市售鮮活魚蝦中獸藥殘留檢測與分析

（徐州出入境檢驗檢疫局，江蘇徐州221000）

魚蝦等水產(chǎn)品含有豐富的蛋白質(zhì)，易為人體吸收，且脂肪含量低，已成為我國居民獲取動物蛋白的重要來源。但因獸藥殘留超標(biāo)事件頻發(fā)，我國水產(chǎn)品安全質(zhì)量曾深受國內(nèi)外詬病，對居民食用水產(chǎn)品也構(gòu)成嚴(yán)重的健康風(fēng)險[1]。目前，魚蝦中獸藥殘留檢測的常用檢測方法有快速檢測試劑盒法、酶聯(lián)免疫法，液相色譜法、液相色譜儀質(zhì)譜法等?？焖贆z測試劑盒方法，檢測周期短，但是靈敏度和特異性低。酶聯(lián)免疫法特異性強(qiáng)，但是方法較繁瑣，成本較高。氣相色譜質(zhì)譜法，檢測項目覆蓋面低。液相色譜質(zhì)譜法，靈敏度高，覆蓋面廣，因此本次檢測分析采用液相色譜質(zhì)譜法，為了解徐州市鮮活魚蝦中藥物殘留情況，于2017年對市區(qū)農(nóng)貿(mào)市場銷售的鮮活魚蝦進(jìn)行了隨機(jī)抽樣檢測，并改進(jìn)了前處理方法，提高了檢測效率。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

API4000型液相串聯(lián)質(zhì)譜儀（liquid chromatography-mass spectrometry/mass spectrometry，LC-MS/MS）：美國AB公司；3-30KS低溫高速離心機(jī)：北京博勱行儀器有限公司；SHA-B恒溫水浴振蕩器：常州億通分析儀器制造有限公司；GM200粉碎機(jī)：德國RETSCH弗爾德（上海）儀器設(shè)備有限公司；R300旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：瑞士步琦有限公司；N-EVAP氮吹濃縮儀：美國organomation公司。

氯霉素標(biāo)準(zhǔn)品（chloramphenicol，CAP），純度98.5%；呋喃西林（nitrofural，SEM）、呋喃唑酮（furazolidone，AOZ）、呋喃它酮（furaltadone，AMOZ）標(biāo)準(zhǔn)品，純度99%；呋喃妥因（nitrofurantoin，AHD）標(biāo)準(zhǔn)品，純度 98.4%；孔雀石綠標(biāo)準(zhǔn)品（malachite green，MG）、隱性孔雀石綠（leucomalachite green，LMG），純度 95.8%、恩諾沙星標(biāo)準(zhǔn)品（enrofloxacin，ENR），純度 99.0%：德國Dr.E 公司；氯霉素-d5標(biāo)準(zhǔn)品（chloramphenicol-d5，CAP-d5），純度98.6%、硝基呋喃類代謝物同位素混合內(nèi)標(biāo)溶液，氘、碳-13、氮-15標(biāo)記的硝基呋喃類代謝物同位素標(biāo)準(zhǔn)品 AOZ-D4、AMOZ-D5、AHD-13C3、SEM-13C15N2、孔雀石綠（malachite green-D5，MG-D5）、隱性孔雀石綠內(nèi)標(biāo)物（leucomalachite green-D6，LMG-D6）、恩諾沙星內(nèi)標(biāo)（enrofloxacin-D5，ENR-D5）：德國 Witega公司。

1.2 樣品采集

1.2.1 采集點和采集方法

2017年3月～11月在徐州市區(qū)各大農(nóng)貿(mào)市場隨機(jī)采集鮮活魚蝦121份。主要采集常見的鯽魚、鯉魚、黃顙魚、黑魚、羅非魚、鳊魚、加州鱸魚、草魚、鳙魚、沼蝦和羅氏蝦等11種魚蝦。樣品由專業(yè)技術(shù)人員采集，采集時均為鮮活狀態(tài)。

1.2.2 檢測項目

121份魚蝦均檢測了孔雀石綠，其中65份還檢測了氯霉素、硝基呋喃類及其代謝物等禁用藥物，另外56份檢測了限量使用藥物恩諾沙星。

1.3 分析方法

1.3.1 樣品制備

樣品中取出有代表性樣品約500 g，取可食部分用粉碎機(jī)攪碎；將粉碎的樣品混合均勻，均分成兩份，分別裝入潔凈容器作為待測樣，密封，在-18℃條件下保存。

1.3.2 前處理操作

1.3.2.1 氯霉素

稱取5 g樣品（精確到0.01 g）于50 mL具塞離心管中，加入CAP-d5內(nèi)標(biāo)溶液，加入20 mL乙酸乙酯，高速均質(zhì)2 min，超聲10 min，然后以3 500 r/min離心5 min，收集上清液，于45℃下旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)至近干，然后依次加入4mL正己烷和5.0mL水溶解，并轉(zhuǎn)移至10mL試管中。振蕩1 min后離心，棄去有機(jī)相，取1 mL水相，過濾膜（0.45 μm）后上機(jī)測定。

1.3.2.2 硝基呋喃類

稱取2 g樣品（精確到0.01 g）于25 mL干凈玻璃離心管中，加入同位素內(nèi)標(biāo)混合液，150 μL鄰硝基苯甲醛（50 mmol/L），5 mL水和 0.5 mL～1.5 mL鹽酸（1 mol/L），調(diào)節(jié)pH＜2。漩渦振蕩15 s后，避光保存在37℃水浴中，振蕩過夜（約16 h）。取出離心管，冷卻至室溫，根據(jù)基質(zhì)加入1mL～3 mL磷酸氫二鉀（1 mol/L），精確調(diào)節(jié)pH值為7.0～7.5。加入8 mL乙酸乙酯，渦旋20 s，2 500 r/min離心5 min～10 min。將上層清液轉(zhuǎn)移至10 mL干凈玻璃試管中，40℃氮吹至干。用1 mL甲醇水溶液（1∶9，體積比）定容后，過濾膜（0.22 μm）后上機(jī)測定。

1.3.2.3 孔雀石綠

稱取5 g樣品（精確到0.01 g），加入MG-D5、LMGD6內(nèi)標(biāo)溶液，先加入孔雀石綠快速檢測前處理試劑盒中的提取液1（液體20.0 mL），用勻漿機(jī)以8 000 r/min速度均質(zhì)30 s，再加入提取液2（固體粉末），振蕩1 min，4 000 r/min離心5 min，取上清液10.0 mL于雞心瓶中，再加入異丙醇10 mL，50 mL中，再水浴旋轉(zhuǎn)蒸干，殘留物用2.5 mL流動相溶解，溶解液放入2.5 mL離心管中，8 000 r/min，離心 5 min，過濾膜（0.45 μm）后上機(jī)測定。

1.3.2.4 恩諾沙星

稱取5 g樣品（精確到0.01 g）于50 mL離心管中，加入ENR-D5內(nèi)標(biāo)溶液，用15 mL含1%乙酸的乙腈溶液15℃以下超聲提取5 min，15℃以下3 500 r/min離心5 min，收集上清液于另一潔凈的離心管中。重復(fù)上述提取步驟1次，合并上清液，加入15 mL正己烷，混合1 min，于15℃以下3 500 r/min離心5 min，棄去正己烷層。將下層乙腈轉(zhuǎn)移入100 mL平底燒瓶中，加入5 mL異丙醇，混合均勻，于45℃減壓蒸發(fā)至干。用5.0 mL流動相溶解殘渣，并轉(zhuǎn)移至15 mL離心管中，加入5 mL正己烷，混合1 min，于15℃以下3 500 r/min離心 5 min，棄去上層正己烷，下層過濾膜（0.45 μm）后上機(jī)測定。

1.3.3 色譜條件

1.3.3.1 氯霉素

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：25 μL；流動相：A相為甲醇，B相為水；梯度洗脫程序：0～2 min，A 相保持 30%；2.0 min～3.5 min，A 相從 30%線性升至90%，保持3.5 min；0.1 min內(nèi)，A相降至30%，保持至4 min；質(zhì)譜參數(shù)：采用電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI），負(fù)離子掃描模式（ESI-），多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）；離子源噴霧電壓：-4 500 V；離子源溫度550℃。MRM監(jiān)測離子對、去簇電壓（declustering potential，DP）、碰撞電壓（collision energy，CE）。

1.3.3.2 硝基呋喃類

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：25 ℃；流速：0.5 mL/min；進(jìn)樣量：25 μL；流動相：A相為甲醇，B相為醋酸銨水溶液（1.0 mmol/L，加入0.02%的甲酸）；梯度洗脫程序：0～2 min，A相保持10%；2.0 min～3.5 min，A相從 10%線性升至90%，保持3.2 min；0.1 min內(nèi)，A相降至10%，保持至10 min；質(zhì)譜參數(shù)：采用電噴霧離子源（ESI），正離子掃描模式（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子源噴霧電壓：5 500 V；離子源溫度600℃。MRM監(jiān)測離子對、去簇電壓（DP）、碰撞電壓（CE）。

1.3.3.3 孔雀石綠

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：35 ℃；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：25 μL；流動相：A相為乙腈，B相為5 mmol/L乙酸銨水溶液（用冰乙酸調(diào)節(jié)pH值為4.5，過0.2 μm微孔濾膜）；梯度洗脫程序：0～5.0 min，A相保持為 85%；5.0 min～7.0 min，A相從85%線性升至95%，保持5 min，0.2 min內(nèi)，A相降至85%，保持3.8 min；質(zhì)譜參數(shù)：采用電噴霧離子源（ESI），正離子掃描模式（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子源噴霧電壓5 500 V；離子源溫度550℃。MRM監(jiān)測離子對、去簇電壓（DP）、碰撞電壓（CE）。

1.3.3.4 恩諾沙星

色譜柱：Agilent Eclipse XDB-C18色譜柱（150 mm×4.6 mm，5 μm）；柱溫：30 ℃；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：25 μL；流動相：A相為含0.1%甲酸的水溶液，B相為含0.1%甲酸的乙腈；梯度洗脫程序：0～5.5 min，A相從87%線性降至10%，保持2 min。在0.1 min內(nèi)，A相升至87%，并保持6.4 min；質(zhì)譜參數(shù)：采用電噴霧離子源（ESI），正離子掃描模式（ESI+），多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；離子源噴霧電壓5 500 V；離子源溫度550℃。MRM監(jiān)測離子對、去簇電壓（DP）、碰撞電壓（CE）見表1。

表1 4種獸藥檢測的最優(yōu)質(zhì)譜條件Table 1 Optimized MRM conditions for four veterinary drugs

1.4 檢測結(jié)果判定依據(jù)

依據(jù)農(nóng)業(yè)部公告235號、560號。

2 結(jié)果與分析

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線及檢出限

采用內(nèi)標(biāo)法進(jìn)行定量，在標(biāo)準(zhǔn)系列溶液中加入同位素混合內(nèi)標(biāo)（與樣品中內(nèi)標(biāo)體積相同），按上述試驗步驟操作，以濃度c（ng/mL）為橫坐標(biāo)，峰面積比X（標(biāo)準(zhǔn)峰與內(nèi)標(biāo)峰面積之比）為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，線性回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限見表2。

2.2 加標(biāo)回收率和精密度試驗

以陰性樣品作為測試樣品，在檢出限濃度、2倍檢出限濃度、5倍檢出限濃度3個水平上進(jìn)行添加回收試驗，并按照上述方法進(jìn)行提取、凈化和測定，在相同條件下每個水平作6個平行樣，所得到的回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差見表3。

表2 4種獸藥的線性方程及檢出限、定量限Table 2 Linear equations，LOD and LOQ for four veterinary drugs

表3 4種獸藥加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Table 3 Recoveries and RSD for four veterinary drugs

續(xù)表3 4種獸藥加標(biāo)回收率和相對標(biāo)準(zhǔn)偏差Continue table 3 Recoveries and RSD for four veterinary drugs

2.3 2017年市售鮮活魚蝦藥物殘留情況

121份鮮活魚蝦中，合格108份，合格率89.26%。禁用藥物中氯霉素沒有檢出；孔雀石綠（含隱性孔雀石綠）和硝基呋喃類及其代謝物有不同程度的檢出，其中孔雀石綠的檢出情況最為嚴(yán)重，檢出率為7.44%（9/121），最高檢出值為 621.6 μg/kg；限量使用藥物恩諾沙星檢出率高達(dá)87.5%（49/56），但超標(biāo)率僅為3.57%（2/56）。由此可見，經(jīng)過多年管控治理，氯霉素和硝基呋喃類藥物已基本檢測不到，限用藥物恩諾沙星超標(biāo)率也較低，但是廉價高效的孔雀石綠檢出率仍比較高，值得引起相關(guān)部門注意。具體情況見表4。

表4 2017年4種獸藥殘留的檢出情況Table 4 Detection of four veterinary drugs in 2017

2.4 鮮活魚蝦中不同月份孔雀石綠檢出情況

表5 不同月份孔雀石綠檢出情況Table 5 Detection of malachite green in different month

續(xù)表5 不同月份孔雀石綠檢出情況Continue table 5 Detection of malachite green in different month

不同月份孔雀石綠檢出情況見表5。

從表5看出，在3月～5月和11月的38份（占樣品總數(shù)的31.40%）樣品中未檢測到孔雀石綠；6月和9月的檢出率分別為9.10%（1/11）和3.4 5%（1/29），最高檢出值為1.92 μg/kg；8月檢出率高達(dá)16.28%（7/43），最高檢出值高達(dá) 621.6 μg/kg，其余檢出值均低于15.6 μg/kg。

孔雀石綠主要用于預(yù)防和治理養(yǎng)殖及運輸過程中高發(fā)的水霉病、鰓霉病和小瓜蟲[2]，也是簡便高效的制霉劑和運輸消毒劑[3]，用量約在2 mg/kg到67 mg/kg之間[4]。銀旭紅等[5]對鯽魚以0.5 mg/kg濃度孔雀石綠進(jìn)行藥浴3 d，停藥后前7 d孔雀石綠快速代謝，前14 d隱性孔雀石綠快速代謝。至21 d，肌肉中孔雀石綠降解率約為99.35%，殘留量為17.29 μg/kg。據(jù)此推斷，絕大部分市售活魚是在用藥后至少21 d后上市，實際休藥時間可能更長。水霉病和小瓜蟲病常發(fā)生在4月至6月[6]，因此3月～5月基本檢測不到孔雀石綠，8月檢出率則高達(dá)16.28%，檢出值為621.6 μg/kg的魚，則可能是用孔雀石綠消毒運輸器具。

2.5 不同種類間孔雀石綠檢出率的比較

共采集9種淡水魚樣品119份，沼蝦和羅氏蝦各1份。其中有6種魚檢出孔雀石綠，說明孔雀石綠在淡水魚的養(yǎng)殖中使用范圍仍較廣。鳙魚檢出率最高，達(dá)25.00%（1/4），黃顙魚其次，達(dá) 16.67%（3/18），鳊魚和羅非魚檢出率均為12.50%（1/8），黑魚檢出率為7.14%（1/14），鯽魚檢出率為6.06%（2/33）。黃顙魚是徐州市場上常見的淡水魚，其檢出率較高，與其主要疾?。S顙魚紅頭病、黃顙魚細(xì)菌性爛鰓病、腸炎病和車輪蟲病）均在4月～7月間流行相吻合[7]，具體見表6。

表6 不同水產(chǎn)品中孔雀石綠檢出情況Table 6 Detection of malachite green in different species of aquatic products

2.6 不同種類間硝基呋喃類及其代謝物檢出情況

經(jīng)對63份活魚和2份活蝦檢測硝基呋喃類及其代謝物，魚中均未檢出，僅有的2份活蝦中（沼蝦和羅氏蝦）均檢出呋喃西林代謝物，含量分別為0.78 μg/kg和1.68 μg/kg。但有研究表明，呋喃西林代謝物存在非外源性來源，倪永付等[8]對來自出口備案養(yǎng)殖場未使用過硝基呋喃類藥物的小青蝦進(jìn)行檢測后發(fā)現(xiàn)，蝦殼和蝦肉中均能檢測到呋喃西林代謝物，平均含量分別為25.2 μg/kg和2.2 μg/kg，據(jù)此推斷蝦肉中的呋喃西林代謝物是由蝦殼產(chǎn)生并轉(zhuǎn)化而來。何伊娜等[9]對浙江284份養(yǎng)殖蝦蟹進(jìn)行呋喃西林代謝物檢測，發(fā)現(xiàn)青蝦和沼蝦檢出率為100%，平均含量分別為7.88 μg/kg和1.63 μg/kg，因此推斷蝦類本身就含有呋喃西林代謝物。據(jù)此推斷，本次沼蝦和羅氏蝦中檢出的呋喃西林應(yīng)該是非外源性，說明硝基呋喃類藥物的非法使用已基本得到控制。

2.7 不同月份恩諾沙星檢出情況

在4月～9月共采集9種活魚樣品56份（鯽魚14份，鯉魚10份，黃顙魚9份，黑魚9份，羅非魚3份，鳊魚3份，加州鱸魚3份，鯰魚3份，鰱魚3份），9種魚均檢出恩諾沙星，說明恩諾沙星在水產(chǎn)養(yǎng)殖中廣泛使用。4月沒有檢出，5月檢出率為71.43%，6月檢出率為80.0%，8月～9月檢出率高達(dá)95%以上，說明在水產(chǎn)養(yǎng)殖中幾乎都使用恩諾沙星防治疾病，尤其是在水溫較高季節(jié)，見表7。

表7 不同月份恩諾沙星檢出情況Table 7 Detection of enrofloxacin in different month

在對草魚體內(nèi)恩諾沙星及其代謝物的殘留消除規(guī)律進(jìn)行試驗研究，發(fā)現(xiàn)22 d后草魚體內(nèi)恩諾沙星及其代謝物殘留量消除至100 μg/kg以下，49 d后則檢測不到目標(biāo)物質(zhì)（檢測低限6 μg/kg）。本次調(diào)查檢測超標(biāo)率只有3.57%，說明大部分養(yǎng)殖戶能夠嚴(yán)格遵守休藥期的規(guī)定。

3 結(jié)論

研究建立水產(chǎn)品中氯霉素、硝基呋喃類及其代謝物、孔雀石綠和恩諾沙星等4種獸藥殘留的LC-MS/MS 檢測方法。4 種方法定量限在 0.1 μg/kg～1 μg/kg，回收率范圍在72%～106.4%之間，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10.1，所建立的方法能夠滿足檢測水產(chǎn)品中上述4種獸藥殘留的需要。

應(yīng)用建立的檢測方法對市售鮮活魚蝦進(jìn)行隨機(jī)抽檢結(jié)果顯示，氯霉素和硝基呋喃類藥物等藥物已基本檢測不到，說明在徐州這些禁用藥物管控良好。限量使用藥物恩諾沙星雖然在水產(chǎn)養(yǎng)殖中普遍使用，但絕大多數(shù)能嚴(yán)格遵守休藥期規(guī)定，基本能保障居民食品安全。但是廉價、高效、易得的工業(yè)染料孔雀石綠仍在一定范圍和程度上使用，這為相關(guān)監(jiān)督管理部門有針對性加強(qiáng)監(jiān)管提供參考。

4 討論

4.1 呋喃西林代謝物檢測的科學(xué)性

沼蝦和羅氏蝦等甲殼類水產(chǎn)品體內(nèi)含有內(nèi)源性的呋喃西林代謝物氨基脲已得到證實，在實際檢測中也得到驗證。但國內(nèi)食品監(jiān)管部門和出入境檢驗檢疫等部門對該類產(chǎn)品中呋喃西林及其代謝物仍規(guī)定為不得檢出，這勢必會存在大量假陽性的問題，嚴(yán)重影響監(jiān)督抽檢的結(jié)果判定，如何減少內(nèi)源性氨基脲對檢測結(jié)果的影響值得引起科研檢測機(jī)構(gòu)關(guān)注，如何科學(xué)設(shè)置檢測限也值得引起相關(guān)監(jiān)督部門的重視。

4.2 孔雀石綠使用管控的加強(qiáng)

孔雀石綠是價格極其低廉又極易購得的化工品，在水產(chǎn)養(yǎng)殖和運輸中防治疾病效果非常好，且簡單易操作，因此雖經(jīng)十多年管控，但仍屢禁不止。這需要國家相關(guān)監(jiān)管部門加大監(jiān)督抽檢范圍和頻次，加嚴(yán)處罰措施和力度。

4.3 恩諾沙星使用管控的展望

恩諾沙星是喹諾酮類化合物第三代產(chǎn)品-氟喹諾酮類藥物的一種，大量研究結(jié)果證實恩諾沙星具有高度的抗菌活性，幾乎對嗜水氣單胞菌、熒光假單胞菌、弧菌、鏈球菌、巴德氏菌、愛德華氏菌等水生動物所有的病原菌都表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗菌作用[10]。喹諾酮類藥物具有對革蘭氏陽性菌和革蘭氏陰性菌均有效，尤其是對革蘭氏陰性菌作用強(qiáng)的特點，水生動物細(xì)菌性疾病大多為革蘭氏陰性菌，表明恩諾沙星適合水生動物細(xì)菌性疾病的防治。

恩諾沙星在動物體內(nèi)代謝為環(huán)丙沙星，環(huán)丙沙星曾是一種人獸共用藥，人類如長期攝入含有環(huán)丙沙星的食物，會導(dǎo)致致病菌對環(huán)丙沙星的抗藥性，因此環(huán)丙沙星已經(jīng)被列為禁用獸藥和漁藥。恩諾沙星在水產(chǎn)動物體內(nèi)有較長的半衰期，且其代謝產(chǎn)物環(huán)丙沙星對人體危害較大，目前國際趨勢為使用于人體之抑菌劑應(yīng)避免使用于畜禽動物及水產(chǎn)動物，以避免因用藥殘留而衍生細(xì)菌產(chǎn)生抗藥性的問題。因此，恩諾沙星被列為禁用漁藥只是時間問題[11]。