大腸桿菌代謝途徑改造策略與應(yīng)用研究進(jìn)展

李冉 黃玉清 賈振華

（河北省科學(xué)院生物研究所，石家莊 050051）

大腸桿菌的代謝組學(xué)已研究的很透徹，與其他微生物相比，其自身的代謝途徑更加穩(wěn)定且易于改造，因此大腸桿菌作為一種工業(yè)微生物被廣泛應(yīng)用于代謝途徑改造的研究。目前對(duì)大腸桿菌改造的研究集中在四條主要代謝途徑，包括丙酮酸、乙酰輔酶A、甲羥戊酸和莽草酸代謝途徑，用于醇類、有機(jī)脂肪酸、氨基酸、類異物二烯和芳香族化合物的合成。

大腸桿菌的系統(tǒng)代謝工程在生物燃料和砌塊化合物的合成中均有研究和應(yīng)用，它將整個(gè)生物過程的系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)相結(jié)合，有助于制定有效的策略改造微生物菌株，以便使目標(biāo)化學(xué)品的生產(chǎn)產(chǎn)量和生產(chǎn)效率最大化，同時(shí)使整個(gè)上游和下游的工藝成本最小化。常用的技術(shù)主要包括自身代謝途徑的基因敲除、過表達(dá)以及導(dǎo)入新的代謝途徑。

本文綜述了大腸桿菌系統(tǒng)代謝工程在自身代謝途徑改造策略，在生產(chǎn)生物燃料、砌塊化合物的微生物開發(fā)中所使用的工具和策略，以期為研究者以大腸桿菌合成目標(biāo)化合物的研究提供一個(gè)整體的思路和方法。

1 大腸桿菌代謝途徑的改造

1.1 丙酮酸代謝途徑改造

丙酮酸是一種重要的有機(jī)中間體，可被用作L-色氨酸、L-酪氨酸和二羥基苯丙氨酸等藥物的合成，也可用于阿托酸、丙酮酸乙酯等農(nóng)藥中間體的合成［1］。在大腸桿菌中，丙酮酸是糖酵解途徑中重要的代謝中間體，可用于乳酸、丙氨酸、醋酸酯和乙酰輔酶A的合成，也可用于乙二醇、2，3-丁二醇和異丁醇等的合成［2-3］。目前對(duì)丙酮酸途徑的改造主要有3種方式，第一，降低丙酮酸脫氫酶復(fù)合體（Pyruvate dehydrogenase complex，PDHC）的活性，PDHC由3個(gè)亞基組成，包括aceE基因編碼的EI亞基，即丙酮酸脫氫酶（Pyruvate dehydrogenase）；aceF基因編碼的E2亞基，即二氫硫辛酰胺轉(zhuǎn)乙酰酶（Dihydrohpoamide transacetylase）；IpdA基因編碼的E3亞基，即二氫硫辛酰胺脫氫酶（Dihydrolipoamide dehydrogenase）。宋燦輝等［4］利用 Red重組系統(tǒng)構(gòu)建了營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株MG1655，敲除大腸桿菌PDHC中的aceE基因后，阻斷了丙酮酸流向TCA循環(huán)，促進(jìn)丙酮酸的累積。第二，降低α-酮戊二酸脫氫酶復(fù)合體（α-ketoglutarate dehydrogenase complex，AKGDH）的活性，AKGDH由3個(gè)亞基構(gòu)成，包括sucA編碼的E1亞基，即α-酮戊二酸脫羧 酶（α-ketoglutaratedecarboxylase，KCBX）；sucB基因編碼的E2亞基，即硫辛酰轉(zhuǎn)琥珀酰酶（Lipoyl transsuccillylase，LTS）及IpdA基因編碼的E3亞基。Causey等［5-6］通過敲除atpFH、adhE、sucA基因來降低ATP合成、細(xì)胞生長(zhǎng)和CO2產(chǎn)生的速率，從而加強(qiáng)從葡萄糖到丙酮酸的積累。第三，減少丙酮酸代謝支路，減少丙酮酸的消耗。大腸桿菌YYC202是一種被成功改造的用于丙酮酸積累的營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株，突變了其中編碼丙酮酸脫氫酶、磷酸烯醇式丙酮酸合酶、丙酮酸甲酸裂解酶和丙酮酸氧化酶的基因，去除了可以消耗丙酮酸的下游代謝［7-8］。從目前的研究可以看出，促進(jìn)大腸桿菌中丙酮酸的積累主要有兩個(gè)策略，首先是提高丙酮酸的合成速度，降低反饋抑制調(diào)節(jié)；其次是去除丙酮酸的代謝支路，減少丙酮酸消耗。

1.2 乙酰輔酶A代謝途徑改造

乙酰輔酶A是微生物自身代謝中重要的中間體，它既是TCA循環(huán)的起始化合物，也是脂肪酸合成的前體。通過丙酮酸鹽，乙酰輔酶A可被轉(zhuǎn)化為多種化學(xué)物質(zhì)，包括1-丁醇、丁酸酯、S-3-羥基丁酸酯和聚 3-羥基丁酸酯［9-13］。

實(shí)現(xiàn)乙酰輔酶A的積累可通過兩種方式，一是調(diào)節(jié)PDHC的活性，在有氧條件下，PDHC可將丙酮酸轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，但是PDHC在缺氧或無氧條件下活性較低，為了解決這個(gè)問題，Kim等［14］將編碼PDHC基因中的lpdA基因進(jìn)行突變（將E354突變成K），使其在缺氧條件下保持活性。Boldt等［15］將肺炎克雷伯桿菌（Klebsiella pneumonia）中的lpdA基因突變（將D354突變成K）后，替換大腸桿菌中的lpdA基因，結(jié)果表明基因改造后的大腸桿菌可在氧含量較低的環(huán)境中生長(zhǎng)，提高了菌體積累乙酰輔酶A的能力。二是代謝途徑中相關(guān)基因的過表達(dá)。在丙酮酸合成乙酰輔酶A途徑中，過表達(dá)PDHC中相關(guān)基因（如aceE、aceF、lpdA）已被應(yīng)用于1-丁醇或脂肪酸的合成［16-17］。Lin等［18］通過過表達(dá)乙酰輔酶A合酶acs基因促進(jìn)了醋酸酯轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶A，并且不影響大腸桿菌的生長(zhǎng)。目前用于乙酰輔酶A積累的代謝途徑改造主要是通過提高PDHC活性，促進(jìn)丙酮酸鹽向乙酰輔酶A的轉(zhuǎn)化，以及過表達(dá)與乙酰輔酶A合成相關(guān)的酶，促進(jìn)碳流流向乙酰輔酶A途徑。

1.3 甲羥戊酸代謝途徑的改造

近年來，甲羥戊酸作為萜類和類胡蘿卜素的前體化合物備受關(guān)注，其用于藥物、清潔能源和芳香類化學(xué)品具有廣闊的應(yīng)用前景［19-21］。甲羥戊酸代謝途徑首先以乙酰輔酶A為前體，轉(zhuǎn)化成甲羥戊酸，再通過三步反應(yīng)轉(zhuǎn)化為焦磷酸異戊烯酯（IPP），IPP是合成萜類化合物和類胡蘿卜素的基本結(jié)構(gòu)單元，但是由甲羥戊酸轉(zhuǎn)化為IPP的代謝途徑不存在于大腸桿菌中，其自身IPP的合成需要以甲基赤蘚糖醇磷酸酯（DXP）作為前體，成為了大腸桿菌合成萜類化合物的主要限制因素。目前對(duì)大腸桿菌甲羥戊酸途徑的改造只能通過引入異源代謝途徑，Martin等［19］將黃花蒿（Artemisia annuaLinn）中的紫穗槐二烯合酶ads基因和釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）的甲羥戊酸代謝途徑關(guān)鍵基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化，在大腸桿菌中構(gòu)建了一個(gè)完整的異源甲羥戊酸代謝途徑，最終生成青蒿素合成的前體物質(zhì)紫穗槐二烯。Harada等［20］將來自于鏈霉菌的甲羥戊酸途徑克隆到大腸桿菌中，然后轉(zhuǎn)入a-蛇麻烯合酶基因，檢測(cè)到目的產(chǎn)物的生成。Morrone等［21］在大腸桿菌中引入異源的甲羥戊酸代謝途徑，結(jié)果表明異源代謝途徑比內(nèi)源性代謝途徑產(chǎn)生更多的二萜化合物。由于甲羥戊酸是乙酰輔酶A的下游代謝，對(duì)大腸桿菌中乙酰輔酶A代謝途徑的改造也可作為提高甲羥戊酸及其衍生物產(chǎn)量的一種策略。

1.4 莽草酸代謝途徑的改造

莽草酸是一種環(huán)己烷的羥基化不飽和酸衍生物，具有防止血栓形成、消炎鎮(zhèn)痛等作用，是合成神經(jīng)氨酸酶抑制劑的關(guān)鍵組成部分［22］。大腸桿菌可利用莽草酸產(chǎn)生不同種類芳香族氨基酸，如苯丙氨酸，酪氨酸和色氨酸等［23］。

對(duì)莽草酸途徑的改造方式主要有3種，一是敲除莽草酸激酶基因，莽草酸激酶將莽草酸轉(zhuǎn)化為3-磷酸莽草酸，敲除該基因可抑制莽草酸向下游代謝的轉(zhuǎn)化。Draths等［24］通過敲除大腸桿菌中莽草酸激酶基因后，過表達(dá)對(duì)莽草酸積累有反饋抑制作用的AroF、AroE和AroB基因，避免了莽草酸激酶基因缺失后對(duì)菌體生長(zhǎng)的影響。二是促進(jìn)磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）和4-磷酸赤蘚糖（E4P）的合成，PEP和E4P是大腸桿菌合成莽草酸的前體，Noda等［25］在大腸桿菌中過表達(dá)PEP合成酶ppsA基因和轉(zhuǎn)酮醇酶tktA基因，提高了PEP和E4P的合成效率。Gosset和Sengupta等［26-27］通過突變pykA和pykf基因，過表達(dá)tktA基因，抑制丙酮酸激酶活性和PEP介導(dǎo)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)，增加了PEP在大腸桿菌中的可用性，這種方法被用于提高順式-甲基丙烯酸和水楊酸的合成。三是減少副產(chǎn)物，促進(jìn)反應(yīng)向莽草酸方向進(jìn)行，kramer等［22］敲除大腸桿菌中5-烯醇式丙酮酰莽草酸-3-磷酸合酶基因aroA，過表達(dá)AroF、AroB和AroL基因，產(chǎn)生的3-磷酸莽草酸有助于推動(dòng)反應(yīng)向生成莽草酸的方向進(jìn)行，同時(shí)副產(chǎn)物3-脫氫莽草酸的含量降低。

2 大腸桿菌用于生物燃料的合成

隨著基因工程技術(shù)的發(fā)展和生物信息資源的日益豐富，微生物可以被改造成所需的工程菌用于多種生物燃料的合成，如1-丙醇、1-丁醇和烴類。1-丙醇是一種重要的化學(xué)品，可作為汽油替代品，應(yīng)用于多種工業(yè)產(chǎn)品中［28］。Choi等［29］通過氨基酸生物合成途徑的反饋抑制效應(yīng)，去除大腸桿菌中的競(jìng)爭(zhēng)代謝途徑，增強(qiáng)2-酮丁酸酯的合成，隨后引入adhE基因，并刪除一個(gè)應(yīng)激反應(yīng)基因，改造后的大腸桿菌可分別以葡萄糖和甘油作為碳源合成1-丙醇。Jian等［30］將異源1，2-丙二醇代謝途徑中的關(guān)鍵基因，包括丙酮醛合酶mgsA基因、丙二醇脫水酶budC基因、丙酮醛還原酶ydjG基因以及一個(gè)ppdABC操縱子，引入大腸桿菌中用于合成1-丙醇。1-丁醇也是一種重要的汽油替代品，傳統(tǒng)的合成方式主要是利用梭狀芽孢桿菌發(fā)酵產(chǎn)生［31-33］。大腸桿菌自身合成1-丁醇的能力較弱，Shen等［34］將丙酮丁醇梭菌（Clostri-dium acetobutylicum）的丁酰輔酶A基因和乙酰輔酶A酰基轉(zhuǎn)移酶基因?qū)氪竽c桿菌中，敲除大腸桿菌中復(fù)合酸合成相關(guān)基因，增強(qiáng)了大腸桿菌合成1-丁醇的能力。烴類也是一種極具潛力的生物燃料。四碳到十二碳的短鏈烴類可作為汽油替代品，十三碳到十七碳的長(zhǎng)鏈烴類可作為柴油替代品［35］。將藍(lán)藻烷烴生物合成途徑中的?；d體還原酶AAR基因和醛脫羧酶ADC基因?qū)氪竽c桿菌中，可合成十三碳到十七碳的長(zhǎng)鏈烴類混合物［36］。

3 大腸桿菌用于砌塊化合物的合成

微生物代謝可產(chǎn)生不同種類的砌塊化合物用于聚合物的合成，如二元羧酸、羥基酸、短鏈二元醇類和二胺類等由微生物的初級(jí)代謝產(chǎn)生。已有研究通過基因改造得到合成效率更高的工程菌，但實(shí)現(xiàn)商業(yè)化生產(chǎn)還需要進(jìn)一步改進(jìn)。二元羧酸主要包括琥珀酸、延胡索酸、蘋果酸、戊二醛、葡萄糖酸、己二酸和3-羧基木糖酸等，其中對(duì)琥珀酸合成的研究較多，早期已有研究者將改造后的大腸桿菌應(yīng)用于有氧、無氧和有氧-無氧3種發(fā)酵方式中［37-39］。后續(xù)有研究者將有氧條件下合成琥珀酸的代謝系統(tǒng)導(dǎo)入大腸桿菌中，提升了琥珀酸的合成效率。他們將三羧酸循環(huán)途徑以及副產(chǎn)物產(chǎn)生途徑改造成乙醛酸循環(huán)和三羧酸循環(huán)的氧化支路，使得大腸桿菌在能夠保證正常的生長(zhǎng)狀態(tài)下，有效積累琥珀酸。隨后將谷氨酸棒狀桿菌（Corynebacterium glutamicum）中的丙酮酸羧化酶pyc基因在大腸桿菌中過表達(dá)，促進(jìn)草酰乙酸合成并且增強(qiáng)向三羧酸循環(huán)氧化支路的離子流，最終提高了大腸桿菌在有氧條件下發(fā)酵產(chǎn)生琥珀酸的產(chǎn)量，達(dá)到36.1 g/L［40］。

短鏈二醇類是生產(chǎn)聚酯和其他化學(xué)品的砌塊化合物，可由微生物自身代謝和改造后的代謝途徑產(chǎn)生多個(gè)種類，如1，3-丙二醇、2，3-丁二醇、1，4-丁二醇和1，3-丁二醇。微生物生產(chǎn)1，4-丁二醇體現(xiàn)了代謝途徑基因改造工程在工業(yè)菌株設(shè)計(jì)上的應(yīng)用和發(fā)展。Boldt等［41］利用代謝途徑識(shí)別軟件（SimPheny bioPathway predictor）從一些常用的代謝中間體設(shè)計(jì)能合成1，4-丁二醇的代謝途徑，再根據(jù)代謝途徑的長(zhǎng)度、熱力學(xué)和產(chǎn)率選擇最佳途徑對(duì)大腸桿菌進(jìn)行改造，隨后又通過生物信息學(xué)分析基因組代謝組分和密碼子優(yōu)化技術(shù)，敲除部分基因進(jìn)一步優(yōu)化合成途徑，最終1，4-丁二醇的產(chǎn)量可達(dá)到18 g/L。本實(shí)驗(yàn)室利用羰基還原酶在大腸桿菌中過表達(dá)合成R-1，3-丁二醇，R-1，3-丁二醇的產(chǎn)量為8 g/L。

羥基酸及其手性化合物不僅可用作生產(chǎn)藥物、維生素、抗生素和風(fēng)味化合物的前體，也可作為生物單體用于合成聚酯。它們包括乳酸、3-羥基丙酸酯、3-羥基丁酸酯和3-羥基戊酸酯［42-45］。微生物基因工程應(yīng)用于乳酸的合成較為成功，其中大腸桿菌以葡萄糖或甘油作為碳源過量生產(chǎn)乳酸的研究最具潛力。研究者對(duì)大腸桿菌中氧化還原反應(yīng)的全基因組分析表明，在厭氧條件下，D-乳酸過量產(chǎn)生是由與核苷酸和氨基酸代謝有關(guān)的單個(gè)脫氫酶基因決定的，如guaB、pyrD和serA。此外，敲除與厭氧轉(zhuǎn)錄調(diào)控有關(guān)的guaB、pyrD、serA、fnr、arcA或arcB基因可增強(qiáng)D-乳酸的過量生產(chǎn)［46-48］。

4 總結(jié)與展望

本文綜述了大腸桿菌中丙酮酸、乙酰輔酶A、甲羥戊酸、莽草酸4個(gè)代謝途徑的改造策略，以及大腸桿菌用于合成生物燃料和砌塊化合物所采用的系統(tǒng)代謝工程策略。已有的研究表明，將系統(tǒng)生物學(xué)和合成生物學(xué)整合到代謝工程中，在開發(fā)能夠高效生產(chǎn)目標(biāo)化合物的工程菌株方面有巨大的前景。本實(shí)驗(yàn)室利用該策略對(duì)大腸桿菌進(jìn)行改造實(shí)現(xiàn)了R-3-奎寧醇的中試生產(chǎn)，該策略也成功用于氨基酸、乳酸、琥珀酸、1，4-丁二醇和1，3-丙二醇的生產(chǎn)。利用改造后的大腸桿菌生產(chǎn)目標(biāo)化合物仍存在一些需要改進(jìn)的地方，包括最大限度地提高產(chǎn)物純度、產(chǎn)量和反應(yīng)效率；在工業(yè)化應(yīng)用時(shí)，需要綜合考慮上下游工藝的可操作性和匹配性。系統(tǒng)代謝工程將在減少菌株反應(yīng)時(shí)間、降低反應(yīng)成本以及生物工藝開發(fā)方面發(fā)揮越來越重要的作用，最終實(shí)現(xiàn)目標(biāo)化合物的工業(yè)化規(guī)模生產(chǎn)。