食用明膠中微量鉻含量測(cè)定的方法研究

（廣西-東盟食品藥品安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心，廣西南寧530021）

鉻（chromium）廣泛存在于自然界中，人體中微量鉻對(duì)人的糖代謝、脂肪代謝、蛋白質(zhì)及核酸的相互作用有著重要的影響，然而鉻的過(guò)度攝入會(huì)對(duì)人體造成危害[1]，國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)（international agency for researchoncancer，IARC）已將六價(jià)鉻列為人類致癌物[2]。食用明膠（gelatin）是用新鮮動(dòng)物皮骨提取的膠原蛋白質(zhì)[3]，為淡無(wú)色至淡黃色薄片狀或粉粒狀末，無(wú)臭、無(wú)味，應(yīng)用于食品工業(yè)作賦形劑、增稠劑，是食品工業(yè)廣泛應(yīng)用的添加劑。人體如果攝入含鉻明膠，其中的六價(jià)鉻會(huì)引起細(xì)胞周期調(diào)控系統(tǒng)CDK6異常表達(dá)改變細(xì)胞周期和DNA相關(guān)修復(fù)過(guò)程從而引發(fā)腫瘤[4]。因此食用明膠鉻含量檢測(cè)已成為食品藥品檢測(cè)的一個(gè)重要指標(biāo)。目前測(cè)定食用明膠中微量鉻的前處理方式主要有微波消解、濕法消解、干法灰化[5]；測(cè)定方法主要有原子熒光（atomic fluorescence spectrometry，AFS）法、原子吸收-石墨爐（graphite furnace atomic absorption apectrometry，GF-AAS）法和電感耦合等離子質(zhì)譜（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）法[6-9]。目前國(guó)內(nèi)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)如：GB 5009.123-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中鉻的測(cè)定》[10]及GB 5009.268-2016《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品中多元素的測(cè)定》[11]中已有關(guān)于鉻測(cè)定的方法，但由于食品基質(zhì)的復(fù)雜性和鉻元素的化學(xué)特性，按標(biāo)準(zhǔn)操作會(huì)出現(xiàn)某些基質(zhì)的樣品消解不徹底、儀器測(cè)定存在特殊干擾等情況，導(dǎo)致鉻測(cè)定的精密度低、準(zhǔn)確度差。本研究擬采用3種樣品前處理方法及2種檢測(cè)儀器進(jìn)行綜合全面的比較，以期確立一種快速、便捷、準(zhǔn)確，適用于食用明膠中微量鉻的測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備

900T原子吸收光譜儀：PerkinElmer公司；Icap Q電感耦合等離子體質(zhì)譜儀：Thermo公司；Mars6微波消解儀：CEM公司；P330馬弗爐：Nabertherm公司；BHW-09C石墨電熱消解儀：北京博通公司；ML204電子天平（感量0.1 mg和1 mg）：Mettler Toledo公司；Milli-Q超純水儀：Millipore公司。

1.2 材料與試劑

食用明膠質(zhì)控樣：編號(hào)T01530；鉻標(biāo)準(zhǔn)值范圍：380 μg/kg～719 μg/kg，中值：600 μg/kg，分析實(shí)驗(yàn)室能力驗(yàn)證 （food analysis performance assessment scheme，F(xiàn)APAS）考核組織提供。

鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液、鈧標(biāo)準(zhǔn)溶液：1 000 mg/L，介質(zhì)為2%硝酸，美國(guó)O2SI公司；硝酸、氫氟酸：分析純，德國(guó)Merck公司；30%過(guò)氧化氫：優(yōu)級(jí)純，廣東光華科技股份有限公司；氬氣：純度99.999%，廣西國(guó)信氣體研究有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

1）鉻標(biāo)準(zhǔn)使用液：將鉻標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用硝酸溶液（5+95）逐級(jí)稀釋至濃度為100 ng/mL。

2）鈧標(biāo)準(zhǔn)使用液：將鈧標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液用硝酸溶液（5+95）逐級(jí)稀釋至濃度為10 ng/mL。

3）標(biāo)準(zhǔn)系列溶液的配制：分別吸取鉻標(biāo)準(zhǔn)使用液（100 ng/mL）0、0.5、1.00、2.00、3.00、4.00 mL 于 25 mL容量瓶中，用硝酸溶液（5+95）稀釋至刻度，混勻。各容量瓶中每毫升分別含鉻 0、2.00、4.00、8.00、16.0 ng。由GF-AAS和ICP-MS分別吸取標(biāo)準(zhǔn)系列溶液進(jìn)行測(cè)定。

1.3.2 樣品前處理方法

1.3.2.1 微波消解

準(zhǔn)確稱取試樣約0.5 g（精確至0.001 g）于微波消解罐中，分別加入6 mL硝酸、4 mL硝酸和2 mL氫氟酸、4 mL硝酸和2 mL雙氧水，按照微波消解的操作步驟消解試樣（消解條件參見表1）。冷卻后取出消解罐，在電熱板上于140℃～160℃趕酸至0.5 mL～1.0 mL。消解罐放冷后，將消化液轉(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，用少量水洗滌消解罐2次～3次，合并洗滌液，用水定容至刻度。同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)、加標(biāo)回收試驗(yàn)和平行性試驗(yàn)，微波消解程序見表1。

表1 微波消解儀工作條件Table 1 Working parameters of microwave digestion

1.3.2.2 濕法消解

準(zhǔn)確稱取試樣約0.5 g（精確至0.001 g）于消化管中，分別加入6 mL硝酸、4 mL硝酸和2 mL氫氟酸、4 mL硝酸和2 mL雙氧水，在可調(diào)式電熱爐上消解（升溫程序：120℃保持0.5 h、升溫至180℃2 h、升溫至200℃）。若消化液呈棕褐色，再加硝酸，消解至冒白煙，消化液呈無(wú)色透明或略帶黃色，取出消化管，冷卻后用水定容至10 mL。同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)、加標(biāo)回收試驗(yàn)和平行性試驗(yàn)。

1.3.2.3 干法灰化

準(zhǔn)確稱取試樣約2 g（精確至0.001 g）于30 mL坩堝中，置于馬弗爐中，于550℃恒溫3 h～4 h，至試樣呈白灰狀，取出冷卻，用硝酸溶液（1+1）溶解并用水定容至10 mL。同時(shí)做試劑空白試驗(yàn)、加標(biāo)回收試驗(yàn)和平行性試驗(yàn)。

1.3.3 測(cè)定方法

1.3.3.1 原子吸收-石墨爐法（GF-AAS）

鉻元素原子化溫度高，經(jīng)對(duì)比，食用明膠的測(cè)定即使不加基體改進(jìn)劑，原子化過(guò)程中也不會(huì)出現(xiàn)干擾，因此選擇不使用基體改進(jìn)劑以獲得更高的靈敏度。測(cè)定波長(zhǎng)：357.87 nm；狹縫寬度：0.7 nm；燈電流：5 mA；進(jìn)樣體積：20 μL；背景扣除：塞曼扣背景；GFAAS工作參數(shù)見表2。

表2 GF-AAS主要工作參數(shù)Table 2 Main operating parameters of GF-AAS

1.3.3.2 電感耦合等離子體質(zhì)譜法（ICP-MS）

鉻同位素有50Cr、52Cr、53Cr、54Cr，其中52Cr天然豐度最高且干擾較低，選為待測(cè)同位素。52Cr主要的多原子離子干擾為40Ar12C+、36S16O+、38Ar14N+、36Ar16O+，使用動(dòng)能歧視型碰撞池（kinetic energy discrimination，KED）模式，通入氦氣作為碰撞氣，能有效減少干擾。ICP-MS測(cè)量過(guò)程中，被測(cè)元素的信號(hào)受樣品溶液中共存元素或基體元素的影響，引起被測(cè)物信號(hào)的增強(qiáng)或減弱的現(xiàn)象，稱之為抑制或增敏效應(yīng)[12]。抑制或增強(qiáng)效應(yīng)可通過(guò)內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行校正，使用10 ng/mL的鈧（Sc）作為內(nèi)標(biāo)元素可以減少這些干擾及儀器各種條件的波動(dòng)帶來(lái)的影響，ICP-MS工作參數(shù)見表3。

1.3.3.3 鉻含量計(jì)算公式

表3 KED模式ICP-MS主要工作參數(shù)Table 3 Main operating parameters of ICP-MS in KED mode

式中：X為樣品中鉻的含量，μg/kg；Cx為樣品溶液中鉻的質(zhì)量濃度，ng/mL；C0為空白溶液中鉻的質(zhì)量濃度，ng/mL；V為樣品溶液定容體積，mL；m為樣品稱樣量，g。

2 結(jié)果與分析

2.1 不確定度分量來(lái)源的分析

GF-AAS法及ICP-MS法測(cè)定明膠鉻含量的不確定度的主要來(lái)自：標(biāo)準(zhǔn)曲線擬合計(jì)算濃度過(guò)程；樣品重復(fù)性測(cè)定次數(shù)；樣品的處理過(guò)程；標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制過(guò)程[13]；分析儀器的相對(duì)不確定度。

2.2 樣品測(cè)定結(jié)果分析

本文比較了3種不同的消解方式，結(jié)果見表4和表5。

表4 GF-AAS測(cè)定鉻結(jié)果Table 4 GF-AAS results of chromium

由表4和表5可知，干法灰化法在樣品經(jīng)馬弗爐灰化后加酸溶解并轉(zhuǎn)移的過(guò)程中，易造成鉻元素?fù)p失；濕法消解耗時(shí)長(zhǎng)且消解不夠徹底；微波消解耗時(shí)短且消解效果好，平行樣精密度高。研究了不同的酸體系的消解效果，結(jié)果表明，硝酸-過(guò)氧化氫體系消解效果最佳，過(guò)氧化氫能夠使樣品消解液更澄清透亮，起到氧化脫色作用，羥自由基同時(shí)也更利于有機(jī)物的分解，從結(jié)果來(lái)看該消解體系得到的樣品溶液測(cè)定結(jié)果精密度最高，也接近質(zhì)控樣的標(biāo)準(zhǔn)值；而硝酸-氫氟酸體系消解過(guò)程中引入氟離子，在趕酸過(guò)程中即使加入高氯酸也較難將氟趕盡，在高氯酸趕F的操作中，時(shí)間不易控制，時(shí)間不夠或過(guò)長(zhǎng)均會(huì)導(dǎo)致鉻測(cè)定結(jié)果的偏高或偏低[14]，效果不理想。此外，還比較了不同的儀器，對(duì)同一消解方式的測(cè)定結(jié)果：鉻是高溫元素，在原子化溫度（橫向加熱）高達(dá)2 300℃時(shí)，干擾極少，原子吸收-石墨爐測(cè)定的結(jié)果比較穩(wěn)定，而電感耦合等離子體質(zhì)譜測(cè)定鉻時(shí)，鉻易被同質(zhì)荷比的多原子離子干擾，開啟碰撞模式消除這類干擾則使靈敏度下降，導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果穩(wěn)定性較原子吸收-石墨爐法差。

表5 ICP-MS測(cè)定鉻結(jié)果Table 5 ICP-MS results of chromium

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果

鉻標(biāo)準(zhǔn)曲線測(cè)定結(jié)果見圖1，圖2。

圖1 GF-AAS標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.1 GF-AAS calibration curve

2.4 檢出限

GF-AAS和ICP-MS的儀器檢出限均采用純水連續(xù)11次測(cè)定鉻信號(hào)值的3倍標(biāo)準(zhǔn)偏差所相當(dāng)?shù)你t濃度，再經(jīng)過(guò)稀釋倍數(shù)和取樣質(zhì)量及單位轉(zhuǎn)換系數(shù)的換算，得到對(duì)應(yīng)方法檢出限GF-AAS法：0.01 mg/kg；ICPMS法：0.006 mg/kg，均能很好地滿足試驗(yàn)靈敏度需求。

圖2 ICP-MS標(biāo)準(zhǔn)曲線圖Fig.2 ICP-MS calibration curve

2.5 回收率試驗(yàn)

按照不同前處理方法分別稱取試樣，向其中加入與稱取試樣鉻含量接近的鉻標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別按照相應(yīng)的前處理方法制備得到回收率試樣待測(cè)液，供GFAAS及ICP-MS測(cè)定，得到不同前處理?xiàng)l件下的試樣回收率，回收率見表6、表7。

表6 GF-AAS加標(biāo)回收率Table 6 GF-AAS spike recovery

表7 ICP-MS加標(biāo)回收率Table 7 ICP-MS spike recovery

綜合比較表6、表7中回收率情況，可以看出干法回收率略低，各種酸體系的微波消解和濕法消解所得回收率測(cè)定液，在GF-AAS和ICP-MS中測(cè)得回收率結(jié)果均比較滿意。

2.6 精密度試驗(yàn)

按照2.2中微波消解（體系1～體系3）、濕法消解（體系1～體系3）、干法灰化的7種前處理方式，各取7份平行樣進(jìn)行前處理，所得7組待測(cè)樣品溶液分別在GF-AAS和ICP-MS上進(jìn)行精密度測(cè)定，結(jié)果表明相比較于其他前處理方法，硝酸-過(guò)氧化氫體系—微波消解這一前處理方法所得的結(jié)果精密度最好，在GFAAS上測(cè)得RSD=1.7%，在ICP-MS上測(cè)得RSD=2.6%，試驗(yàn)數(shù)據(jù)詳見表8、表9。

表8 GF-AAS精密度（n=7）Table 8 GF-AAS precision（n=7）

表9 ICP-MS精密度（n=7）Table 9 ICP-MS precision（n=7）

2.7 重現(xiàn)性

取同一食用明膠質(zhì)控樣，在不同的實(shí)驗(yàn)室設(shè)備條件下，由不同的人員按照同樣的方法操作（試驗(yàn)2），得到的鉻測(cè)定結(jié)果與原測(cè)定結(jié)果（試驗(yàn)1）對(duì)比見表10、表11。

表10 GF-AAS測(cè)定鉻結(jié)果Table 10 GF-AAS results of chromium

表11 ICP-MS測(cè)定鉻結(jié)果Table 11 ICP-MS results of chromium

3 結(jié)論與討論

硝酸-過(guò)氧化氫體系-微波消解-原子吸收-石墨爐這一測(cè)定方法，樣品消解效果最好，平行樣測(cè)定結(jié)果精密度最高，所得結(jié)果較接近標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)鉻含量的標(biāo)準(zhǔn)值，加標(biāo)回收測(cè)定結(jié)果最為滿意。如不加過(guò)氧化氫溶液，從濕法消解結(jié)果及ICP-MS測(cè)定結(jié)果看來(lái)，精密度、偏離標(biāo)準(zhǔn)值、加標(biāo)回收率等方面結(jié)果較差。

本研究經(jīng)過(guò)多方面對(duì)比，樣品使用硝酸-雙氧水消解體系進(jìn)行微波密閉消解并采用原子吸收-石墨爐法測(cè)定食用明膠中微量鉻，靈敏度高、精密度高、準(zhǔn)確度好、重現(xiàn)性好、回收率高，質(zhì)控樣測(cè)定結(jié)果接近其中值，是適合用于明膠中微量鉻測(cè)定的較好的方法。