在世界各地的食物中毒事件中，沙門(mén)氏菌引起的中毒病例均占首位或第二位[8]。

副溶血性弧菌是引起食物中毒較為常見(jiàn)的一種病原，是當(dāng)今導(dǎo)致食物中毒最主要的細(xì)菌，由其引起的食物中毒事件近年來(lái)呈上升勢(shì)頭。生活中常常由于廚房工作人員衛(wèi)生意識(shí)差、食物生熟不分，致使海水產(chǎn)品中污染的弧菌引起學(xué)校、幼兒園發(fā)生群體性食物中毒，個(gè)別可呈敗血癥表現(xiàn)。由副溶血性弧菌引起的疾病多發(fā)生于夏秋季節(jié)，重點(diǎn)是沿海地區(qū)，常造成集體發(fā)病，近年來(lái)沿海地區(qū)的發(fā)病數(shù)量也有增多趨勢(shì)[9]。

3.2 不同培養(yǎng)基、培養(yǎng)時(shí)間、培養(yǎng)狀態(tài)對(duì)鑒定結(jié)果不會(huì)產(chǎn)生明顯影響

細(xì)菌新陳代謝包括細(xì)菌細(xì)胞的生物合成、能量供給、運(yùn)動(dòng)及化學(xué)反應(yīng)表現(xiàn)的各種活性。其代謝過(guò)程按功能分為物質(zhì)攝取、生物合成、聚合作用及組裝。不同的液體培養(yǎng)基或者固體培養(yǎng)基供細(xì)菌攝取物質(zhì)，提供營(yíng)養(yǎng)成分，并不改變細(xì)菌的遺傳性狀。嗜鹽、有色或者顯色培養(yǎng)基是為了使細(xì)菌更好地生長(zhǎng)和更準(zhǔn)確地鑒別，震蕩培養(yǎng)也是為了加快細(xì)菌生長(zhǎng)繁殖，不影響細(xì)菌菌體內(nèi)蛋白質(zhì)的合成及成分，因此對(duì)MALDI-TOF-MS鑒定結(jié)果沒(méi)有影響。一般的培養(yǎng)基（主要指液體），離心后只要去除上清很徹底，菌體就無(wú)培養(yǎng)基顏色，用70%甲酸、乙腈溶解菌體后的上清液也不會(huì)留有培養(yǎng)基的顏色，因而就不會(huì)影響后續(xù)鑒定。但若用70%甲酸、乙腈溶解菌體后的上清仍有培養(yǎng)基顏色，則會(huì)影響鑒定分值。

細(xì)菌的生長(zhǎng)繁殖分為遲緩期、對(duì)數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期，對(duì)數(shù)期的病原菌致病力最強(qiáng)，其形態(tài)、染色特性及生理活性均較典型，對(duì)抗菌藥物等的作用較為敏感。穩(wěn)定期，因營(yíng)養(yǎng)消耗、代謝產(chǎn)物蓄積等，細(xì)菌繁殖速度會(huì)下降，死亡數(shù)逐步上升，這樣可使活菌數(shù)與死菌數(shù)保持大致平衡。但穩(wěn)定期的細(xì)菌形態(tài)及生理形狀常有改變，革蘭氏陽(yáng)性菌此時(shí)可染成陰性，毒素等代謝產(chǎn)物大多在此時(shí)產(chǎn)生。本試驗(yàn)中，雖然MALDI-TOF-MS的鑒定結(jié)果沒(méi)有隨培養(yǎng)時(shí)間延長(zhǎng)而改變，但當(dāng)菌體進(jìn)入衰亡期后，菌體可能會(huì)變形或自溶，菌體蛋白成分也可能發(fā)生改變，而且此時(shí)細(xì)菌黏稠度增大，不易離心得到菌體，所以建議優(yōu)先選擇新鮮培養(yǎng)的菌液，以24 h內(nèi)的細(xì)菌為佳。

Arnold等[4]認(rèn)為，在進(jìn)行細(xì)菌檢測(cè)時(shí)，使細(xì)菌培養(yǎng)性狀保持穩(wěn)定十分必要。建議最好采用新鮮培養(yǎng)的菌液，菌體離心后用生理鹽水洗滌，并盡可能完全去除培養(yǎng)基成分。

3.3 點(diǎn)樣厚度對(duì)鑒定結(jié)果無(wú)大的影響，均勻性對(duì)結(jié)果影響較大

基質(zhì)、溶劑、鹽（金屬離子）和樣品制備方法的選擇是MALDI分析高聚物成敗的關(guān)鍵。最優(yōu)化的條件是，使樣品分子和基質(zhì)均勻形成共結(jié)晶，基質(zhì)吸收激光的能量，并將能量傳遞給樣品，幫助樣品離子化。本試驗(yàn)證實(shí)，樣品厚度對(duì)結(jié)果判定沒(méi)有實(shí)質(zhì)性影響，但若樣品厚度不均一，則易造成激光能量不均一，樣品離子化程度或者時(shí)間就會(huì)不一致，從而導(dǎo)致蛋白質(zhì)質(zhì)譜峰偏移（圖3），影響判定。

圖3 樣品厚度不均勻的結(jié)果示意圖

3.4 檢測(cè)靈敏度

0.1 μL 的菌液，大約 104～105CFU，即可完成MALDI-TOF-MS檢測(cè)，說(shuō)明該方法穩(wěn)定性、特異性高。

3.5 菌體前處理的簡(jiǎn)化

按照標(biāo)準(zhǔn)化程序處理細(xì)菌較為繁瑣且沒(méi)有必要。1 mL菌液經(jīng)生理鹽水洗滌后，直接加200 μL左右的ddH2O制成混懸液，然后進(jìn)行點(diǎn)靶鑒定，即能得到良好的鑒定結(jié)果，這樣可節(jié)省檢測(cè)時(shí)間，簡(jiǎn)化檢測(cè)程序，更便于進(jìn)行高通量檢測(cè)鑒定。