基于熱分離法制備的人表皮側(cè)抗原的Western印跡實(shí)驗(yàn)對(duì)大皰性類(lèi)天皰瘡的診斷價(jià)值評(píng)估

李鎖 程險(xiǎn)峰 李新宇 李志量 荊可 向睿宇 張寒梅 馮素英

中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院 北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院 皮膚病醫(yī)院皮膚科 江蘇省皮膚病與性病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，南京 210042

對(duì)大皰性類(lèi)天皰瘡（bullous pemphigoid，BP）患者行鹽裂皮膚間接免疫熒光檢查可發(fā)現(xiàn)免疫復(fù)合物沉積在表皮側(cè)，然而基底膜帶連接結(jié)構(gòu)相對(duì)復(fù)雜，表皮側(cè)抗原除BP180外，還有BP230、網(wǎng)蛋白及整合素等抗原，同時(shí)BP180胞外區(qū)含有多個(gè)自身抗體反應(yīng)的位點(diǎn)［1］，需要制備表皮側(cè)抗原分析患者自身抗體，以便對(duì)表皮下水皰病進(jìn)一步分類(lèi)及明確診斷。熱分離法和鹽裂法分離部位基本一致，位于透明層下部靠近致密層最薄弱處，但Meyer等［2-3］發(fā)現(xiàn)，采用熱分離法時(shí)BP180分子降解較少。我們利用熱分離法制備人表皮側(cè)抗原，探討表皮側(cè)蛋白制備過(guò)程，分析以表皮側(cè)蛋白為底物行Western印跡檢測(cè)診斷BP患者的敏感性和特異性，評(píng)估其在BP診斷中的價(jià)值。

對(duì)象與方法

一、臨床資料

收集2015年1月至2017年8月在中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院確診為BP住院患者和非BP住院患者（對(duì)照組）。

BP患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①在皮膚紅斑基礎(chǔ)上出現(xiàn)緊張性水皰，尼氏征陰性；②組織病理表現(xiàn)為表皮下皰，伴/不伴真皮內(nèi)嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；③患者水皰周?chē)罢！逼つw直接免疫熒光檢查可見(jiàn)基底膜帶IgG和/或C3線狀沉積；④鹽裂皮膚間接免疫熒光檢查表皮側(cè)可見(jiàn)IgG和/或C3線狀沉積；⑤行BP180 NC16A ELISA檢測(cè)示ELISA數(shù)值大于9 U/ml。符合④、⑤，或符合①、②、③+［④或⑤］可診斷BP［4-6］。

共入選BP患者22例，男16例，女6例，年齡43～84歲，平均年齡63.13歲，均在病情活動(dòng)期抽取全血，其中21例BP180 NC16A ELISA為陽(yáng)性。

對(duì)照組25例，男13例，女12例，年齡35～85歲，平均64.12歲，包括6例天皰瘡患者、4例多形紅斑、1例中毒性表皮壞死松解癥、1例紅皮病、1例白塞病、1例丘疹性蕁麻疹、11例濕疹，其中2例濕疹患者BP180 NC16A ELISA為陽(yáng)性。BP組和對(duì)照組在年齡和性別等人口學(xué)特征上具有可比性（均P＞0.05）。

本研究經(jīng)中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)［批準(zhǔn)號(hào)：（2016）快審第（KY004）號(hào)］，受試者均簽署知情同意書(shū)。

使用促凝管收集受試者外周靜脈血5 ml并靜置30 min，2 000 r/min（離心半徑15 cm）離心5 min，吸取上清液分入1 ml微量離心管中，并于-80℃冰箱保存。

二、正常皮膚組織標(biāo)本獲取及表皮熱分離

自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院皮膚病醫(yī)院和江蘇省常州市第二人民醫(yī)院收集20～30歲健康人包皮環(huán)切術(shù)后殘留的正常皮膚（取材前供者均簽署知情同意書(shū)）。熱分離法分離表皮：將裝有40 ml熱分離皮膚緩沖液的燒杯放入56℃水浴鍋中，并準(zhǔn)備冰水，預(yù)冷PBS。正常皮膚組織去除皮下脂肪，用預(yù)冷的0.01 mol/L PBS沖洗干凈，并將皮片剪成2 cm×2 cm。將皮片放入56℃熱分離皮膚緩沖液（加入苯甲基磺酰氟）中4 min，置預(yù)冷的PBS中迅速冷卻。輕輕分離表皮和真皮，用濾紙將分離的表皮水分吸收后迅速放入液氮中。

三、正常皮膚表皮蛋白提取及變性

將研缽和研杵用液氮充分預(yù)冷，將正常皮膚放在研缽中，每次加15～20 ml液氮，用研杵研磨組織至粉末狀。將研磨后的組織粉末和熱分離表皮抗原提取液（樣本與提取液比例=250 g/L）放入置于冰水中的玻璃勻漿器。用勻漿管上下研磨20次（5 min左右），有效剪切DNA，直至提取液清澈。勻漿物在4℃下以13 000 r/min（離心半徑5 cm）離心30 min。取上清液，加入上樣緩沖液，置100℃水浴鍋中變性10 min，-80℃保存。

四、考馬斯亮藍(lán)凝膠染色檢測(cè)表皮側(cè)蛋白

具體方法參照《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》［7］。

五、Western印跡檢測(cè)

Western印跡方法參照文獻(xiàn)［8］，對(duì)部分實(shí)驗(yàn)條件進(jìn)行調(diào)整，轉(zhuǎn)膜條件：恒流300 mA，120 min。封閉條件：5%脫脂奶粉封閉液，室溫封閉90 min。一抗反應(yīng)條件：患者血清濃度為1∶150，將膜放于雜交槽中，室溫下輕搖雜交70 min。二抗反應(yīng)條件：HRP標(biāo)記的二抗?jié)舛葹?∶1 000，室溫孵育1 h。

六、BP180 NC16A ELISA

嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，使用酶標(biāo)儀（BioTekSynergyht）在波長(zhǎng)450 nm下讀取吸光度（A值），按照說(shuō)明書(shū)的公式計(jì)算血清抗體滴度值。

七、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用統(tǒng)計(jì)軟件SPSS22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。計(jì)數(shù)資料采用χ2檢驗(yàn)及Fisher精確檢驗(yàn)法分析，P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、考馬斯亮藍(lán)染色結(jié)果

表皮側(cè)蛋白經(jīng)考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)，結(jié)果顯示，上樣量為5～10μl時(shí)條帶清晰，便于進(jìn)行Western印跡檢測(cè)。表皮側(cè)蛋白相對(duì)分子質(zhì)量主要集中在40 000～60 000及15 000以下和240 000以上，見(jiàn)圖1。

圖1 熱分離制備的正常皮膚表皮側(cè)蛋白考馬斯亮藍(lán)染色分析圖M：蛋白分子標(biāo)記物；1～5：上樣量分別為20、17.5、15、10、5μl

二、表皮側(cè)蛋白Western印跡與BP180 NC16A ELISA檢測(cè)結(jié)果比較

表皮側(cè)蛋白Western印跡、BP180 NC16A ELISA敏感性分別為86.36%（95%CI為64.03%～96.41%）、95.45%（95%CI為75.11%～99.76%）（χ2=1.10，P=0.294）；特異性分別為100%（95%CI為83.42%～100%）、92.00%（95%CI為75.11%～99.76%）（χ2=2.08，P=0.149）。見(jiàn)表1。

三、表皮側(cè)蛋白Western印跡條帶分析

22例BP患者表皮側(cè)蛋白Western印跡結(jié)果見(jiàn)圖2。4例可見(jiàn)相對(duì)分子質(zhì)量（relative molecule mass，RMM）為230 000的陽(yáng)性條帶；18例為180 000的陽(yáng)性條帶，BP180 ELISA結(jié)果均大于90 U/L；1例為120 000的陽(yáng)性條帶，BP180 ELISA結(jié)果為53.3 U/L；1例為97 000且同時(shí)有180 000陽(yáng)性條帶，BP180 ELISA結(jié)果為198 U/L。

對(duì)照組表皮側(cè)蛋白Western印跡檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖3。6例天皰瘡患者中1例RMM為160 000的陽(yáng)性條帶，2例為130 000陽(yáng)性條帶，其余患者未出現(xiàn)陽(yáng)性條帶。

討 論

本研究中，考馬斯亮藍(lán)染色檢測(cè)顯示熱分離法制備的表皮側(cè)蛋白R(shí)MM多集中在40 000～60 000、15 000以下和240 000以上，RMM為150 000～240 000之間的蛋白相對(duì)較少，說(shuō)明基底膜帶表皮側(cè)蛋白豐度低，并且提取過(guò)程容易造成胞膜蛋白組成和結(jié)構(gòu)損傷，因此將基底膜帶表皮側(cè)相關(guān)蛋白質(zhì)從復(fù)雜物質(zhì)體系中提取出來(lái)難度很大。表皮側(cè)蛋白提取過(guò)程中最重要的是避免蛋白降解，因此皮膚組織轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中應(yīng)當(dāng)做到以下3點(diǎn)：①實(shí)驗(yàn)常規(guī)耗材及儀器嚴(yán)格消毒或滅菌；②低溫處理，且從包皮切取到實(shí)驗(yàn)操作間隔不宜超過(guò)1 h；③將包皮組織裝入含有滅菌10%胎牛血清-DMEM溶液中。采用液氮研磨破碎組織，可以更好地保持目的蛋白的化學(xué)性質(zhì)，同時(shí)有效避免蛋白酶對(duì)目的蛋白的降解［9］。經(jīng)典的表皮抗原提取液主要成分為2% SDS，SDS去垢能力強(qiáng)，但溫和性不夠理想，因此操作過(guò)程中應(yīng)動(dòng)作輕柔，避免氣泡產(chǎn)生，并需要剪切DNA以避免其影響蛋白提取。組織樣品過(guò)多會(huì)超過(guò)裂解液溶解的能力，反而會(huì)使導(dǎo)致目的蛋白提取不充分，因此我們推薦表皮側(cè)組織樣品與裂解液的比例為250 g/L。由于表皮側(cè)目的蛋白分子量較大，我們建議蛋白變性條件為100℃水浴10 min，必要時(shí)可在上樣前高速離心（13 000 r/min，離心半徑5 cm，5 min）。

表1 熱分離法制備的BP表皮側(cè)蛋白Western印跡和BP180 NC16A ELISA檢測(cè)結(jié)果 例

圖2 熱分離制備的22例大皰性類(lèi)天皰瘡患者表皮側(cè)蛋白Western印跡結(jié)果M：蛋白分子標(biāo)記物；1～22：患者序號(hào)

圖3 熱分離制備的25例非大皰性類(lèi)天皰瘡患者表皮側(cè)蛋白Western印跡結(jié)果M：蛋白分子標(biāo)記物；1～25：患者序號(hào)

目前表皮側(cè)蛋白Western印跡在皰病診斷中的可操作性及其特點(diǎn)仍然不是非常明確。BP180 NC16A ELISA試劑盒以BP180 NCl6A融合蛋白為包被抗原，并確定分界值為9 U/ml，這樣可避免因?yàn)橹亟M蛋白來(lái)源和長(zhǎng)度不同及分界值方法不同而引起的誤差，能夠?yàn)榕R床提供客觀、重復(fù)性好的定量數(shù)據(jù)，為表皮側(cè)蛋白Western印跡結(jié)果比較提供了良好對(duì)照。我們發(fā)現(xiàn)，表皮側(cè)蛋白Western印跡、BP180 NC16A ELISA診斷BP的敏感性分別為86.36%、95.45%，而且，18例RMM為180 000條帶陽(yáng)性的BP患者BP180 NC16A ELISA結(jié)果均大于90 U/L，1例RMM為120 000條帶陽(yáng)性的BP患者BP180 NC16A ELISA值為53.3 U/L，3例表皮側(cè)蛋白Western印跡陰性的BP患者，其ELISA結(jié)果分別為0、13、48.2 U/ml，提示表皮側(cè)蛋白Western印跡實(shí)驗(yàn)與BP180 NC16A ELISA相比敏感性并不是很高，當(dāng)患者自身抗體滴度較低時(shí)其結(jié)果往往為陰性。表皮側(cè)蛋白Western印跡、BP180 NC16A ELISA特異性結(jié)果分別為100%、92%，實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，表皮側(cè)蛋白Western印跡特異性高，該法為BP確診提供了一個(gè)可靠的診斷方法［10-11］。

目前已經(jīng)證實(shí)，BP180 NC16A的近膜端包含有BP的病理性抗原決定簇，是致病性自身抗體識(shí)別的主要靶表位［6］，表皮分離及蛋白提取方法逐漸調(diào)整為更加有效地提取細(xì)胞膜相關(guān)蛋白及避免其降解，這也是目前表皮側(cè)蛋白Western印跡方法檢測(cè)BP180較檢測(cè)BP230更加敏感的原因之一［12-13］。BP180有兩種可溶性胞外區(qū)結(jié)構(gòu)，其RMM分別為120 000和97 000，均包含NC16A表位，因此我們對(duì)BP患者行表皮側(cè)蛋白Western印跡檢測(cè)可發(fā)現(xiàn)RMM為120 000和97 000的蛋白條帶。

綜上，對(duì)BP患者行表皮側(cè)蛋白Western印跡檢測(cè)主要陽(yáng)性條帶RMM為180 000。表皮側(cè)蛋白免疫印跡敏感性低于BP180 NC16A ELISA，當(dāng)患者自身抗體滴度較低時(shí)表皮側(cè)蛋白Western印跡結(jié)果往往為陰性。熱分離法制備表皮側(cè)蛋白簡(jiǎn)單、方便，以此為底物行Western印跡可進(jìn)一步明確自身免疫性表皮下水皰病靶抗原，將來(lái)可以通過(guò)選擇新的底物（富含半橋粒的角質(zhì)形成細(xì)胞）、優(yōu)化表皮側(cè)蛋白制備過(guò)程，提純血清抗體等多種途徑，進(jìn)一步提高表皮側(cè)蛋白Western印跡的敏感性。