飼料中添加脫毒劑對異育銀鯽肌肉中恩諾沙星殘留的影響

■胡雅楠 白卓安 周 婧 韓雨哲 葉仕根 王連順 劉真衛(wèi) 任同軍*

（1.大連海洋大學農業(yè)農村部北方海水增養(yǎng)殖重點實驗室，遼寧大連116023；2.北京二商生物科技有限公司，北京100000）

恩諾沙星（Enrofloxacin）又名乙基環(huán)丙沙星、恩氟沙星，屬于氟喹諾酮類（Fluoroquinolones，FQs）,是第三代喹諾酮類（Quinolones）藥物，廣泛應用于水產動物感染性疾病的預防和治療[1]。隨著我國水產養(yǎng)殖集約化程度不斷提高，水產動物病害迅速增多，對魚藥的需求大大增加，濫用藥物等時有發(fā)生，致使魚體藥物殘留超標，藥物富集，危害食品安全。在貴陽市場檢測淡水魚體內中氟喹諾酮類抗生素（FQs）的殘留情況發(fā)現，恩諾沙星和氧氟沙星殘留量均超過最大允許限量[2]。魚藥在動物體內殘留得到社會廣泛關注。

鯽（Carassius auratus），屬鯉形目，肉細嫩，味鮮美，為重要食用魚類和養(yǎng)殖對象[3]。近十多年來，隨著我國水產品進出口量的持續(xù)增長，鯽魚的養(yǎng)殖規(guī)模和養(yǎng)殖潛力也越來越大，其2016年總產量現已超過300萬噸，是產量穩(wěn)定持續(xù)增長的淡水經濟魚類之一,在我國的淡水養(yǎng)殖中占據十分重要的地位[4]。

研究表明，恩諾沙星在水產動物體內代謝消除速率比較慢，需要較長的停藥期[1]。目前對恩諾沙星在水產動物的研究，主要在機體內的藥物動力學及代謝消除速率等方面的研究，對降低水產動物體內恩諾沙星的殘留量或加快恩諾沙星在機體內代謝的研究很少。本研究以異育銀鯽（Carassius auratus gibelio）為試驗對象，采用拌料給藥方式，研究異育銀鯽口服新型脫毒劑后，體內恩諾沙星及代謝產物的殘留量，控制恩諾沙星及其代謝產物在異育銀鯽體內殘留，為水產養(yǎng)殖行業(yè)提供用藥參考。

1 材料與方法

1.1 試驗飼料

試驗飼料以魚粉、豆粕、玉米面、面粉、米糠、預混料、微晶纖維素為主要原料，將其混合均勻制作成基礎飼料（C），恩諾沙星組（E）飼料在基礎飼料中添加恩諾沙星(北京索萊寶科技有限公司，純度≥98%)，脫毒組（RE）飼料在基礎飼料中添加脫毒劑（北京二商生物科技有限公司）。具體飼料配方見表1。將飼料成分混勻后，放入制粒機（東南干燥設備有限公司，XL-250）壓成粒徑為3 mm的顆粒。飼料做好后放入-20℃冰箱保存。

表1 飼料配方（g/100 g）

1.2 試驗魚及飼養(yǎng)

健康無病害的異育銀鯽來自于上海市海豐水產養(yǎng)殖有限公司，光明漁業(yè)養(yǎng)殖場，初始體重[（204.5±10.30)g]的126尾。試驗前將鯽暫養(yǎng)一周并投喂基礎飼料以適應試驗環(huán)境。試驗前禁食24 h，將126尾試驗魚隨機分配到2×3個1噸圓形水槽中，每槽21尾，分為兩組，每組3個重復。24 h連續(xù)充氣。飼養(yǎng)試驗進行28 d，期間每天按照體重的1.5%投喂一次（18:00），投喂0.5 h后利用虹吸法吸取殘餌糞便，吸污后換水，換水量占總水體的1/3。養(yǎng)殖過程中每日觀察魚的攝食情況，水體溫度為17.2～18.0℃，溶解氧大于6 mg/l，pH值為7.3～7.8（n=28）。

1.3 試驗方法與樣品采集

1.3.1 建立抗生素模型

馴養(yǎng)后，對照組投喂基礎飼料（C），恩諾沙星組（E）投喂含有恩諾沙星的飼料。6 d后，饑餓處理24 h，每缸隨機取3條試驗魚測定其體重，之后用2 ml注射器魚尾靜脈采血（提前用肝素鈉溶液潤洗），4℃靜置24 h，4 ℃、3 000 r/min離心10 min，取上清，用于測定血清酶。取血后于冰袋上解剖，取出肝胰臟，置于液氮中速凍，再保存到-80℃冰箱中用于分析非特異性免疫活性，取肌肉保存到-20℃冰箱，用于測定恩諾沙星含量。

1.3.2 脫毒試驗

將已建立抗生素模型的試驗魚均分為兩組，分別投喂添加脫毒劑的飼料（RE）和基礎飼料（GE）連續(xù)投喂21 d。分別在試驗第14、21 d和28 d，每缸隨機取3條，取肌肉檢測恩諾沙星含量。28 d后參照第6 d方法采樣測定血清及肝胰臟的非特異免疫酶。

1.4 恩諾沙星含量測定

1.4.1 提取和凈化

取魚肌肉適量搗碎均勻，稱取均質肌肉5.0 g，置于50 ml聚丙烯離心管中，加入20 ml 0.1 mol/l EDTA Mellvaine緩沖液，1 000 r/min漩渦混合1 min，超聲提取 10 min，4℃下1 000 r/min離心5 min，提取三次，合并上清液。HLB固相萃取柱（20 mg，6 ml）,使用時用6 ml水活化。將上清液以2～3 ml/min的速度過柱，棄去濾液，用2 ml 5%的甲醇水溶液淋洗，將小柱抽干，再用6 ml甲醇洗脫并收集洗脫液。用氮氣吹干洗脫液，用1 ml 0.2%甲酸水溶液溶解，1 000 r/min漩渦混合1 min，用于Agilent（6470）高效液相色譜儀測定。

1.4.2 色譜條件

色譜柱為反相色譜柱C18柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)，流動相為A（甲醇∶乙腈溶液=40∶60）和B（0.2%甲酸溶液），流速為0.2 ml/min，激發(fā)波長為280 nm，發(fā)射波長為 450 nm，柱溫為 40℃，進樣量為20 μl。在該色譜條件下，恩諾沙星(20 ng/ml)的保留時間分別為5.84 min。

1.5 肝胰臟非特異性免疫指標測定

準確稱取組織樣品，在4℃冰箱緩溶，肝胰臟按質量體積比1∶9（W/V）的比例加入0.9%的生理鹽水，在冰浴條件下勻漿制成組織勻漿，之后以2 500 r/min，4℃條件下，離心10 min,取上清液保存在-80℃?zhèn)溆?。肝胰臟抗氧化酶：堿性磷酸酶（AKP）、過氧化氫酶（CAT）、超氧化物歧化酶（SOD）、總抗氧化能力（TAOC）和丙二醛（MDA）均使用南京建成生物工程研究所的試劑盒測定。

1.6 血清酶測定

鯽的血清酶主要使用迪瑞CS-300B全自動生化分析儀（長春迪瑞醫(yī)療科技股份有限公司）檢測谷草轉氨酶（AST）、堿性磷酸酶(AKP)和肌酐(CREA)。

1.7 數據處理及統計分析

數據以“平均值±標準差（mean±SD）”表示，試驗結果用SPSS 21.0軟件進行單因素方差分析，用Tukey's多重比較對全部處理組進行方差分析，檢驗組間差異是否顯著，以P＜0.05為顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 脫毒劑對恩諾沙星在鯽肌肉中殘留的影響(見圖1)

圖1 飼料中添加脫毒劑對鯽肌肉中恩諾沙星含量的影響

如圖1所示，飼料中添加脫毒劑能夠顯著降低鯽肌肉中恩諾沙星含量。RE組鯽肌肉中的恩諾沙星含量分別在14、21 d和28 d比GE組降低87.08%，44.97%和28.97%（P＜0.05）。RE組鯽肌肉中的恩諾沙星含量在7～14 d時消除速度較快，14 d后消除速度變慢直至21 d后基本趨于平穩(wěn)。GE組21 d后，恩諾沙星在鯽肌肉中消除速度趨于平穩(wěn)。

2.2 恩諾沙星對鯽肝胰臟抗氧化能力及MDA含量的影響（見表2）

表2 飼料中添加脫毒劑對鯽肝胰臟酶活的影響

如表2所示，與C組相比，投喂恩諾沙星6 d后，E組SOD活性顯著下降（P＜0.05），AKP、CAT、T-AOC活性和MDA含量都略有下降，但無顯著性差異。隨著RE組恩諾沙星的減少，肝胰臟AKP、SOD、T-AOC活性和MDA含量顯著低于GE組（P＜0.05）。

2.3 恩諾沙星對鯽血清酶的影響(見表3)

表3 飼料中添加脫毒劑對鯽血液酶活的影響

如表3所示，投喂添加恩諾沙星的飼料6 d與對照組相比，E組的AST和AKP活性都顯著升高，28 d后，RE組AST和AKP活性顯著高于C組，且AST活性顯著低于GE組（P＜0.05）。CREA均無顯著差異（P＞0.05）。

3 討論

3.1 脫毒劑對恩諾沙星在鯽肌肉中殘留的影響

藥物在牛、犬、兔、雞等動物體內發(fā)生代謝反應的類型和程度不盡相同，恩諾沙星在異育銀鯽體內以原藥存在形式達98%，部分恩諾沙星脫乙基后可以產生活性代謝物環(huán)丙沙星（＜0.30%）[5]。本研究結果發(fā)現，采取拌料給藥的方式給予鯽恩諾沙星后，鯽肌肉中有大量恩諾沙星蓄積,這與徐維海等[6]研究結果相似。RE組鯽肌肉中的恩諾沙星含量分別在14、21 d和28 d比GE組降低87.08%、44.97%和28.97%（P＜0.05）。且RE組鯽肌肉中恩諾沙星的含量在14 d低于安全濃度（＜100 μg/kg）[7]，但GE組鯽肌肉中恩諾沙星含量在28 d時，仍然高于安全濃度。由此飼料中添加0.05 g/100 g的脫毒劑促進了恩諾沙星在鯽體內的消除，降低了恩諾沙星的殘留量，縮短了恩諾沙星的休藥期。藥物在體內的代謝反應通常分為Ⅰ相反應（又稱引入官能團反應，包括氧化、還原、水解和異構化等）和Ⅱ相反應（即結合反應，藥物或者Ⅰ相代謝產物的極性基團與內源性物質生成結合物）[8]。恩諾沙星在體內的Ⅰ相代謝反應是N-去烷氧化，其中細胞色素酶P450發(fā)揮重要作用。另一方面陳念祖等[9]研究表明硒能夠提高細胞色素氧化酶的活性。由此推測脫毒劑中含有的硒增強了細胞色素氧化酶，加快了恩諾沙星N-去烷氧化，促進了恩諾沙星在鯽體內的代謝。

3.2 恩諾沙星對鯽肝胰臟抗氧化能力及MDA含量的影響

肝臟的代謝功能主要依賴于肝內酶的作用，肝內酶含量及種類極其豐富，同時肝臟是外源性化合物在體內進行生物轉化的主要器官，當外源性中毒引起動物肝臟發(fā)生損傷時，相應地引起血清中一系列相關酶發(fā)生變化[10]。AKP是一種對底物專一性要求較低的磷酸單酯水解酶，是重要的解毒系統，廣泛存在于動物的血液和各種器官內，能夠通過改變病原體的表面結構，增強被侵襲機體對病原體的識別和吞噬能力，是水產動物生理活動和疾病診斷的一項重要指標。朱建勇等[11]研究表明恩諾沙星對鯽魚的AKP具有一定的誘導作用，在給藥后的第5 d，藥物在魚體肝臟和腎臟組織內濃度逐漸升高，到第10 d，肝臟和腎臟的AKP活性達到最高水平。本試驗結果顯示，AKP活性在28 d后仍然顯著高于C組，但RE組顯著低于GE組，原因可能是RE組恩諾沙星含量顯著低于GE組，RE組肝胰臟功能開始恢復。SOD是一種重要的抗氧化酶，通過清除氧自由基來防止生物分子損傷。SOD是生物體內唯一的以為底物的酶，可催化發(fā)生歧化反應生成 H2O2，反應方程式為+。Wise等[12]曾報道,長期使用恩諾沙星,對魚的肝胰臟有較大的毒副作用。熊鏵龍等[13]研究表明雜交鱘肝臟抗氧化酶活性隨著恩諾沙星的暴露呈先誘導后抑制變化，且酶被誘導時間隨恩諾沙星的質量濃度升高而下降。本試驗高質量濃度恩諾沙星處理鯽6 d后，SOD活性顯著下降,已經處于抑制階段。28 d后，恩諾沙星含量已低于安全濃度，SOD活性顯著高于C組，應處于誘導階段。這與環(huán)丙沙星處理鯽后GSH活性變化類似[14]。聶湘平等[14]推測隨著暴露時間的延長和恩諾沙星濃度下降，恩諾沙星不足以對酶蛋白產生了破壞時可能對SOD合成的酶活性產生誘導，導致SOD合成增強，含量增加。GE組恩諾沙星含量顯著高于RE組，其SOD含量也受誘導作用較強。過氧化氫在CAT的作用下生成水和氧氣，消除氧自由基對機體的氧化損傷[15]，本試驗恩諾沙星處理6 d后CAT無顯著性變化，28 d后，RE組和GE組CAT活性顯著高于對照組和E組，可能是異育銀鯽體內CAT活性的響應比較滯后于藥物的積累時間。隨著暴露時間的延長和恩諾沙星濃度的下降,恩諾沙星對CAT的合成產生誘導作用。T-AOC就是一個體系中的大小分子和酶總和的水平，體現了該體系的抗氧化能力總和[16]。當污染物存在，機體為了要清除因污染物脅迫產生的提高的氧自由基量而加快了抗氧化酶蛋白的合成，造成酶分泌的增加，這是機體正常的應激反應[17]。GE組T-AOC顯著高于RE組，應該是魚體內仍然存在較高的恩諾沙星，對鯽肝胰臟抗氧化能力的應激作用。且值得注意的是，MDA是脂質過氧化的最終產物，并且測量MDA水平可以反映動物的脂質過氧化程度。在外部環(huán)境破壞的情況下，氧自由基會攻擊多不飽和脂肪酸的生物膜，導致體內脂質過氧化。E組的MDA含量沒有顯著性變化，GE組的MDA含量顯著高于RE組，并與對照組差異不顯著，表明GE組機體仍然受到損害。

3.3 恩諾沙星對鯽血清酶的影響

魚類的血清生理生化指標與機體的代謝、營養(yǎng)狀況及疾病有著密切的關系，當魚體受到外界因子的影響而發(fā)生生理或病理變化時，必定會在血液指標中反映出來[18]。血清生化指標是反映動物環(huán)境應激時體內物質代謝和組織器官機能狀態(tài)變化的一個重要特征[19]。當機體某些因素使細胞膜遭受破壞，使其內的酶釋放入血液的速度大大增高，血清中酶的活性才明顯升高[20]。AST催化谷氨酸與草酰乙酸之間的轉氨作用[21],若肝臟損傷導致線粒體受損，AST會大量釋出,使血清AST升高大于ALT[22],血清中AST活性越高，肝損傷則越嚴重。AKP雖然廣泛分布于動物體各臟器器官中，但以酶原的形式存在于肝臟為最多，當肝臟受到損傷或者障礙時經淋巴和肝竇進入血液，同時由于肝內膽道膽汁排泄障礙，反流入血而引起血清堿性磷酸酶明顯升高[23-24]。本試驗結果顯示，在連續(xù)6 d給予鯽高濃度恩諾沙星后，鯽血液中AKP和AST活性顯著升高，表明恩諾沙星對肝細胞造成損傷。28 d后，RE組與GE組AKP和AST活性有回落趨勢,這表明停喂恩諾沙星后,肝胰臟的功能開始恢復。且RE組AST顯著低于GE組，表明RE組鯽機體恢復速度快于GE組。CREA是肌肉組織中儲能物質肌酸代謝的終產物,血清中肌酐濃度可作為腎小球濾過功能受損的指標之一[24]。汪文選等[20]研究表明較低濃度的恩諾沙星對鯽的機體功能無顯著影響。本研究鯽血液中CREA無顯著變化，表明本研究中的恩諾沙星濃度對鯽腎臟無明顯影響。

4 結論

飼料中添加恩諾沙星投喂異育銀鯽6 d，恩諾沙星在鯽肌肉中大量蓄積。飼料中添加脫毒劑投喂異育銀鯽后，RE組鯽肌肉中恩諾沙星在21 d達到安全濃度，較GE組縮短一個星期，說明飼料中添加脫毒劑促進了恩諾沙星在鯽體內的消除，顯著縮短投喂抗生素后的休藥期。