Bacillus subtilisS21產(chǎn)抗菌脂肽分離鑒定及半固態(tài)發(fā)酵工藝初探

■田秋月 劉 杰 張 亮 胡美忠

（銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院，貴州銅仁554300）

養(yǎng)殖業(yè)中抗生素濫用帶來抗生素殘留、耐藥菌出現(xiàn)等公共衛(wèi)生問題，迫切需要尋找新的藥物來替代抗生素在養(yǎng)殖業(yè)中的應(yīng)用。Surfactin和Fengycin是芽孢桿菌屬產(chǎn)生的脂肽。Surfactin是由七個氨基酸和β羥基脂肪酸鏈組成的環(huán)狀脂肽[1]，具有廣譜高效抗菌[2]、抗病毒活性[3]，對支原體和原蟲有顯著的抑制效果[4]，對畜禽具有很好的促生長、抗氧化、抗菌、增強機體免疫力及改善肉質(zhì)品質(zhì)等作用[5-6]，是一種潛在的新型綠色抑菌促生長飼料添加劑。Fengycin呈環(huán)狀結(jié)構(gòu)，由β羥基脂肪酸鏈和十個氨基酸殘基構(gòu)成，具有良好的抗絲狀真菌活性，可用來防治絲狀真菌污染[7]。

芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌脂肽Surfactin和Fengycin有區(qū)別于傳統(tǒng)抗生素的抗菌機制，不易產(chǎn)生耐藥性，且對耐藥菌株有良好的抑制效果[8]，在動物生產(chǎn)中具有替代抗生素的潛力，近年來受到關(guān)注，如都海明等[9]研究了枯草芽孢桿菌fmbj產(chǎn)抗菌脂肽對肉雞生產(chǎn)性能及免疫機能的影響，結(jié)果表明添加4 000 U/kg抗菌脂肽能促進(jìn)肉雞的生長發(fā)育和提升免疫機能。翟少偉等[10]實驗了不同抗菌脂肽添加物對吉富羅非魚增重、血清生化指標(biāo)的影響，結(jié)果表明抗菌脂肽添加物可提升吉富羅非魚增重，有利于其血清生化指標(biāo)。

本文分離鑒定了一株枯草芽孢桿菌產(chǎn)的抗菌物質(zhì)，并對其產(chǎn)量提升做了優(yōu)化，以期為促進(jìn)安全、環(huán)保新型飼料添加劑的開發(fā)提供思路，實現(xiàn)我國畜牧業(yè)健康安全可持續(xù)發(fā)展。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 培養(yǎng)基及菌種

landy培養(yǎng)基：葡萄糖20 g、酵母粉1 g、磷酸二氫鉀1 g、七水硫酸鎂0.5 g、L-谷氨酸0.5 g、氯化鉀0.5 g、硫酸錳0.005 g、L-苯丙氨酸0.002 g、五水硫酸銅0.001 6 g、七水硫酸亞鐵0.001 5 g、水1 L、pH值7。

LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨10 g、氯化鈉10 g、酵母粉5 g、純凈水1 L，pH值7.2。

菌種：枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）S21，民族中獸藥分離純化技術(shù)國家地方聯(lián)合工程研究中心中獸藥微生物發(fā)酵研究室篩選鑒定，金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）（ATCC 25923），購自 Ameri?can type culture collection。

1.1.2 主要儀器

超凈工作臺（ZHJH-C1214C，上海智城）；安捷倫1100型液相色譜儀；安捷倫G6400液質(zhì)聯(lián)用儀；高壓滅菌鍋（HVE-50，北方華粵）；pH計（DELTA 320，上海閔勝）；恒溫培養(yǎng)箱（BPH-9042，上海一恒）。

1.2 方法

1.2.1B.subtilisS21產(chǎn)抗菌脂肽發(fā)酵生產(chǎn)及初步分離

吸取微量-70℃保藏的B.subtilisS21菌液，轉(zhuǎn)置于LB培養(yǎng)基，37℃過夜培養(yǎng)至菌長出，接種環(huán)沾取微量菌液于LB固體培養(yǎng)基劃線培養(yǎng)，待長出菌落，挑取長勢良好的單菌落接種于landy培養(yǎng)基，37℃培養(yǎng)12 h作為種子液，種子液按1%（v/v）接種于landy培養(yǎng)基，180 r/min，37 ℃培養(yǎng)36 h，得發(fā)酵液。用3 mol/l HCl調(diào)節(jié)發(fā)酵液pH值至2，攪拌均勻后，靜置于4℃下12 h后，8 000×g離心得沉淀，沉淀加入原發(fā)酵液0.5倍體積甲醇（調(diào)節(jié)pH值至7），磁力攪拌10 min，8 000×g離心得上清液，重復(fù)甲醇萃取沉淀一次，合并甲醇萃取液，旋轉(zhuǎn)蒸干，殘渣用少量蒸餾水溶解，得粗抗菌脂肽提取物。

1.2.2B.subtilisS21產(chǎn)抗菌脂肽純化

粗抗菌脂肽初提物使用LH-20進(jìn)一步分離純化，洗脫液為純甲醇，流速1 ml/5 min，以金黃色葡萄球菌（ATCC 25923）做為指示菌，采用瓊脂擴(kuò)散法（制備帶金黃色葡萄球菌平板，5 mm打孔器打孔，孔中加入洗脫液80 μl，37℃下培養(yǎng)24 h后測量抑菌圈直徑）檢測各管洗脫液的活性，得抗菌脂肽精提物。

1.2.3 抗菌脂肽鑒定

抗菌脂肽精提物使用安捷倫1100型液相色譜HPLC檢測，色譜條件：色譜柱5 TC-C18；波長210 nm；流速1 ml/min；時間0～20 min；90%乙腈-90%乙腈(有機相和水相均含0.1%三氟乙酸)。使用安捷倫G6400三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行質(zhì)譜鑒定，根據(jù)質(zhì)譜圖推斷其結(jié)構(gòu)。

1.2.4B.subtilisS21產(chǎn)Surfactin非無菌半固態(tài)發(fā)酵初探

前期探索性實驗發(fā)現(xiàn)，利用黃豆作為主要培養(yǎng)基質(zhì)，采用半固態(tài)發(fā)酵方式，B.subtilisS21產(chǎn)Surfactin產(chǎn)量比使用landy培養(yǎng)基高出50～100余倍。經(jīng)過查閱文獻(xiàn)，結(jié)合實驗過程中的經(jīng)驗發(fā)現(xiàn)，是否添加碳源（從葡萄糖、麥芽糖、淀粉、蔗糖四種碳源中選擇最佳的葡萄糖）和無機鹽體系（七水硫酸鎂0.5 g/l、氯化鉀0.5 g/l、硫酸錳0.005 g/l、五水硫酸銅 0.001 6 g/l、七水硫酸亞鐵0.001 5 g/l，選自landy培養(yǎng)基的無機鹽體系）對Surfactin產(chǎn)量影響極為明顯；另外，發(fā)酵時間和溫度對Surfactin產(chǎn)量也有影響，故采用Minitab軟件設(shè)計四因素三水平正交實驗篩選B.subtilisS21產(chǎn)Sur?factin的半固體發(fā)酵最佳方法，因素水平見表1。

表1B.subtilisS21半固體發(fā)酵培養(yǎng)因素水平

Surfactin液相檢測色譜方法：色譜柱5 TC-C18；波長210 nm；流速1 ml/min；時間：0～20 min；90%乙腈-90%乙腈(有機相和水相均含0.1%三氟乙酸)。同色譜條件下檢測精密配制的Surfactin（sigma）標(biāo)準(zhǔn)品梯度溶液含量，制作Surfactin標(biāo)準(zhǔn)品濃度與峰面積關(guān)系的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

半固體發(fā)酵流程為：市售黃豆，粉碎成粗顆粒(1粒黃豆裂成約2～4片)，冷水蓋住黃豆浸泡12 h后蒸熟，趁熱把黃豆顆粒盛入用開水淋洗的帶蓋托盤，黃豆厚度約2～3 cm，待冷卻后，接入黃豆重量5%（v/g）的B.subtilisS21種子液，同時按表1所示的比例加入葡萄糖和無機鹽體系。

待發(fā)酵完成，使用甲醇萃取發(fā)酵的黃豆2～3次，合并萃取液，高效液相色譜法檢測甲醇萃取液中Sur?factin的峰面積，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算其含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 B.subtilisS21產(chǎn)抗菌脂肽的純化鑒定

2.1.1 Surfactin鑒定

抗菌脂肽精提物高效液相色譜HPLC檢測，得到圖1所示峰。從圖1可以看出，此抗菌脂肽提取物出現(xiàn)四個峰，保留時間與標(biāo)準(zhǔn)品Surfactin保留時間一致，初步判定此四個峰為Surfactin同系物。

圖1B.subtilisS21產(chǎn)抗菌脂肽高效液相色譜圖（A）及與Surfactin標(biāo)準(zhǔn)品對照圖（B）

B.subtilisS21產(chǎn)抗菌脂肽質(zhì)譜鑒定結(jié)果見圖2，由圖2可知，出現(xiàn)了994.5、1 008.5、1 022.6、1 036.5四個＜M+H＞離子峰，之間相隔分子量為14，即CH2-，且分子量與Surfactin同系物一致，進(jìn)一步判斷為Surfac?tin同系物。

選擇液相圖中保留時間靠后的三個峰進(jìn)一步進(jìn)行質(zhì)譜分析，結(jié)果見圖3（A,B,C），從圖3（A）可知，出現(xiàn)了＜M+H＞為1 008.9的加 H 離子峰，＜M+Na＞為1 030.7的加Na離子峰，從圖3（B）可知，出現(xiàn)了＜MCH2+H＞為 1 022.6的 H 離子峰，＜M-CH2+Na＞為1 044.5的加Na離子峰，從圖3（C）可知，出現(xiàn)了＜MCH2-CH2+H＞為1 036.5的H離子峰，＜M-CH2-CH2+Na＞為1 058.3的加Na離子峰。對1 008.5、1 022.6、1 036.5進(jìn)行二級質(zhì)譜鑒定，結(jié)果見圖3(a,b,c)，根據(jù)二級質(zhì)譜裂解碎片及文獻(xiàn)資料[11-13]，可以推斷出此抗菌脂肽結(jié)構(gòu)為：β-OH-C13-15-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu（Ile）。分別計算對應(yīng)分子量1 007、1 021、1 035。其中第七位Leu還有可能為Ile，具體是哪一個氨基酸殘基有待進(jìn)一步分析，推斷過程見圖3a、b、c所示。

一級質(zhì)譜中出現(xiàn)的994加H離子峰，根據(jù)Surfac?tin同系物相差CH2-的特性，推斷其結(jié)構(gòu)為β-OHC12-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu（Ile）。

綜合所得，B.subtilisS21產(chǎn)Surfactin的四種同系物為：β-OH-C12-15-Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu（Ile）。

2.1.2 Fengycin鑒定

在對B.subtilisS21產(chǎn)粗抗菌脂肽的抑菌譜實驗中發(fā)現(xiàn)（數(shù)據(jù)未列出），B.subtilisS21產(chǎn)粗抗菌脂肽對黑曲霉表現(xiàn)出抑制活性，證明B.subtilisS21產(chǎn)抗菌脂肽除了Surfactin（不具備霉菌抑制活性）外，還產(chǎn)生其他抗菌脂肽。在使用LH-20純化的某一管洗脫液質(zhì)譜鑒定過程中（見圖4），出現(xiàn)了＜M+H＞為1 462.9的加H離子峰，＜M+Na＞為1 484.1的加Na離子峰，＜M-CH2+H＞為1 476.9加H離子峰，＜M-CH2+H＞為1 499.6的加Na離子峰，＜M-CH2-CH2+H＞為1 490.9加H離子峰，＜M-CH2-CH2+H＞為1 513.6的加Na離子峰，對＜M+H＞為1 476.9進(jìn)行二級質(zhì)譜，可以發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)了1 109和995的加氫碎片離子，而1 108和994是Fengycin B的特征性片段[14-15]，故推斷此抗菌脂肽為Fengycin B（C14-16）,氨基酸殘基序列為 Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Val-Pro-Gln-Tyr-Ile。

2.2 B.subtilisS21產(chǎn)Surfactin非無菌半固態(tài)發(fā)酵初探

2.2.1 Surfactin標(biāo)準(zhǔn)曲線

采用液相色譜測定，得到了Surfactin標(biāo)準(zhǔn)品峰面積與濃度（mg/ml）的關(guān)系函數(shù)。

圖2B.subtilisS21產(chǎn)抗菌脂肽一級質(zhì)譜圖

圖3B.subtilisS21產(chǎn)Surfactin鑒定流程

式中：y——峰面積；

x——濃度。

2.2.2 非無菌半固態(tài)發(fā)酵配方

采用Minitab軟件設(shè)計四因素三水平正交實驗，B.subtilisS21產(chǎn)Surfactin非無菌半固態(tài)發(fā)酵實驗設(shè)計及結(jié)果見表2。

從表2可以看出，影響B(tài).subtilisS21產(chǎn)Surfactin的因子為D（發(fā)酵溫度）＞B（葡萄糖）＞C（發(fā)酵時間）＞A（無機鹽體系）。根據(jù)均值效應(yīng)，可以得出此發(fā)酵條件下B.subtilisS21產(chǎn)Surfactin最佳的方法為A3B2C3D2，即無機鹽體系添加20%，葡萄糖添加5%，發(fā)酵時間48 h，發(fā)酵溫度37℃，驗證實驗表明此條件下Surfac?tin產(chǎn)量可達(dá)到4.02 mg/g，比原始landy培養(yǎng)基的產(chǎn)量22.1 mg/l(為B.subtilisS21菌株在landy培養(yǎng)基中Sur?factin的產(chǎn)量)增加了180余倍（landy培養(yǎng)基1 L按黃豆1 kg計）。

3 討論

芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌脂肽基于其抗菌抗病毒功效及安全無毒的特性，在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景，特別是在當(dāng)今尋找動物生產(chǎn)中抗生素替代品領(lǐng)域具有很大潛力。芽孢桿菌產(chǎn)生的常見抗菌脂肽多種多樣，有Surfactin、Fengycin、iturin等[16-17]，抗菌脂肽有不同的同系物，不同的抗菌脂肽及同種抗菌脂肽的同系物其作用功效有區(qū)別，故為了科學(xué)利用芽孢桿菌產(chǎn)生的抗菌脂肽，就有必要弄清其結(jié)構(gòu)[18]。芽孢桿菌產(chǎn)抗菌脂肽成熟的鑒定方法為質(zhì)譜法，利用抗菌脂肽的特征碎片離子峰可以快速鑒定出其結(jié)構(gòu)。

圖4B.subtilisS21產(chǎn)Fengycin鑒定過程

Surfactin典型結(jié)構(gòu)為不同長度的β羥基脂肪酸鏈（一般為C13-15）和Glu-Leu-Leu-Val-Asp-Leu-Leu通過內(nèi)酯鍵連接而成的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，其斷裂片段為特征離子峰，β羥基脂肪酸鏈鏈長和七肽的氨基酸殘基組成在不同芽孢桿菌產(chǎn)生的Surfactin有可能不同，故Surfactin存在許多同系物，但主要存在兩種類型，即7位上的氨基酸是Leu或Val。Fengycin典型結(jié)構(gòu)為不同長度的β-羥基脂肪酸鏈（一般為C14-18）和Glu-Orn-Tyr-Thr-Glu-Ala(Val)-Pro-Gln-Tyr-Ile組成環(huán)狀結(jié)構(gòu)，主要有Fengycin A和Fengycin B兩種，當(dāng)肽鏈的6位上是Ala時，屬于Fengycin A；而當(dāng)肽鏈的6位上是Val時，屬于Fengycin B[19]，在質(zhì)譜鑒定上，主要看其裂解的特征離子峰，F(xiàn)engycin A會出現(xiàn)1 080和966的特征峰，F(xiàn)engycin B則會出現(xiàn)1 108和994的特征峰。

表2B.subtilisS21產(chǎn)Surfactin正交實驗設(shè)計

雖然Surfactin在醫(yī)藥、食品等領(lǐng)域有廣闊的應(yīng)用前景，但是目前最大的問題是Surfactin產(chǎn)量低，且存在分離純化成本高的問題。目前Surfactin生產(chǎn)主要通過液態(tài)發(fā)酵生產(chǎn)，但是產(chǎn)量極低，野生株型產(chǎn)量達(dá)到30 mg/l已經(jīng)是高產(chǎn)，且發(fā)酵過程會遇到發(fā)泡，液態(tài)發(fā)酵分離純化難等問題[20]，故針對芽孢桿菌代謝特點，利用半固態(tài)發(fā)酵可以杜絕發(fā)泡難題，且半固體發(fā)酵節(jié)省了固液（水）分離步驟，可直接使用有機溶劑固液萃取，解決了液態(tài)發(fā)酵分離純化難等難題，另外利用優(yōu)勢菌群的原理，在非嚴(yán)格無菌狀態(tài)下可以完成發(fā)酵，能大量節(jié)省(如嚴(yán)格滅菌)成本。Surfactin產(chǎn)量上，一是利用誘變和分子生物學(xué)手段對菌種進(jìn)行改造，二是篩選能大幅度影響Surfactin產(chǎn)量的關(guān)鍵培養(yǎng)基質(zhì)，通過這兩種方法，Surfactin產(chǎn)量可以比野生菌株提高數(shù)百倍，本文利用關(guān)鍵培養(yǎng)基質(zhì)黃豆，可輕易提升Surfactin產(chǎn)量百余倍。