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    黃皮果果核揮發(fā)油對(duì)小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞增殖和凋亡的影響

    2019-02-20 12:21:14廖雪華甘育鴻梅思符偉玉吳科鋒李文德
    食品研究與開發(fā) 2019年5期
    關(guān)鍵詞:黃皮果核膜電位

    廖雪華,甘育鴻,梅思,符偉玉,吳科鋒,4,*,李文德

    (1.廣東醫(yī)科大學(xué)廣東天然藥物研究與開發(fā)實(shí)驗(yàn)室,廣東湛江524023;2.梅州市人民醫(yī)院,廣東梅州514000;3.廣東醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究所,廣東湛江524023;4.廣東醫(yī)科大學(xué)南海海洋醫(yī)藥研究院,廣東湛江524023;5.廣東省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物監(jiān)測(cè)所,廣東廣州510000)

    黑色素瘤又稱惡性黑色素瘤,是由分布于神經(jīng)嵴黑色素細(xì)胞所形成的痣或色素斑惡化而成,其惡性程度高,具有高度侵襲性,易發(fā)生轉(zhuǎn)移,是目前為止導(dǎo)致死亡人數(shù)最多的皮膚腫瘤[1-2]。黑色素瘤主要發(fā)生在皮膚,但也可發(fā)生于眼睛、腸道及體內(nèi)含有黑色素細(xì)胞的任何部分[3-4]。早期黑色素瘤可以通過手術(shù)切除達(dá)到有效治療,但中晚期惡性黑色素瘤對(duì)常規(guī)的放療、化療不敏感,缺乏有效的治療手段[5-6],且常規(guī)的化療藥物存在不良反應(yīng)大,患者依從性差等特點(diǎn)[7]。因此,從天然的中藥材中尋找有效的抗黑色素瘤藥物成為研究的熱點(diǎn)。

    黃皮果為蕓香科植物黃皮 [Clausena lansium(Lour.)Skeels]的成熟果實(shí),是藥食同源的民間藥材,其肉、皮和核皆可入藥[8]。黃皮果核具有行氣止痛、健胃消腫等多方面的生物活性,常用于治療胃痛、疝痛、痛經(jīng)和風(fēng)濕骨痛[9]。大量文獻(xiàn)報(bào)道,黃皮果揮發(fā)油主要成分為萜類、醇類、酯類、酮類及醛類,進(jìn)一步的研究也指出,該揮發(fā)油具有殺蟲、抑菌、抗氧化等作用[10-11]。前期研究發(fā)現(xiàn)黃皮果核揮發(fā)油主要成分為烯醇類,占揮發(fā)油成分的56.74%以上,并可改善因紫外線引起的皮膚老化損傷[12],而對(duì)于其抗腫瘤活性及其他生物活性的研究鮮見報(bào)道。因此希望進(jìn)一步探究該揮發(fā)油抗黑色素瘤細(xì)胞增殖作用的影響。

    1 材料與方法

    1.1 細(xì)胞株

    小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞:中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)。

    1.2 試劑與儀器

    黃皮果核揮發(fā)油(essential oil of kernel,EOK):廣東醫(yī)科大學(xué)天然藥物研究與開發(fā)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存[12];磷脂酰絲氨酸蛋白抗體/碘化丙啶(Annexin V-FITC/propidiun iodide,Annexin V-FITC/PI) 細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒:北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司;0.25%胰酶溶液(1x):吉諾生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司;超敏ECL(electro-chemi-luminescence)化學(xué)發(fā)光試劑盒(BeyoECL Plus)、羅丹明 123(rhodamine 123,Rh 123)、放射免疫沉淀(radio immunoprecipitation assay,RIPA)裂解液、二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白濃度測(cè)定試劑盒:碧云天生物技術(shù)研究所;胎牛血清、高糖培養(yǎng)基(dulbecco’s modified eagle medium,DMEM)、磷酸鹽緩沖液(phosphote buffered soline,PBS):美國(guó) Gibco公司;青霉素-鏈霉素雙抗溶液:廣州威佳科技有限公司;3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴鹽[3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyl-2-H-tetrazolium bromide,MTT]:Sigma 公司;二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide,DMSO):美國(guó) SANTA CRUZ公司;十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis,SDS-PAGE) 凝膠快速配置試劑盒:北京鼎國(guó)昌盛生物技術(shù)有限公司;預(yù)染蛋白標(biāo)記:美國(guó) Thermo公司;β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)、辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗、P65、Bcl-2、Bax、Cleaved-caspase 3等一抗:美國(guó)SAB公司;一抗稀釋液、二抗稀釋液:Biosharp公司;0.22 μm聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF):美國(guó) Millipore公司。

    IX73型倒置熒光顯微鏡:Olympus公司;通用水套CO2培養(yǎng)箱:美國(guó)Thermo公司;SW-CJ-1D單人單面垂直凈化工作臺(tái):江蘇蘇凈集團(tuán)有限公司;HR/T16MM微量高速冷凍離心機(jī):湖南赫西儀器裝備有限公司;SHA-B數(shù)顯恒溫水浴震蕩器:天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠;AUW120D型電子分析天平:日本SHI-MADAU公司;迷你雙垂直電泳槽、轉(zhuǎn)印系統(tǒng):美國(guó)Bio-Rad公司;Epoch 酶標(biāo)儀:美國(guó) Bio-Tek;EPICS XL-MCL流式細(xì)胞儀:美國(guó)BECKMAN COULTER公司。

    1.3 方法

    1.3.1 黃皮果果核揮發(fā)油(essential oil of kernel,EOK)的提取與分離

    稱取一定量黃皮果核,加水浸泡后采用水蒸氣蒸餾法提取揮發(fā)油,冷卻后收集揮發(fā)油。采用冷凍結(jié)晶法分離得到液態(tài)揮發(fā)油。通過氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用(gas chromatography-mass spectrometry,GC-MS) 分析顯示,在EOK中檢測(cè)到33種化合物,其主要化合物是烯醇類,主要成分含量占56.74%。

    1.3.2 細(xì)胞培養(yǎng)

    B16-F10細(xì)胞均培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中,置37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長(zhǎng)至80%左右時(shí),按1∶3或1∶2傳代,取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)。

    1.3.3 MTT法檢測(cè)細(xì)胞存活率

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以3.5×103個(gè)/孔均勻接種于96孔板,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱,待細(xì)胞貼壁后,加入不同濃度的 EOK(0.2、0.4、0.6、0.8 μL/mL),空白組加入等量生理鹽水,每組6個(gè)復(fù)孔,分別孵育24、48、72 h 后吸取上清液,每孔加入 MTT(5 g/L)20 μL,繼續(xù)培養(yǎng)4 h,隨后小心吸出培養(yǎng)液,加入DMSO 150 μL/孔溶解甲鐕,振蕩搖勻,結(jié)晶完全溶解后,酶標(biāo)儀于波長(zhǎng)570 nm處測(cè)量各孔的吸光度(OD值),并計(jì)算細(xì)胞抑制率。

    1.3.4 觀察細(xì)胞形態(tài)

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以2×104個(gè)/孔均勻接種于12孔板,置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁,將培養(yǎng)基更換為不同濃度的含EOK培養(yǎng)基,在37℃孵育24 h后,將培養(yǎng)液更換為適量的PBS,在顯微鏡下觀察并拍照。

    1.3.5 細(xì)胞凋亡檢測(cè)

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以5×104個(gè)/孔均勻接種于6孔板,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。將培養(yǎng)基更換為不同濃度的含EOK培養(yǎng)基,37℃孵育24 h后,用胰酶消化收集細(xì)胞于1.5 mL試管中,在4℃、2 000 r/min條件下離心5 min,棄去上清液,用PBS洗滌2遍。細(xì)胞懸浮于500 μL的緩沖液中,添加5 μL磷脂酰絲氨酸蛋白抗體并混勻,再加入碘化丙啶試劑10 μL,室溫避光反應(yīng)15 min,然后在1 h內(nèi)進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

    1.3.6 線粒體膜電位的檢測(cè)

    取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞以5×104個(gè)/孔均勻接種6孔板,置37℃、5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)至細(xì)胞貼壁。將培養(yǎng)基更換為不同濃度的EOK培養(yǎng)基,37℃孵育24 h后,用無血清培養(yǎng)基洗滌1次,加入稀釋好的Rh123工作液(20 μmol/L)1 mL,置細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育20 min,PBS洗滌3次,倒置熒光顯微鏡下觀察并拍照。

    1.3.7 蛋白免疫印跡試驗(yàn)

    RIPA裂解液按試劑盒說明書要求裂解細(xì)胞,分離上清液,即細(xì)胞總蛋白。BCA法測(cè)定蛋白濃度,10%SDS-PAGE凝膠電泳分離蛋白,轉(zhuǎn)膜。將印跡的聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride,PVDF)依次進(jìn)行封閉、加入對(duì)應(yīng)的一抗、二抗、抗體結(jié)合區(qū)帶加入電化學(xué)發(fā)光顯色液,掃描后保存。以β-actin為內(nèi)參,分析各組細(xì)胞目的蛋白相對(duì)表達(dá)量。

    1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

    2 結(jié)果與分析

    2.1 黃皮果果核揮發(fā)油對(duì)小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞增殖抑制的影響

    通過MTT法檢測(cè)EOK對(duì)小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16-F10細(xì)胞的抗增殖活性,結(jié)果如圖1所示。

    圖1 EOK對(duì)B16-F10細(xì)胞增殖的影響Fig.1 Effect of EOK on the growth of B16-F10 cells

    當(dāng)揮發(fā)油濃度為0.2 μL/mL,作用24 h后,對(duì)小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞的抑制率為(5.67±3.25)%,但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;當(dāng)作用48、72 h后,抑制率分別為(44.65±3.96)%、(53.39±4.70)%(P<0.01)。當(dāng)藥物濃度分別為0.4、0.6、0.8 μL/mL時(shí),隨著作用時(shí)間的增加,細(xì)胞增殖抑制率明顯升高,且呈現(xiàn)濃度依賴性和時(shí)間依賴性。由此可見,EOK對(duì)小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞具有明顯的增殖抑制作用。

    2.2 黃皮果果核揮發(fā)油對(duì)細(xì)胞形態(tài)影響

    EOK處理24 h對(duì)B16-F10細(xì)胞形態(tài)變化的影響結(jié)果見圖2。

    圖2顯示,對(duì)照組細(xì)胞貼壁狀態(tài)良好,緊密排列,呈不規(guī)則梭形(圖2A);與對(duì)照組相比,EOK作用24 h后,0.2 μL/mL、0.4 μL/mL 組細(xì)胞變長(zhǎng),細(xì)胞間隙增大,呈現(xiàn)樹突網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),且有黑色顆粒物;隨著藥物濃度的增加,細(xì)胞數(shù)量逐漸減少,細(xì)胞形態(tài)也驟變,0.8 μL/mL細(xì)胞體積明顯縮小,呈現(xiàn)固縮的圓形結(jié)構(gòu),黑色顆粒物不明顯,漂浮在細(xì)胞培養(yǎng)液中的細(xì)胞增多。從形態(tài)方面預(yù)示著B16-F10細(xì)胞處于凋亡狀態(tài)。

    圖2 EOK處理24 h對(duì)B16-F10細(xì)胞形態(tài)變化的影響Fig.2 EOK deal with the effect of 24 h on the morphological changes of B16-F10 cells

    圖3 Annexin V-FITC/PI雙染的流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率Fig.3 Apoptosis rate of B16-F10 cells detected by flow cytometric analysis

    2.3 黃皮果果核揮發(fā)油對(duì)B16-F10細(xì)胞凋亡的影響

    Annexin V-FITC染色觀察B16-F10細(xì)胞凋亡情況見圖3。

    細(xì)胞凋亡的檢測(cè)方法有很多中,各有其特點(diǎn)。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡,具有快速、靈敏度高、可以定量等優(yōu)點(diǎn)。其中Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記染色最為常用。磷脂酰絲氨酸(phasphatidylserine,PS)正常位于細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè),但在細(xì)胞凋亡的早期,由于細(xì)胞膜失去對(duì)稱性,PS可從細(xì)胞膜的內(nèi)側(cè)翻轉(zhuǎn)至細(xì)胞膜的表面,暴露在細(xì)胞外環(huán)境中。磷脂結(jié)合蛋白V(Annexin V)是一種鈣依賴的磷脂結(jié)合蛋白,它與PS高親和力特異性結(jié)合。熒光素FITC標(biāo)記的Annexin V可作為探針檢測(cè)暴露在細(xì)胞膜外側(cè)的的PS,指示凋亡細(xì)胞,但壞死細(xì)胞PS也會(huì)顯露在外表使Annexin V-FITC結(jié)合成陰性,必須加入碘化丙啶(propidiun iodide,PI)才能區(qū)分壞死細(xì)胞[13-14]。碘化丙啶是一種核酸染料,它不能透過完整的細(xì)胞膜,但在凋亡中晚期的細(xì)胞和死細(xì)胞,PI能通過細(xì)胞膜而使細(xì)胞核著色。流式細(xì)胞儀分析結(jié)果顯示,與對(duì)照組(圖3A)比較,隨著EOK濃度的增加,凋亡比例也隨著增加,其誘導(dǎo)B16-F10細(xì)胞凋亡率分別為5.66%、30.34%、36.04%。這表明EOK能誘導(dǎo)B16-F10細(xì)胞凋亡。

    2.4 黃皮果果核揮發(fā)油對(duì)B16-F10細(xì)胞線粒體膜電位(mitochondrial membrane potential,MMP)的影響

    羅丹明123(rhodamine 123)是一種可透過細(xì)胞膜的陽(yáng)離子熒光染料,是一種線粒體跨膜電位的指示劑。其在正常細(xì)胞中能夠依賴線粒體跨膜電位進(jìn)入線粒體基質(zhì),熒光強(qiáng)度減弱或消失。而在凋亡發(fā)生時(shí),線粒體膜完整性破壞,線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔開放,引起線粒體跨膜電位(ΔΨm)的崩潰,Rh123重新釋放出線粒體,從而發(fā)出強(qiáng)黃綠色熒光,因此可以根據(jù)相對(duì)熒光信號(hào)的強(qiáng)度來衡量MMP的變化[15]。熒光染色法檢測(cè)B16-F10細(xì)胞線粒體膜電位水平見圖4。

    圖4 熒光染色法檢測(cè)B16-F10細(xì)胞線粒體膜電位水平Fig.4 Detection of mitochondrial membrane potential level of B16-F10 cells by fluorescent staining

    從圖4中可以看出,EOK處理24 h后,與對(duì)照組比較,藥物處理組細(xì)胞內(nèi)的熒光明顯增強(qiáng),而且隨著濃度增大而增強(qiáng),高濃度組所發(fā)熒光非常顯著,說明線粒體膜完整性可能已破壞,引起ΔΨm的崩潰,并隨藥物濃度的不同而使MMP出現(xiàn)不同程度的受損。結(jié)果表明EOK誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡與抑制線粒體膜電位密切相關(guān)。

    2.5 黃皮果果核揮發(fā)油對(duì)B16-F10細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白的影響

    NF-κB是一類具有多向轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)作用的核蛋白因子,在細(xì)胞胞漿內(nèi)是以無活性形式存在,通過I-B激酶(IK)激活后,受抑制的NF-κB得以釋放,發(fā)生核移位,在核內(nèi)積累并與特異性的B序列相結(jié)合啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄。核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB的下調(diào),可促使與抗凋亡相關(guān)的NF-κB靶基因如TNF受體相關(guān)因子1等表達(dá)減弱,從而促進(jìn)凋亡。NF-κB也可調(diào)控Bcl-2家族中兩個(gè)抗凋亡蛋白:Bfl-1/A1、Bcl-X1的表達(dá),也誘導(dǎo)Bcl-2和抑制Bax基因表達(dá)[16-17]。而Bcl-2與Bax這兩種蛋白參與構(gòu)成線粒體通路,分別具有抑制和促進(jìn)細(xì)胞凋亡的作用,Bax/Bcl-2蛋白比值決定了細(xì)胞的生存和死亡。凋亡通路相關(guān)蛋白Bcl-2/Bax/caspase 3被激活,Bax/Cleaved-caspase 3蛋白表達(dá)增加,而Bcl-2蛋白被抑制,是經(jīng)典的線粒體凋亡途徑[18]。

    EOK 對(duì) B16-F10 細(xì)胞 NF-κB(P-P65)、NF-κB(P65)蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖5。

    圖5 EOK 對(duì) B16-F10 細(xì)胞 NF-κB(P-P65)、NF-κB(P65)蛋白表達(dá)的影響Fig.5 Effect of EOK on NF-κB(P-P65)and NF-κB(P65)protein expression in B16-F10 cells

    從圖5中可以看出,與對(duì)照組相比,隨著黃皮果果核揮發(fā)油濃度的增加,NF-κB(P-P65)與 NF-κB(P65)蛋白表達(dá)均下調(diào),其中在濃度0.2 μL/mL作用下蛋白表達(dá)量有所減少(P<0.01);且對(duì) NF-κB(P65)蛋白表達(dá)的抑制作用比對(duì)NF-κB(P-P65)蛋白表達(dá)的抑制作用更為明顯。同時(shí)檢測(cè)Bcl-2和Bax蛋白的表達(dá)情況,結(jié)果如圖6所示。

    圖6 EOK對(duì)B16-F10細(xì)胞Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)的影響Fig.6 Effect of EOK on Bax and Bcl-2 protein expression in B16-F10 cells

    與對(duì)照組相比,隨著果核揮發(fā)油濃度的增大,Bax蛋白表達(dá)增多,其中0.4、0.8 μL/mL組尤為明顯(P<0.05或 P<0.01);而 Bcl-2 蛋白表達(dá)在 0.8 μL/mL 組減少尤為明顯(P<0.01)。通過統(tǒng)計(jì),Bax/Bcl-2的比值增大,0.4、0.8 μL/mL組與對(duì)照組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。

    對(duì)B16-F1細(xì)胞Cleaved-caspase 3蛋白表達(dá)的影響結(jié)果見圖7。

    圖7 EOK對(duì)B16-F10細(xì)胞Cleaved-caspase 3蛋白表達(dá)的影響Fig.7 Effect of EOK on Cleaved-caspase 3 protein expression in B16-F10 cells

    如圖7所示,黃皮果果核揮發(fā)油也能上調(diào)Cleaved-caspase 3蛋白的表達(dá)。與對(duì)照組相比,0.4、0.8 μL/mL 組差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。這些結(jié)果表明,線粒體途徑參與黃皮果果核揮發(fā)油誘導(dǎo)B16-F10細(xì)胞的凋亡,其機(jī)制可能與抑制胞內(nèi)NF-кB P65蛋白表達(dá),降低其磷酸化水平,激活Bcl-2/Bax/caspase 3信號(hào)通路有關(guān)。

    3 結(jié)論

    水蒸氣蒸餾法提取的黃皮果核揮發(fā)油作用于小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞后,MTT法測(cè)定藥物濃度≥0.2 μL/mL時(shí),黃皮果核揮發(fā)油對(duì)B16-F10細(xì)胞增殖有明顯的抑制作用。Annexin V-FITC/PI染色結(jié)果表明,在黃皮果核揮發(fā)油作用24 h后,0.8 μL/mL組凋亡細(xì)胞的比例高達(dá)36.06%。在羅丹明123染色檢測(cè)黃皮果核揮發(fā)油對(duì)B16-F10細(xì)胞線粒體膜電位有顯著影響,且隨著藥物濃度增大,熒光強(qiáng)度增強(qiáng)。蛋白免疫印跡結(jié)果表明,黃皮果核揮發(fā)油能下調(diào)NF-κB(PP65)、NF-κB(P65)、Bcl-2 的表達(dá),同時(shí)上調(diào) Bax、Cleaved-caspase 3的表達(dá)。因此,試驗(yàn)結(jié)果表明:黃皮果果核揮發(fā)油以誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的方式抑制小鼠黑色素瘤B16-F10細(xì)胞增殖,其機(jī)制與抑制胞內(nèi)NF-кB P65蛋白表達(dá),降低其磷酸化水平,激活Bcl-2/Bax/caspase 3信號(hào)通路有關(guān)。

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