鹽度馴化對虹鱒鰓、肌肉和肝臟非極性脂脂肪酸的影響?

劉文娟， 董 亢， 劉騁躍， 董雙林,2 ??， 周演根,2

(1.海水養(yǎng)殖教育部重點實驗(中國海洋大學)，山東 青島 266003; 2.青島海洋科學與技術國家實驗室，海洋漁業(yè)科學與食物產(chǎn)出過程功能實驗室，山東 青島 266235)

虹鱒(Oncorhynchusmykiss)具有肉質(zhì)細嫩，肥厚刺少，味道鮮美，EPA、DHA等PUFA含量高的特點，是水產(chǎn)養(yǎng)殖的名貴肉食性魚類之一[1-2]。自20世紀引進虹鱒以來，我國虹鱒養(yǎng)殖多以水庫或淡水池塘養(yǎng)殖為主[3-7]，對于不同品系虹鱒體內(nèi)脂肪酸含量和不同養(yǎng)殖水體虹鱒的生長、免疫、一般營養(yǎng)成分的比較研究有見報道[1-2, 8-11]。

近些年，鮭鱒魚類海水工廠化養(yǎng)殖開始興起[8]，我國科技工作者也已開始在開放的黃海冷水團海域養(yǎng)殖包括大西洋鮭(Salmosalar)、洄游型硬頭鱒(Oncorhynchusmykiss)和虹鱒等鮭鱒魚類。有研究表明，與淡水養(yǎng)殖虹鱒相比，經(jīng)鹽度馴化后海水養(yǎng)殖虹鱒的生長狀況、免疫力和肌肉品質(zhì)均有提高[9-11]。

鮭鱒魚類多是海淡水洄游魚類，淡水中培育的魚種在進入海水養(yǎng)殖之前需要鹽度馴化。魚類主要通過滲透壓調(diào)節(jié)來適應不同鹽度的水體環(huán)境，此過程需要消耗大量能量。脂質(zhì)作為三大能源物質(zhì)之一，在魚體供能方面發(fā)揮著重要的作用[12]。脂質(zhì)可以分為極性脂和非極性脂，而非極性脂被認為是魚類能量的重要儲存形式[13]。非極性脂主要由三?；视徒M成，此外還包括少量的二酰甘油和?；视蚚14]，多存在于魚類的肌肉、肝臟和腸系膜中，其提供的能量是等重量糖原的5倍[15]。除了提供能量，魚體內(nèi)非極性脂的含量和脂肪酸組成也會影響魚的風味和營養(yǎng)，一般認為魚肉的脂肪含量越高，帶給人的香郁、細膩之感越強[16]。

研究表明，水體鹽度變化會影響魚體內(nèi)脂質(zhì)的脂肪酸組成和含量[17]。高滲條件下，金頭鯛 (Sparusauratus) 體內(nèi)甘油三酯含量升高[18]；水體鹽度升高能夠改變金頭鯛和紅點鮭 (Salvelinusalpinus) 體內(nèi)非必需脂肪酸 (NEFA) 含量[18-20]，提高虹鱒[21]和花鱸(Lateolabraxmaculatus)[22]肌肉中EPA和DHA的含量。郭振[23]等對不同鹽度水體的羅非魚(Oreochromisniloticus)脂肪酸研究發(fā)現(xiàn)，水體鹽度升高可以提高實驗羅非魚肌肉中的飽和脂肪酸 (SFA)、單不飽和脂肪酸 (MUFA) 和多不飽和脂肪酸 (PUFA) 含量，提高PUFA/SFA比值，增加羅非魚脂肪酸的營養(yǎng)價值。

鮭鱒魚類的鰓、肌肉和肝臟在滲透壓調(diào)節(jié)和能量供給方面起著十分重要的作用，而此3種組織器官的脂肪酸與滲透壓調(diào)節(jié)和能量供給密切相關。目前，對于虹鱒體內(nèi)脂肪酸的研究多集中在種類和含量上，而關于海水馴化對虹鱒不同組織脂肪酸的影響鮮有報道[24]。本實驗通過測定鹽度馴化前后虹鱒鰓、肌肉和肝臟中非極性脂脂肪酸的組成與含量，發(fā)現(xiàn)鹽度馴化引起的虹鱒3種組織器官內(nèi)非極性脂脂肪酸的變化，探究虹鱒鰓、肌肉和肝臟3種組織器官在鹽度馴化過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 實驗方法

本實驗于2017年7月2日～8月9日在中國海洋大學魚山校區(qū)進行，實驗材料為三倍體虹鱒，取自山東省日照市萬澤豐漁業(yè)有限公司鮭鱒魚繁育場。

實驗虹鱒先在實驗室暫養(yǎng)2周(溫度(16±0.5) ℃，鹽度0)。之后選取60尾生長狀況良好，規(guī)格相近((195.23±15.75) g)的虹鱒，隨機分到3個圓形玻璃纖維水缸(277 L；高58 cm；半徑39 cm)中。實驗開始后，以每天增加2個鹽度的速度，將鹽度從0升到30。實驗期間，每天08:00和18:00投喂2次，投喂量為實驗魚總體重的2%。投喂2 h后吸殘餌糞便、換水，每次換水量為總體積的1/2。水溫控制在(16±0.5) ℃(使用溫控系統(tǒng)，ZKH-WK 2000，中科海水質(zhì)處理有限公司)；氣石充氣，水體溶氧含量6 mg/L以上；光照周期為12 h光照∶12 h黑暗；使用YSI專業(yè)水質(zhì)檢測儀(Yellow Spring, Ohio, USA)，監(jiān)測記錄水缸內(nèi)的水溫、溶解氧、酸堿度和鹽度等水質(zhì)數(shù)據(jù)。實驗虹鱒投喂商品飼料，飼料脂肪酸組成如表1所示。

本實驗過程中水體水質(zhì)狀態(tài)良好，實驗虹鱒未出現(xiàn)受傷、死亡現(xiàn)象。分別對鹽度變化前(0)和海水(30)適應一周后的虹鱒進行取樣。取樣前一天停止投喂，每缸隨機選取3尾魚。使用麻醉劑MS-222(濃度70 mg/L)將魚麻醉，取其鰓絲、背肌(胸鰭至臀鰭之間，側線以上的背部肌肉)和肝臟組織到凍存管，迅速放到液氮中，然后轉移到-80 ℃冰箱中待測。

1.2 非極性脂脂肪酸的提取和測定

1.2.1 非極性脂的提取 樣品非極性脂的提取基本參考劉騁躍的方法[24]。取組織樣品0.1 g，加入3.3 mL甲醇溶液，勻漿機勻漿1 min，加入6.6 mL氯仿溶液，倒入10 mL甲酯化試管中，搖床震蕩30 min(37 ℃, 130 r/min)，漏斗過濾到新的甲酯化試管，用氯仿/甲醇(2∶1, v/v)混合液定容至10 mL，4 ℃下靜置過夜。取氯仿層，氮氣吹干，用石油醚復溶至10 mL，-20 ℃條件保存。取2 mL油脂和石油醚混合液到4 mL EP管中，氮氣吹干，加入20 μL石油醚，用毛細管吸取，均勻地點在硅膠板(10 cm× 5 cm)上，在極性展開劑(氯仿∶甲醇∶水=65∶25∶4)中展開，用單質(zhì)碘顯色后將極性脂刮下放入甲酯化試管中，加入2 mL甲酯化試劑(HCl-甲醇溶液)，充入氮氣，水浴鍋中90 ℃水浴3 h，加入1 mL色譜級正己烷，振蕩均勻后靜置，分層后取上層正己烷溶液(含脂肪酸甲酯)，氮氣吹干，用色譜級正己烷復溶至50 μL，放入氣相色譜進樣瓶中待測。

表1 餌料中脂肪酸的組成Table 1 Fatty acid composition of the diet /%

1.2.2 脂肪酸的測定 脂肪酸甲酯的檢測使用氣相色譜儀(日本島津，GC-2010 plus)，進樣量1 μL，檢測器為火焰電離化檢測器(日本島津，GC-2010)，氣相色譜柱為RTX-WAX石英毛細管柱(柱長30 m，內(nèi)徑0.25 mm ，膜厚0.25 μm，美國，Phenomenex)。升溫程序：60 ℃維持1.0 min，以10 ℃/min的升溫速度升到190 ℃，然后以2.0 ℃/min的升溫速度升到260 ℃，維持0.6 min。色譜峰的定性以與37種脂肪酸甲酯混合標品(美國，Supelco)的保留時間相比較的方式進行，定量采用面積歸一法(外標法，5點定標)。

不飽和指數(shù)(UI)、不飽和率(U/S)的計算方法如下(Snyder & Hennessey[24-25]; Williams Hazel[24-26])：

UI=∑(% 單烯脂肪酸 + 2 × % 雙烯脂肪酸+3×%三烯脂肪酸 …)/100；

U/S = ∑(% UFA)/ ∑(% SFA)。

式中% 表示其所占百分比。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

實驗數(shù)據(jù)以平均值±標準差(Mean±SD)表示，采用SAS 9.4(SAS Institute Incorporated, Cary, North Carolina, USA)進行統(tǒng)計分析，使用t檢驗對鹽度馴化前后不同器官的非極性脂脂肪酸組成進行差異性檢測，P<0.05表示顯著差異。

2 實驗結果

實驗結果(見表2)表明，鹽度馴化前后，虹鱒鰓、肌肉和肝臟組織非極性脂脂肪酸的種類組成相同。鰓中檢測出15中脂肪酸，包括4種飽和脂肪酸(SFA)，4種單一不飽和脂肪酸(MUFA)，8種多不飽和脂肪酸(PUFA)。肌肉和肝臟中均檢測出19種脂肪酸，包括6種SFA，5種MUFA，8種PUFA。3種器官的非極性脂中，SFA所占比例最高的是棕櫚酸(16:0)，其次是硬脂酸(18:0)；MUFA所占比例最高的是油酸(18:1n9)；PUFA所占比例最高的是DHA(22:6n3)，其次是亞油酸(18:2n6)，α-亞麻酸(18:3n3)的占比也相對較高，然而，EPA(20:5n3)和ARA(20:4n6)的占比并不是很高。

鹽度馴化之后，虹鱒鰓的非極性脂脂肪酸組成變化不顯著(見表2)。與淡水組相比，升鹽組虹鱒鰓的非極性脂中SFA和MUFA比例略有升高，PUFA比例略微下降，但均不顯著。

但鹽度馴化后，虹鱒肌肉的非極性脂脂肪酸變化明顯。相比于淡水組，升鹽組虹鱒肌肉的非極性脂中SFA比例顯著下降(P<0.05)，MUFA比例下降，但不顯著，PUFA比例顯著上升(P<0.05)。PUFA中的長鏈多不飽和脂肪酸(LC-PUFA)，如22:6n3，20:5n3和20:4n6變化不明顯，但18:2n6和18:3n3比例顯著升高(P<0.05)，亞麻酸族不飽和脂肪酸(n-3 PUFA)和亞油酸族不飽和脂肪酸(n-6 PUFA)比例也明顯升高(P<0.05)，從而導致不飽和指數(shù)(UI)和不飽和率(U/S)的顯著上升(UI,P<0.05; U/S,P<0.05)。

對于肝臟，鹽度馴化前后虹鱒肝臟的非極性脂脂肪酸變化與肌肉相似。海水組虹鱒肝臟的非極性脂中SFA比例顯著下降(P<0.0.05)，其中的棕櫚酸(16:0)下降明顯(P<0.05)；MUFA比例略有下降，但不顯著，18:2n6和18:3n3的比例顯著上升(P<0.05)，n-3 PUFA和n-6 PUFA的比例也明顯上升(P<0.05)，從而使得PUFA的比例、UI和U/S明顯升高(P<0.05)。

3 討論

當外界水體鹽度發(fā)生變化時，魚類通過調(diào)節(jié)體內(nèi)滲透壓來維持內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，該調(diào)節(jié)過程消耗大量能量[17]。脂質(zhì)，特別是非極性脂，作為魚類的主要儲能物質(zhì)[27]，是魚類重要的能量供應來源[13,15,17]。

鹽度馴化前后，本實驗虹鱒鰓組織的非極性脂脂肪酸組成未發(fā)生顯著變化(P>0.1)，表明虹鱒的鰓并不是主要的能量供應器官。有人研究發(fā)現(xiàn)，鰓是魚類主要的滲透壓調(diào)節(jié)器官，其通過Na+/K+-ATPase酶實現(xiàn)對離子進出的控制，Na+/K+-ATPase酶的活性易受到鰓的磷脂脂肪酸的影響，而鰓的非極性脂對Na+/K+-ATPase酶的活性影響不大[28-30]。如Bystriansky等[31]研究發(fā)現(xiàn)紅點鮭鰓中Na+/K+-ATP酶的活性隨ARA(20:4n6)和DHA(22:6n3)含量的增加而升高。劉騁躍等[24]研究發(fā)現(xiàn)，虹鱒在海水馴化之后鰓組織的磷脂脂肪酸中SPA比例上升，PUFA富集。魚鰓的非極性脂脂肪酸的組成會受到飼料成分的影響，但對周圍環(huán)境因子的變化較不敏感[32-33]，如Hansen和Abraham[34]研究發(fā)現(xiàn)，鹽度的變化和饑餓脅迫均未影響歐洲鰻鱺(Anguillaanguilla)鰓中非極性脂脂肪酸的組成。由于魚鰓組織的特殊結構，鰓絲細胞中用于貯存能量的非極性脂含量較少[35]。本實驗中，淡水組和升鹽組虹鱒鰓的非極性脂脂肪酸組成為均為15種，少于肌肉和肝臟的19種，且每種脂肪酸的占比沒有顯著差異，這可能是鰓本身非極性脂含量低，鰓的主要功能是吸收和排泄離子，而不是供應能量。

與鰓組織不同，本實驗虹鱒的肌肉和肝臟中，非極性脂脂肪酸組成在經(jīng)歷鹽度馴化后，SFA占比顯著下降(P<0.05)，PUFA顯著上升(P<0.05)，使得肌肉和肝臟非極性脂的UI和U/S顯著升高(P<0.05)。這可能是實驗虹鱒為適應高鹽水體環(huán)境，優(yōu)先分解利用以16:0為主的SPA調(diào)節(jié)滲透壓，以維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定。曾霖[6]等也發(fā)現(xiàn)增加水體鹽度可提高大菱鲆(Scophthalmusmaximus)幼魚肌肉中的PUFAs和EPA+DHA等含量，同時降低SFA總量?；|(Lateolabraxjaponicus)[36]、大西洋鮭(Salmosalar)[37]、遮目魚(Chanoschanos)[38]等也表現(xiàn)出類似現(xiàn)象。Hagen等[32]研究發(fā)現(xiàn)，魚類主要利用體內(nèi)不同組織脂肪中的SFA和MUFA供能，從而節(jié)約了機體蛋白質(zhì)與脂肪中的PUFA，以維持重要的生命活動。Mellery等[39]發(fā)現(xiàn)，魚體內(nèi)脂肪酸的代謝順序一般是：SPA>MUFA>PUFA>LC-PUFA、n-6 PUFA> n-3 PUFA。此外，魚類在適應海水過程中，機體內(nèi)分泌多種激素，如生長激素、血管緊張激素、皮質(zhì)類固醇等，也會間接影響多不飽和脂肪酸的生物合成。Zheng等[40]發(fā)現(xiàn)，大西洋鮭入海時，肌肉內(nèi)Δ 6去飽和酶的表達顯著升高，從而使其在入海后PUFA含量大幅升高。Sheridan等[41]的研究也發(fā)現(xiàn)，淡水生活的硬頭鱒體內(nèi)PUFA的含量顯著低于海水生活的硬頭鱒，并且Δ 5去飽和酶的活性顯著上升。Bell等發(fā)現(xiàn)，大西洋鮭幼魚在向海水過渡和滲透壓調(diào)節(jié)過程中會調(diào)控食物選擇，以增加體組織中的ARA及其產(chǎn)生的類花生酸類物質(zhì)[42]。ARA和類花生酸類物質(zhì)在鮭鱒魚幼魚的銀化入海過程中發(fā)揮重要作用[43]。

表2 鹽度馴化前(淡水組FW)后(升鹽組SW)虹鱒鰓、肌肉、肝臟非極性脂脂肪酸組成Table 2 Fatty acid compositions of non-polar lipid in the gill, muscle and liver of rainbow trout before (freshwater FW) and after (seawater SW) acclimation /%

注：數(shù)值以平均值±標準差表示，同行中帶有“*”表示具有顯著差異(P<0.05)。FW：淡水處理組；SW：升鹽處理組；SFA：飽和脂肪酸；MUFA：單一不飽和脂肪酸；PUFA：多不飽和脂肪酸；n-3 PUFA：亞麻酸族不飽和脂肪酸；n-6 PUFA：亞油酸族不飽和脂肪酸；UI：不飽和指數(shù)；U/S：不飽和率。

Note: Values are mean ± SD, Significant differences (P<0.05) each row are indicated by superscript “*”. FW: Freshwater treatment; SW: Seawater treatment; SFA: Saturated fatty acid; MUFA: Monounsaturated fatty acids; PUFA: Polyunsaturated fatty acid; n-3 PUFA: Omega-3 series polyunsaturated fatty acid; n-6 PUFA: Omega-6 series polyunsaturated fatty acid; UI: Unsaturated index; U/S: The ratio of unsaturated and saturated fatty acid.

本實驗中，鹽度馴化后，虹鱒肌肉和肝臟的非極性脂中EPA、DHA和ARA占比略有升高，但不顯著(P>0.1)；而18:2n6和18:3n3等C18 PUFA的比例顯著上升(P<0.05)。先前研究表明，魚體內(nèi)的內(nèi)源性LC-PUFA通常由其C18 PUFA前體經(jīng)去飽和作用和碳鏈延長作用合成[44]，并且C18 PUFA可作為脂代謝關鍵轉錄因子的配體，參與激活LC-PUFA關鍵基因的表達[45]。鹽度馴化后，虹鱒肌肉和肝臟非極性脂中18:2n6和18:3n3的增加，可能會提高它們轉化為EPA和DHA的速率，有助于虹鱒體內(nèi)LC-PUFA的生物合成，利于虹鱒的生長發(fā)育。

4 結語

鹽度馴化前后，虹鱒鰓、肌肉和肝臟中的非極性脂脂肪酸會產(chǎn)生組織特異性變化。經(jīng)歷鹽度馴化，虹鱒鰓中非極性脂脂肪酸變化不顯著，因此，鰓不是滲透調(diào)節(jié)的主要能量供應器官。肌肉和肝臟的非極性脂中大量SPA被分解代謝，為虹鱒調(diào)節(jié)滲透壓，維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定提供能量。與淡水虹鱒相比，經(jīng)鹽度馴化的虹鱒肌肉和肝臟中的n-3 PUFA和n-6 PUFA比例顯著上升，C18 PUFA作為LC-PUFA的合成前體，其比例的上升可能會加快肌肉和肝臟中EPA、DHA和ARA等的生物合成，有利于虹鱒對海水環(huán)境的適應。