不同倍性虹鱒紅細(xì)胞規(guī)格及血液學(xué)指標(biāo)的比較?

陳落落， 溫海深， 李吉方， 張美昭， 車德釗， 辛苑茹

(海水養(yǎng)殖教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(中國海洋大學(xué))，山東 青島 266003)

生物體一般為二倍體，在自然或人工誘導(dǎo)條件下，染色體組會(huì)成倍地增加產(chǎn)生多倍體，魚類多倍體現(xiàn)象比較普遍，有相當(dāng)數(shù)量的三倍體、四倍體等天然多倍體魚類的存在。多數(shù)三倍體魚類不育，可將能量全部用于體細(xì)胞生長(zhǎng)，從而提高餌料轉(zhuǎn)化率，表現(xiàn)出較好的生長(zhǎng)勢(shì)能。虹鱒(Onchorynchusmykiss)屬于鮭形目(Salmoniformes)鮭科(Salmonidae)大馬哈魚屬(Onchorynchus)[1]。因其性成熟個(gè)體體側(cè)有一條寬而鮮艷的彩虹帶而得名，英文名為rainbow trout，原產(chǎn)于北美地區(qū)，為典型的冷水性魚類，是世界性重要經(jīng)濟(jì)養(yǎng)殖魚類之一和水產(chǎn)遺傳育種領(lǐng)域的重要研究對(duì)象[2]。我國于1959年引進(jìn)虹鱒，由于長(zhǎng)期的近親繁殖以及缺乏系統(tǒng)的選育，導(dǎo)致養(yǎng)殖個(gè)體出現(xiàn)了性早熟、個(gè)體小型化、病害頻發(fā)等問題，不能滿足消費(fèi)者對(duì)大規(guī)格虹鱒的需求，已成為虹鱒養(yǎng)殖業(yè)的瓶頸。因此，進(jìn)行虹鱒三倍化的誘導(dǎo)成為了解決虹鱒養(yǎng)殖規(guī)格問題的關(guān)鍵。

三倍體虹鱒相比于普通二倍體，細(xì)胞核內(nèi)多了一套染色體組，有相關(guān)研究表明，三倍體虹鱒紅細(xì)胞各項(xiàng)數(shù)值都高于二倍體[3]。在山女鱒(Oncorhynchusmasou)中也發(fā)現(xiàn)了類似的結(jié)果，三倍體山女鱒紅細(xì)胞的長(zhǎng)度和寬度分別較二倍體細(xì)胞大24%和19%[4]。在團(tuán)頭魴(Megalobramaamblycephala)中，三倍體紅細(xì)胞和核體積分別是二倍體的1.40和1.51倍[5]。三倍體虹鱒紅細(xì)胞由于染色體組的增加，相應(yīng)地紅細(xì)胞體積較二倍體大。由此通過觀察測(cè)量虹鱒紅細(xì)胞大小可以作為鑒定虹鱒倍性的一種簡(jiǎn)便、快速、經(jīng)濟(jì)的方法。

許多研究表明，魚類的不同倍性對(duì)其各個(gè)組織都具有一定的影響。在湖鱒(Salmotruttalacustris)的研究中發(fā)現(xiàn)，三倍體湖鱒的腎、鰓、腸、脾等組織結(jié)構(gòu)出現(xiàn)了顯著的變化[6]。對(duì)其血液學(xué)指標(biāo)也有顯著影響，在黃顙魚(Pelteobagrusfulvidraco)[7]、鯽(Carassiusauratus)[8]的研究中發(fā)現(xiàn)，由于魚類倍性的增加，血液中紅細(xì)胞數(shù)目、紅細(xì)胞壓積也隨之降低，以保證血紅蛋白含量維持在一定的水平。魚類的血液指標(biāo)始終處于動(dòng)態(tài)平衡中，直接反映了魚類的內(nèi)分泌水平和代謝情況[9]。影響魚類血液生理生化指標(biāo)的因素大致可以分為內(nèi)源因子和外部環(huán)境因子兩類。內(nèi)源因子與魚類的遺傳生理狀況相關(guān)，決定了魚類的血液生理生化特性，并控制著魚類正常血液生理生化指標(biāo)的范圍[10]。魚類的多倍性改變了其染色體組成，可能作為一種內(nèi)源因子改變血液生理生化的指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)采用靜水壓法誘導(dǎo)虹鱒受精卵獲得三倍體，通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行倍性鑒定，并對(duì)二倍體和三倍體虹鱒的紅細(xì)胞及其核的大小、部分血液學(xué)指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定，比較其差異性，以豐富多倍體魚類生理學(xué)研究?jī)?nèi)容，并為血液學(xué)方法鑒定魚類多倍體提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用二倍體虹鱒采用常規(guī)人工繁殖方法獲得，三倍體虹鱒于2016年采用靜水壓法獲得，二、三倍體虹鱒魚均來源于同一批卵。二、三倍體虹鱒分別飼養(yǎng)于山東省濰坊市臨朐玉福淡水漁業(yè)合作社，養(yǎng)殖水溫為(14±1)℃，pH=7.8。每天早晚各投喂冷水魚專用配合飼料一次，取樣前停食24 h。隨機(jī)選取15尾健康無傷、1.5齡未知倍性的實(shí)驗(yàn)組虹鱒和3尾二倍體虹鱒作對(duì)照，通過流式細(xì)胞儀測(cè)定其相對(duì)DNA含量的方法對(duì)其進(jìn)行倍性檢測(cè)，經(jīng)鑒定15尾實(shí)驗(yàn)組魚中有2尾為二倍體，其余為三倍體。選取實(shí)驗(yàn)組中的2尾二倍體和對(duì)照組的3尾共計(jì)5尾普通二倍體虹鱒，平均體長(zhǎng)(37.3±3.1) cm,平均體重(0.97±0.20) kg，隨機(jī)挑選5尾三倍體虹鱒，平均體長(zhǎng)(34.7±4.8) cm,平均體重(0.84±0.29) kg，抽取血液進(jìn)行生理生化指標(biāo)檢測(cè)。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 血樣采集 用內(nèi)壁涂有抗凝劑的注射器從虹鱒尾動(dòng)脈(或靜脈)取血，每尾魚取1 mL的抗凝血，抗凝劑為15 g/L的EDTA-Na2，抗凝劑與血液的體積比為1∶10，取完血后輕輕搖勻，4 ℃保存，用于血液生理相關(guān)指標(biāo)測(cè)定。

不加抗凝劑的血樣直接放入普通1.5 mL EP管中，每尾魚取血3 mL，0～4 ℃靜置4～6 h，高速離心機(jī)12 000 r/min離心10～15 min后，取上清液，液氮冷凍，置于-80 ℃冰箱凍存，用以測(cè)定血液生化指標(biāo)。

1.2.2 相對(duì)DNA含量的檢測(cè) 采用流式細(xì)胞儀(Beckman Coulter FC500M)于波長(zhǎng)488 nm下測(cè)定實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組個(gè)體的DNA含量。具體方法如下：

①單細(xì)胞懸液的制備：將每尾魚的抗凝血搖勻，使用移液槍分別吸取10 μL血液，加入到1 mL 0.01 mol/L的PBS緩沖溶液中(pH為7.2～7.4)，搖勻，3 000 r/min，離心10 s，洗滌血細(xì)胞，倒掉PBS，再加入1mL的PBS，混勻。

②單細(xì)胞懸液的固定：使用一次性塑料吸管吸取單細(xì)胞懸液，緩慢滴加到3mL預(yù)冷的無水乙醇中，4 ℃過夜保存(至少固定3h)。

③染色：將收集到的細(xì)胞懸液2 000 r/min離心10 min，棄上清液，PBS洗滌2次,顯微鏡下將細(xì)胞濃度調(diào)至1×106個(gè)/mL，加入20 μL，50 μg/mL的RNA酶，30 min后再加入20～50 μL，1 g/L的PI染液，置于4 ℃冰箱中染色30 min，使用300目篩絹過濾。

④上機(jī)檢測(cè)，每個(gè)樣本檢測(cè)的細(xì)胞數(shù)目>104個(gè)，測(cè)量所得的數(shù)據(jù)和結(jié)果由計(jì)算機(jī)進(jìn)行處理。

1.2.3 紅細(xì)胞胞體及紅細(xì)胞核大小的測(cè)量

①將血液樣本混勻，吸取10 μL血液置于載玻片上，制作血細(xì)胞涂片，自然干燥。

②滴加瑞氏-吉姆薩染液2～3滴覆蓋整個(gè)標(biāo)準(zhǔn)涂片，染色1～2 min。滴加等量的0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液(pH為6.4～6.8)，輕輕晃動(dòng)玻片，與瑞氏-吉姆薩染液充分混勻，染色3～5 min。

③水洗、吸干、鏡檢。染色后胞漿和胞核的染色清晰分明，細(xì)胞核著色呈深淺不同的紫紅色，胞漿呈淺紅色，胞漿中顆粒區(qū)分明顯。

④在顯微鏡下拍照，分別測(cè)量紅細(xì)胞胞體與細(xì)胞核的長(zhǎng)軸和短軸，每個(gè)樣本測(cè)量10個(gè)紅細(xì)胞，取平均值，根據(jù)公式：體積V=a2b/1.91；表面積S=πab/4，式中，a為胞核長(zhǎng)軸，b為胞核短軸，計(jì)算得到紅細(xì)胞胞體及其核的體積與表面積。

1.2.4 血液生理指標(biāo)的測(cè)定 血液生理指標(biāo)白細(xì)胞、紅細(xì)胞及血紅蛋白等采用BC-1800全自動(dòng)血液細(xì)胞分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)測(cè)定。其原理是用電阻抗法對(duì)血細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

1.2.5 血液生化指標(biāo)的測(cè)定 血液生化指標(biāo)采用BS-1800全自動(dòng)生化分析儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)測(cè)定，不同指標(biāo)使用不同的試劑盒測(cè)定(邁瑞公司生產(chǎn))。

1.2.6 血清滲透壓的檢測(cè) 血清滲透壓采用蒸汽壓滲透壓計(jì)(Vapro5520)測(cè)定，隨機(jī)選取二倍體和三倍體虹鱒各5尾進(jìn)行血清滲透壓的測(cè)定，每尾魚測(cè)定2次，每次使用血清的量為10 μL。

1.3 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用SPSS13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，運(yùn)用單因素方差分析，先進(jìn)行方差齊性檢驗(yàn)，不滿足方差齊性時(shí)，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行自然對(duì)數(shù)或平方根轉(zhuǎn)換，然后采用Duncan 多重比較檢驗(yàn)數(shù)據(jù)差異的顯著性，以P<0.05為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 相對(duì)DNA含量的檢測(cè)

使用流式細(xì)胞儀測(cè)定實(shí)驗(yàn)組15尾和對(duì)照組3尾虹鱒紅細(xì)胞的DNA含量，對(duì)照組熒光值為310±5(見圖1)，三倍體虹鱒為437±13(見圖2)，二者比值為1.4，與理論值1.5相近，15尾中有2尾為二倍體。

圖1 二倍體虹鱒流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

圖2 三倍體虹鱒流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果

2.2 二倍體和三倍體虹鱒紅細(xì)胞大小的比較

如表1所示，三倍體虹鱒紅細(xì)胞長(zhǎng)軸為二倍體的1.25倍，極顯著地大于二倍體(P<0.01)，紅細(xì)胞短軸略大于二倍體，為二倍體的1.20倍，二者差異極顯著(P<0.01)，但三倍體虹鱒紅細(xì)胞長(zhǎng)軸與二倍體的比率要大于短軸，所以三倍體紅細(xì)胞形狀與二倍體紅細(xì)胞存在較為明顯的差異，所以在顯微鏡下觀察到的三倍體紅細(xì)胞更大、更長(zhǎng)(見圖3)，與三倍體紅細(xì)胞相比，二倍體紅細(xì)胞呈現(xiàn)出小而圓的橢球形(見圖4)。三倍體虹鱒紅細(xì)胞體積極顯著地大于二倍體(P<0.01)，為二倍體的1.84倍，紅細(xì)胞面積極顯著大于二倍體(P<0.01)，為二倍體的1.49倍。三倍體虹鱒紅細(xì)胞核明顯大于二倍體，三倍體虹鱒紅細(xì)胞核的長(zhǎng)軸、短軸、面積、體積等各項(xiàng)數(shù)值分別為二倍體虹鱒的1.42、1.20、1.70、2.39倍，差異極顯著(P<0.01)。

表1 二倍體和三倍體虹鱒紅細(xì)胞及其細(xì)胞核大小比較

注：**表示差異極顯著(P<0.01)；*表示差異顯著(P<0.05),下同。

Note:**denotes extremely significant difference at 0.01 level,*denotes significant difference at 0.05 level，the same below.

①Items；②Triploid；③Diploid；④Long axis of RBC；⑤Short axis of RBC；⑥RBC area；⑦M(jìn)CV；⑧Long axis of RBC nucleus；⑨Short axis of RBC nucleus；⑩RBC nucleus area；RBC nucleus volume

圖3 三倍體虹鱒紅細(xì)胞(40×10)

圖4 二倍體虹鱒紅細(xì)胞(40×10)

2.3 二倍體和三倍體虹鱒血液生理指標(biāo)的比較

如表2所示，三倍體虹鱒血液中紅細(xì)胞數(shù)目極顯著地少于二倍體(P<0.01)，為二倍體的0.26倍，同樣，三倍體虹鱒血液紅細(xì)胞壓積極顯著地低于二倍體(P<0.01)，為二倍體的0.28倍。三倍體虹鱒血液中白細(xì)胞數(shù)目顯著地高于二倍體(P<0.05)，為二倍體的1.16倍。而血小板和血紅蛋白含量差異不顯著(P>0.05)。

表2 二倍體和三倍體虹鱒血液指標(biāo)

2.4 二倍體和三倍體虹鱒血液生化指標(biāo)的比較

如表3所示，三倍體血清中堿性磷酸酶、葡萄糖濃度顯著低于二倍體(P<0.05)，與二倍體的比值分別為0.61和0.53，三倍體血清中谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量也低于二倍體，但是差異不顯著(P>0.05)，白蛋白、總膽固醇、甘油三酯、乳酸脫氫酶、總蛋白含量與二倍體差異不顯著(P>0.05)。

表3 二倍體和三倍體虹鱒血液生化指標(biāo)

2.5 二倍體和三倍體虹鱒血清滲透壓的比較

隨機(jī)選取二倍體和三倍體虹鱒各5尾進(jìn)行血清滲透壓的測(cè)定。如圖5所示，二倍體虹鱒血清滲透壓為(433±9) mOsm/kg，三倍體虹鱒血清滲透壓為(433±11) mOsm/kg，二倍體和三倍體虹鱒血清滲透壓無顯著性差異(P>0.05)。

圖5 二倍體和三倍體虹鱒血清滲透壓的比較。

3 討論

3.1 流式細(xì)胞術(shù)鑒定魚類的倍性

鑒定多倍體魚類的方法包括間接法(如核體積測(cè)量、蛋白質(zhì)電泳、生化分析以及形態(tài)學(xué)檢查等)和直接法(如染色體計(jì)數(shù)以及DNA含量測(cè)定等)[11]。流式細(xì)胞計(jì)數(shù)法是一種準(zhǔn)確測(cè)定細(xì)胞核內(nèi)DNA含量的方法。流式細(xì)胞技術(shù)作為一種快速高通量的樣品分析平臺(tái)，輔以各種先進(jìn)檢測(cè)模塊可以衍生出各種新型檢測(cè)設(shè)備，服務(wù)于不同領(lǐng)域的需求，其自動(dòng)化、高通量、多維度等優(yōu)勢(shì)越來越受到研究者的重視[12]。流式細(xì)胞儀具有快速、準(zhǔn)確、用血量少的優(yōu)點(diǎn)，但對(duì)樣本的制備具有較高的要求，需要獲得分散良好、細(xì)胞完整、并且適宜濃度的單細(xì)胞懸液。在魚類的倍性鑒定中，通過鰓、血液、鰭、肝、脾等組織皆可獲得單細(xì)胞懸液，但血液最為方便且效果最好。對(duì)于血細(xì)胞樣品的制備，紅細(xì)胞的濃度對(duì)結(jié)果影響顯著，這與流式細(xì)胞儀測(cè)定原理有關(guān)，紅細(xì)胞用熒光染料染色，這些熒光物質(zhì)能與細(xì)胞核內(nèi)的DNA進(jìn)行特異性結(jié)合，在激光或紫外光的照射下發(fā)射出一定波長(zhǎng)的熒光，再用流式細(xì)胞儀測(cè)出熒光值，因此，熒光值與紅細(xì)胞和PI染料的比例存在一定的關(guān)系，在該實(shí)驗(yàn)PI濃度條件下，用來檢測(cè)倍性的虹鱒血量應(yīng)當(dāng)控制在2～10 μL的范圍內(nèi)，濃度過小，測(cè)不出熒光值，濃度太大，測(cè)得的熒光值偏小，波峰不完整，影響對(duì)倍性的準(zhǔn)確判斷。有研究表明，紅細(xì)胞甲醛固定法優(yōu)于紅細(xì)胞乙醇固定法[13]。本實(shí)驗(yàn)研究，兩種固定方法都能得到結(jié)果，但酒精固定法最佳。魚類的種群，魚體大小等因素也有可能影響熒光值。流式細(xì)胞儀檢測(cè)的是細(xì)胞核內(nèi)DNA的相對(duì)含量，所以對(duì)各個(gè)樣品的處理?xiàng)l件應(yīng)當(dāng)保持一致。該方法的缺點(diǎn)是對(duì)樣本的質(zhì)量要求較高，并且樣本處理過程繁瑣，需要特定的儀器，成本較高。

3.2 二倍體和三倍體虹鱒紅細(xì)胞大小的比較

一般認(rèn)為，真核細(xì)胞核大小與染色體數(shù)目成正比例增加，同時(shí)，細(xì)胞核與細(xì)胞質(zhì)在細(xì)胞中總是維持較穩(wěn)定的核質(zhì)比[14]。三倍體虹鱒細(xì)胞核內(nèi)較二倍體多了一套染色體組，因此細(xì)胞核較普通二倍體核大，并且細(xì)胞本身需要維持一定的核質(zhì)比例，所以紅細(xì)胞的體積也較普通二倍體大。已有研究表明，普通二倍體虹鱒紅細(xì)胞長(zhǎng)徑平均值約16 μm，短徑平均值約9.5 μm[15]，本實(shí)驗(yàn)測(cè)得的結(jié)果為長(zhǎng)徑16 μm，與記載的數(shù)據(jù)無明顯差異，短徑平均值為10.49 μm，略大于有關(guān)的報(bào)道,可能與不同的虹鱒種群有關(guān)。韓英等研究發(fā)現(xiàn)三倍體虹鱒紅細(xì)胞體積與二倍體比值為1.51∶1，細(xì)胞核大小與二倍體比值為1.49∶1，與理論值(1.5∶1)比較均無顯著差異[16]。本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)三倍體紅細(xì)胞與二倍體的比值以及紅細(xì)胞核與二倍體的比值皆大于理論值1.5，一方面可能是魚類種群的不同，各指標(biāo)存在一定的差異，另一方面是年齡的差異，隨著魚體的長(zhǎng)大，紅細(xì)胞也會(huì)隨之變大，本實(shí)驗(yàn)以1.5齡的三倍體、二倍體虹鱒為研究對(duì)象，而韓英等所選用的實(shí)驗(yàn)魚為0.5齡，所以本實(shí)驗(yàn)所測(cè)得的紅細(xì)胞長(zhǎng)軸、短軸、面積、體積及核的各項(xiàng)指標(biāo)均明顯大于其研究結(jié)果。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)有關(guān)三倍體虹鱒和二倍體虹鱒紅細(xì)胞和紅細(xì)胞核的大小進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)各項(xiàng)指標(biāo)均存在顯著性差異，并且在相同倍鏡下觀察到的三倍體與二倍體紅細(xì)胞在形態(tài)和大小上均存在明顯的差別，普通二倍體虹鱒紅細(xì)胞呈小而圓的橢球形，而三倍體紅細(xì)胞則更大更長(zhǎng)，主要是因?yàn)槿扼w紅細(xì)胞和細(xì)胞核的長(zhǎng)軸與二倍體之比分別為1.25、1.42，都分別大于相應(yīng)的短軸之比，所以在顯微鏡下感覺像是三倍體紅細(xì)胞被拉長(zhǎng)了。有研究表明，三倍體虹鱒紅細(xì)胞核的形態(tài)存在異?，F(xiàn)象，在外周血液中存在19%的具有雙核或啞鈴型核的紅細(xì)胞[16]。所以，通過對(duì)虹鱒紅細(xì)胞大小的測(cè)量和形態(tài)上的觀察可以作為一種鑒定虹鱒三倍體與二倍體的方法，該方法具有操作簡(jiǎn)單、成本較低的優(yōu)點(diǎn)。不過，也有學(xué)者認(rèn)為這個(gè)方法不能準(zhǔn)確地反映染色體的倍性。有鑒于此，在使用這個(gè)方法之前最好結(jié)合流式細(xì)胞儀測(cè)定方法加以驗(yàn)證。另外，在缺乏其他證據(jù)的情況下，這個(gè)方法潛在的不準(zhǔn)確性使得難以鑒定多倍體與二倍體嵌合體[11]。

3.3 二倍體和三倍體虹鱒血液生理指標(biāo)比較

影響魚類血液紅細(xì)胞數(shù)量的因素包括季節(jié)變化、健康狀況、水溫、溶解氧、運(yùn)動(dòng)強(qiáng)度、性腺發(fā)育的成熟度及餌料質(zhì)量等，三倍體虹鱒由于紅細(xì)胞體積的增大，導(dǎo)致紅細(xì)胞中血紅蛋白的增加，從而使得血液中紅細(xì)胞的數(shù)目大為減少，本實(shí)驗(yàn)研究對(duì)比發(fā)現(xiàn)，三倍體虹鱒血液紅細(xì)胞數(shù)目為二倍體的0.26倍，二者差異極顯著，紅細(xì)胞大小和數(shù)目?jī)烧邔?duì)血紅蛋白的綜合影響的結(jié)果為三倍體虹鱒血紅蛋白含量是二倍體的0.88倍，略低于二倍體，但二者差異不顯著，使得血液中的血紅蛋白含量維持在一定的水平。Danilo等認(rèn)為，運(yùn)動(dòng)較快的魚類的紅細(xì)胞數(shù)量、紅細(xì)胞壓積和血紅蛋白含量較運(yùn)動(dòng)遲緩的種類高[17]。紅細(xì)胞數(shù)量和血紅蛋白含量可以反映出生物體對(duì)氧氣的攝取、運(yùn)輸以及消耗能力，并通過氧氣與二氧化碳的交換滿足機(jī)體生理活動(dòng)和運(yùn)動(dòng)的需要。Holland等的研究表明，體積較小的紅細(xì)胞具有較大的相對(duì)表面積和較短的擴(kuò)散距離，可加速血紅蛋白對(duì)氧的吸收和釋放，從而具有耐低氧的特性[18]。

白細(xì)胞(WBC)作為魚類機(jī)體免疫和體液免疫的重要成分，主要作用是保護(hù)機(jī)體抵御外部和內(nèi)部的傷害[19]。本研究中WBC的濃度在三倍體虹鱒中顯著高于二倍體，這與三倍體黃顙魚的白細(xì)胞數(shù)極顯著高于二倍體的結(jié)果類似[7]，表明三倍體虹鱒在免疫力、抗病力等方面較二倍體更強(qiáng)，更不易患病。魚類的抗病力主要依賴于它的免疫功能——特異性免疫和非特異性免疫，吞噬細(xì)胞的吞噬作用在這2種免疫中舉足輕重[20]。

3.4 二倍體和三倍體虹鱒血液生化指標(biāo)比較

血漿中的血糖、血脂和血蛋白是指示魚體新陳代謝的重要指標(biāo)。血清葡萄糖(GLU)作為直接能源物質(zhì)可以為機(jī)體直接提供能量,GLU的增加既是能量代謝加快的需要也是機(jī)體對(duì)外界刺激的響應(yīng)[21]。血糖含量的高低可以直接反映機(jī)體的營養(yǎng)狀況，三倍體虹鱒血清葡萄糖含量顯著低于二倍體，顯示三倍體虹鱒體內(nèi)能量代謝水平低于二倍體，這可能與三倍體虹鱒紅細(xì)胞體積的增大以及紅細(xì)胞數(shù)目的減少有關(guān)，這種變化綜合形成的結(jié)果為三倍體虹鱒血紅蛋白水平較二倍體低，但這種差異并不顯著。甘油三酯(TG)和總膽固醇(TC)水平受體內(nèi)蛋白質(zhì)和脂質(zhì)代謝的共同影響，不良的外界環(huán)境能引起魚體增加體內(nèi)的糖原、脂類和蛋白質(zhì)的分解來維持體內(nèi)血糖、血脂及血蛋白的濃度，當(dāng)三倍體虹鱒處于正常生理代謝狀態(tài)時(shí)，其血清TC和TG與二倍體虹鱒相比并無顯著性變化，有利于維持其最基本的代謝水平。

堿性磷酸酶(ALP)是一種在生物界中分布廣泛的磷酸酯酶，是生物體的一種重要的代謝調(diào)控酶，可以直接參與生物機(jī)體磷酸基團(tuán)的轉(zhuǎn)移、調(diào)節(jié)機(jī)體磷的代謝、維持體內(nèi)鈣磷比例等作用，為ADP磷酸化形成ATP提供所需的無機(jī)磷酸[22]。研究發(fā)現(xiàn)，三倍體虹鱒血清中堿性磷酸酶的含量顯著低于二倍體，堿性磷酸酶活性的降低有利于組織細(xì)胞生理活動(dòng)維持于較低的水平以適應(yīng)由于紅細(xì)胞數(shù)目的減少帶來的攜帶和輸送氧氣功能降低的影響。堿性磷酸酶是血細(xì)胞溶酶體的特征酶，在血細(xì)胞進(jìn)行吞噬和包裹異物的反應(yīng)中，伴隨著堿性磷酸酶的釋放，對(duì)異物產(chǎn)生水解破壞作用。魚類血液中保持有較高活性的堿性磷酸酶對(duì)防御外界微生物的入侵具有積極作用[23]。該研究結(jié)果顯示，三倍體虹鱒血清中堿性磷酸酶含量顯著低于二倍體，顯示了三倍體虹鱒在非特異性免疫方面的能力可能較二倍體低?？偟鞍?TP)具有維持血液正常膠體滲透壓，維持pH值恒定的作用，參與脂肪酸、固醇等物質(zhì)運(yùn)輸并與免疫功能相關(guān)；血清白蛋白(ALB)是機(jī)體重要的免疫蛋白，與魚體的抗病及環(huán)境適應(yīng)能力有著密切的關(guān)系[21]。三倍體虹鱒血清總蛋白和白蛋白含量與二倍體虹鱒并沒有顯著性差異，這是維持血液正常滲透壓的需要，同時(shí)保證機(jī)體處于一個(gè)相對(duì)穩(wěn)定的內(nèi)環(huán)境狀態(tài)。血清中谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)活性的相對(duì)增加可反映肝功能障礙, 是判斷肝細(xì)胞壞死的最具特異性的應(yīng)用指標(biāo)[24]。經(jīng)比較發(fā)現(xiàn)，三倍體和二倍體虹鱒血清中谷氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)無顯著性差異(P>0.05)。

3.5 二倍體和三倍體虹鱒血清滲透壓的比較

血清滲透壓代表著硬骨魚類內(nèi)部滲透壓情況，在外界鹽度變化時(shí)，起初血清滲透壓會(huì)隨之迅速升高或降低，然后逐漸向初始狀態(tài)恢復(fù)，整個(gè)生理過程受滲透壓調(diào)節(jié)機(jī)制的影響[25]。本研究的實(shí)驗(yàn)魚養(yǎng)殖在同一淡水水體，沒有在三倍體、二倍體之間發(fā)現(xiàn)血清滲透壓顯著差異，表明三倍體虹鱒與二倍體一樣具有高效的滲透壓、離子調(diào)控機(jī)制，以維持體內(nèi)水分及液體的動(dòng)態(tài)平衡。

4 結(jié)語

本實(shí)驗(yàn)通過流式細(xì)胞儀對(duì)虹鱒倍性進(jìn)行了鑒定，在紅細(xì)胞濃度的選擇、紅細(xì)胞單細(xì)胞懸液的固定等方面進(jìn)行了優(yōu)化，在此基礎(chǔ)上通過比對(duì)二倍體和三倍體虹鱒紅細(xì)胞的大小，發(fā)現(xiàn)其紅細(xì)胞與核體積的比值均要顯著大于理論值1.5，這與其他學(xué)者的有關(guān)研究存在一定差異。通過血液生理指標(biāo)的測(cè)定，三倍體紅細(xì)胞通過減少數(shù)量來降低其體積的增大帶來的單個(gè)紅細(xì)胞中血紅蛋白含量的增加的影響，這對(duì)于其維持機(jī)體平衡，保證氣體正常運(yùn)輸具有重要意義，但有關(guān)三倍體虹鱒在耐低氧方面的能力和機(jī)制有待進(jìn)一步研究。三倍體虹鱒白細(xì)胞數(shù)量顯著高于二倍體，但有關(guān)三倍體虹鱒在免疫組織和器官、免疫受體、免疫因子、免疫細(xì)胞等方面的應(yīng)答反應(yīng)有待進(jìn)一步研究。