SSR標(biāo)記技術(shù)在中藥鑒定中的應(yīng)用

劉培培 羅光明，2 柴華文 張俊逸 朱梓豪 王得運(yùn)

（1. 江西中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，南昌 330004；2. 江西中醫(yī)藥大學(xué)中藥資源與民族藥研究中心，南昌 330004）

中藥是我國珍貴的瑰寶，幾千年來，在人們的養(yǎng)生、保健以及治療疾病方面發(fā)揮著不可替代的作用。中藥材種類繁多，使用歷史悠久，來源復(fù)雜。有些藥材全國各地都可種植，然道地藥材療效最佳。一些中藥的近緣種屬極易混淆，甚至不同中藥的藥用部位極其相似，仿品和偽品也充斥其中，鑒定方法不完善導(dǎo)致多起安全性事件，給中藥臨床應(yīng)用帶來極大挑戰(zhàn)［1］。中藥材是藥效的基礎(chǔ)，因此，必須不斷發(fā)展和完善中藥的鑒定方法，確保藥材的質(zhì)量。中藥的鑒定方法從中藥藥師憑借其長期積累的經(jīng)驗(yàn)［2-3］對(duì)中藥形狀、顏色、氣味及重量等進(jìn)行鑒定，到通過顯微鏡觀察藥材的結(jié)構(gòu)、組織特征等分析其特性，以及一系列的物理化學(xué)方法對(duì)其進(jìn)行定性定量分析，如高效液相色譜法、紅外光譜鑒定法、高效液相色譜-質(zhì)譜分析法等，大大提高了鑒定的準(zhǔn)確性，但仍存在一定的局限［4］。隨著計(jì)算機(jī)技術(shù)和生物技術(shù)的不斷發(fā)展，以DNA分子遺傳標(biāo)記技術(shù)、細(xì)胞生物學(xué)技術(shù)、圖像分析技術(shù)及聚類分析技術(shù)等為標(biāo)志的中藥鑒定新技術(shù)新方法應(yīng)運(yùn)而生，如隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（Random amplified polymorphic DNA，RAPD）、擴(kuò)增片段長度多態(tài)性（Amplified fragment length polymorphism，AFLP）、限制性片段長度多態(tài)性（Restriction fragment length polymorphism，RFLP）分子標(biāo)記［5］，簡單重復(fù)序列（Simple sequence repeats，SSR）等技術(shù)，為中藥鑒定技術(shù)的發(fā)展創(chuàng)造了新的發(fā)展空間［6-7］。DNA分子標(biāo)記技術(shù)具有微量、快速的特點(diǎn)［8］，更合適沒有詳細(xì)背景材料的中藥材的鑒別。分子標(biāo)記具有特異性高、重復(fù)性好、結(jié)果可靠、操作簡單，對(duì)DNA要求不高等特點(diǎn)［9］。隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，一次就可獲得大量的SSR分子標(biāo)記，為藥用植物種質(zhì)鑒定、遺傳圖譜構(gòu)建、遺傳多樣性分析提供了有力的工具。本文是在查閱文獻(xiàn)的基礎(chǔ)上，歸納總結(jié)了SSR標(biāo)記技術(shù)在中藥鑒定中的應(yīng)用，旨為該技術(shù)在中藥材中的進(jìn)一步研究提供理論參考。

1 SSR分子標(biāo)記

新一代測序技術(shù)（Next-generation sequencing，NGS）的發(fā)展為分子標(biāo)記技術(shù)提供了一個(gè)新的平臺(tái)［10］，如微衛(wèi)星（Microsatellite）和微衛(wèi)星標(biāo)記（Microsatellite marker）。微衛(wèi)星標(biāo)記為分子標(biāo)記的一種，微衛(wèi)星標(biāo)記又稱為短串聯(lián)重復(fù)序列（Short tandem repeat，STR）或簡單重復(fù)序列（SSR）［11］，指的是基因組中由 1-6 個(gè)核苷酸，如（AT）n、（AC）n、（GA）n、（AAG）n、（AAT）n、（CATG）n等組成的基本單位重復(fù)多次構(gòu)成的一段DNA［12］。微衛(wèi)星標(biāo)記是根據(jù)微衛(wèi)星標(biāo)記兩側(cè)的已知序列設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物獲得擴(kuò)增產(chǎn)物的分子標(biāo)記，擴(kuò)增得到的是包含微衛(wèi)星標(biāo)記序列在內(nèi)的片段，反映的是不同微衛(wèi)星標(biāo)記重復(fù)次數(shù)導(dǎo)致的多態(tài)性，為共顯性標(biāo)記［13］。由于微衛(wèi)星標(biāo)記位點(diǎn)兩端的序列保守性強(qiáng)，因此可以通過設(shè)計(jì)特異性引物來檢測位點(diǎn)的多態(tài)性［14］。根據(jù)微衛(wèi)星標(biāo)記的來源可將其分為基因組微衛(wèi)星標(biāo)記和表達(dá)序列標(biāo)簽（Expressed sequence tag，EST）-微衛(wèi)星標(biāo)記（Simple Sequence Repeats，SSR）［15］。近年從表達(dá)序列標(biāo)簽中開發(fā)出微衛(wèi)星標(biāo)記（EST-SSR）可以充分利用現(xiàn)有序列標(biāo)簽數(shù)據(jù)，很大程度上降低微衛(wèi)星標(biāo)記引物開發(fā)的難度［16］，因其具有較好通用性且開發(fā)方法簡單、成本低等特點(diǎn)應(yīng)用更為廣泛。

SSR分子標(biāo)記具有多態(tài)性高、共顯性、易檢測、重復(fù)性高、數(shù)量豐富及對(duì)基因組有很好的覆蓋性等特點(diǎn)［17］。此外，SSR標(biāo)記技術(shù)需要樣品量少，對(duì)物種損壞較少，通過非損傷取樣法即可獲得的大量遺傳信息，是研究珍稀瀕危植物的種群遺傳多樣性及保護(hù)種群資源的有力工具［18］。

微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)憑借其突出的優(yōu)越性，廣泛應(yīng)用于植物學(xué)和農(nóng)學(xué)領(lǐng)域中系譜分析與進(jìn)化、遺傳圖譜構(gòu)建、基因定位克隆、品種鑒定等方面［19-20］。目前在農(nóng)作物及經(jīng)濟(jì)作物中應(yīng)用微衛(wèi)星標(biāo)記進(jìn)行品種鑒定的研究較為多見，如大麥、高粱和陸地棉等。微衛(wèi)星標(biāo)記法鑒定品種技術(shù)規(guī)程已作為農(nóng)業(yè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)供參考使用［21］。國際植物品種權(quán)保護(hù)組織將微衛(wèi)星標(biāo)記指定為構(gòu)建DNA指紋數(shù)據(jù)庫的標(biāo)記方法之一，我國還根據(jù)微衛(wèi)星標(biāo)記指紋技術(shù)建立了玉米和水稻品種鑒定的2個(gè)行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)［22］。SSR還用于人類基因作圖和目的基因篩選、法醫(yī)學(xué)個(gè)體識(shí)別和親權(quán)鑒定、器官移植、人類學(xué)、民族學(xué)及考古學(xué)等方面的研究［23］。這表明微衛(wèi)星標(biāo)記技術(shù)有其獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。

目前，SSR標(biāo)記技術(shù)在中藥中的應(yīng)用雖遠(yuǎn)遜于在植物學(xué)和農(nóng)學(xué)領(lǐng)域，但有許多學(xué)者利用微衛(wèi)星分子標(biāo)記法對(duì)中藥材進(jìn)行分析研究，如對(duì)中藥的種質(zhì)鑒定與分析、親緣關(guān)系及遺傳多樣性分析及構(gòu)建遺傳連鎖圖譜等［24］。

2 SSR標(biāo)記技術(shù)在中藥鑒定中的應(yīng)用

2.1 偽品的鑒定

SSR標(biāo)記可用于鑒定中藥材偽品。劉艷麗［25］以豆科中藥黃芪為材料，利用SSR分子標(biāo)記法對(duì)黃芪及其7種常見偽品進(jìn)行了鑒別。其借用同科植物大豆的10對(duì)SSR引物，其中6對(duì)引物的結(jié)果顯示黃芪及7種偽品分別產(chǎn)生了長度不同、 等位基因數(shù)相異的SSR序列，這種SSR位點(diǎn)的長度多態(tài)性以及它們各自不同的等位基因數(shù)目顯示了它們的差異。蔣超等［26］通過EST來源的SSR引物jp.ssr4、jp.ssr64和jp.ssr65準(zhǔn)確鑒別金銀花的原植物忍冬，可區(qū)分其和變種紅白忍冬及偽品山銀花的來源植物紅腺忍冬、灰氈毛忍冬、華南忍冬及黃褐毛忍冬。這表明SSR標(biāo)記法應(yīng)用于中藥鑒別具有較好的可行性。

2.2 品種的鑒定

SSR標(biāo)記可用于中藥材品種的鑒定。張利民等［27］在轉(zhuǎn)錄組測序的基礎(chǔ)上，分析蒙古黃芪轉(zhuǎn)錄組序列中的SSR位點(diǎn)，設(shè)計(jì)引物并對(duì)膜莢黃芪和蒙古黃芪進(jìn)行鑒定。李清等［28］通過生物信息學(xué)手段對(duì)金釵石斛轉(zhuǎn)錄組序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)搜索、分析，并設(shè)計(jì)出SSR特異性引物。結(jié)果表明，金釵石斛轉(zhuǎn)錄組測序產(chǎn)生的Unigenes信息可作為開發(fā)SSR標(biāo)記的有效來源，其中的SSR位點(diǎn)出現(xiàn)密度大、類型豐富、多態(tài)性潛能高，在金釵石斛及其近緣種的分子鑒定、遺傳多樣性與分子育種等方面具有較好的應(yīng)用前景。厚毅清等［29］通過SSR分子標(biāo)記技術(shù)，篩選用于黃芪與紅芪鑒定的核心引物，通過聚類分析結(jié)果確認(rèn)引物的有效性和準(zhǔn)確性，標(biāo)記核心引物的特異性位點(diǎn)，生成鑒定圖譜代碼，為黃芪與紅芪的鑒定及遺傳分析提供依據(jù)。尹躍等［30］以16個(gè)枸杞品種為材料，利用SSR標(biāo)記構(gòu)建枸杞分子身份證，為枸杞品種鑒定和保護(hù)提供參考。陳子易等［31］挑選引物能擴(kuò)增出可區(qū)分人參和西洋參的特異性片段，用于鑒別人參和西洋參。

2.3 種質(zhì)的鑒定與分子標(biāo)記輔助育種

SSR技術(shù)可用于中藥材種質(zhì)的鑒定。王曉麗等［32］采用AFLP、SSR及其聚類樹對(duì)24份不同天麻種質(zhì)材料的遺傳多樣性等進(jìn)行分析，并對(duì)AFLP和SSR這2種分子標(biāo)記進(jìn)行比較，結(jié)果表明2種分子標(biāo)記將天麻變型種質(zhì)聚類劃分的結(jié)果相近，但SSR能將野生天麻聚在一類。這說明，天麻不同種質(zhì)AFLP多態(tài)性高于天麻SSR，但SSR對(duì)野生天麻有較強(qiáng)的區(qū)分能力。吳素瑞等［33］利用簡單重復(fù)序列分子標(biāo)記鑒別柴胡栽培種質(zhì)的方法，初步形成了可鑒別選育品系的SSR特征譜帶數(shù)據(jù)。依據(jù)遺傳距離構(gòu)建聚類樹圖，篩選出多態(tài)性高的引物，獲得了試驗(yàn)種質(zhì)的SSR特征譜帶數(shù)據(jù)，將不同品系的柴胡種質(zhì)各獨(dú)自聚為一類，篩選出的引物對(duì)和建立的檢測方法可供柴胡種質(zhì)鑒別參考使用。鄭紀(jì)偉等［34］基于高通量熒光 SSR 標(biāo)記基因分型技術(shù)構(gòu)建了 16 份含笑種質(zhì)的指紋圖譜，用優(yōu)選的 4 對(duì)核心引物區(qū)分 了16份含笑種質(zhì)。郭麗麗等［35］利用 22個(gè)自主開發(fā)的SSR標(biāo)記對(duì)來自 5個(gè)品種群的 30個(gè)牡丹種質(zhì)多態(tài)性及其親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，表明該標(biāo)記具有多態(tài)性，能有效鑒定牡丹種質(zhì)資源的遺傳多樣性，研究結(jié)果可為探究牡丹遺傳多樣性和牡丹資源保存提供理論依據(jù)。

SSR標(biāo)記可用于中藥材輔助育種。代嬌等［36］通過厚樸高通量轉(zhuǎn)錄組測序獲得的Unigene序列進(jìn)行SSR位點(diǎn)挖掘、引物設(shè)計(jì)，挑選引物進(jìn)行PCR，對(duì)含有SSR的Unigene進(jìn)行功能分析發(fā)現(xiàn)，含SSR的Unigene與能量和氧化還原等代謝過程，以及RNA轉(zhuǎn)運(yùn)、剪接體和植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)等通路有關(guān)。厚樸高通量轉(zhuǎn)錄組序列的SSR位點(diǎn)具有類型豐富、特異性強(qiáng)和潛能高等特點(diǎn)，同時(shí)SSR序列的功能分析將為厚樸基因挖掘和分子標(biāo)記輔助育種提供有利的工具。李俊仁等［37］以穿心蓮轉(zhuǎn)錄組測序獲得的Unigene為對(duì)象，通過設(shè)計(jì)、篩選，獲得具有潛在多態(tài)性的SSR引物組合，有10對(duì)可以擴(kuò)增出與預(yù)期大小吻合的條帶。通過基因功能注釋發(fā)現(xiàn)，含SSR的Unigene主要與穿心蓮的基礎(chǔ)代謝功能相關(guān)。結(jié)果表明，穿心蓮轉(zhuǎn)錄組中SSR位點(diǎn)出現(xiàn)頻率高、類型豐富、多態(tài)性潛能較高，同時(shí)SSR序列的功能分析也為穿心蓮功能基因的定位研究和分子標(biāo)記輔助育種提供了有利參考。

2.4 地域來源鑒別

SSR標(biāo)記可用于中藥材的地域來源鑒定。袁燦等［38］對(duì)川芎根轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)獲得的Unigene進(jìn)行了SSR檢測，對(duì)檢測到的EST-SSR進(jìn)行特征分析，利用EST-SSR引物對(duì)34個(gè)川芎資源進(jìn)行遺傳多樣性分析，結(jié)果顯示收集的川芎資源多樣性較好，聚類顯示川芎資源分為兩大類，聚類結(jié)果表現(xiàn)出一定的地域性。王學(xué)勇等［39］對(duì)不同產(chǎn)地丹參樣本DNA模板的PCR篩選和條件優(yōu)化，建立最新EST-SSR分子標(biāo)記所選引物，所選引物對(duì)不同產(chǎn)地丹參居群的分子標(biāo)記出現(xiàn)了多態(tài)性。其建立的丹參最新EST-SSR分子標(biāo)記具有較高的覆蓋度和多態(tài)性，可用于不同產(chǎn)地丹參居群的遺傳變異分析。李敏等［40］提取4種白芍的DNA基因組，篩選隨機(jī)引物對(duì)浙白芍、亳白芍、山白芍和川白芍進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并聚類分析得到山白芍與亳白芍遺傳相似性系數(shù)最高而與浙白芍的遺傳相似性系數(shù)最低。其中篩選到浙江白芍、安徽白芍和山東白芍的分子鑒定標(biāo)記，經(jīng)克隆和測序后，可為白芍的特異性 PCR 鑒定的引物設(shè)計(jì)打下基礎(chǔ)。劉玉洋等［41］從槐葉決明轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫中通過遺傳聚類分析，將不同地區(qū)的樣品劃分為3類，通過SSR標(biāo)記鑒別出了從外觀上很難鑒別的槐葉決明和不同產(chǎn)地望江南的差異，發(fā)現(xiàn)槐葉決明、小決明和望江南種間，以及小決明和望江南種內(nèi)不同地理來源之間均存在較大遺傳差異，從而為槐葉決明和望江南的種質(zhì)資源分析鑒定提供依據(jù)。

2.5 遺傳多樣性的研究

遺傳多樣性分析結(jié)果是構(gòu)建中藥材DNA指紋圖譜及其DNA身份證的基礎(chǔ)。楊雯等［42］基于IlluminaMiSeq高通量測序平臺(tái)對(duì)虎耳草屬植物混合樣本進(jìn)行基因組測序，利用開發(fā)的SSR標(biāo)記對(duì)虎耳草屬25種植物進(jìn)行聚類分析，發(fā)現(xiàn)物種間關(guān)系與根據(jù)傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)特征分類的結(jié)果還是存在差異的。齊琳潔等［43］對(duì)不同產(chǎn)地的黃芩基因組序列進(jìn)行分析，篩選出擴(kuò)增產(chǎn)物穩(wěn)定性好，多態(tài)性及清晰度高的引物用于10個(gè)不同產(chǎn)地共50份黃芩材料的遺傳多樣性分析，表明黃芩具有較高的遺傳多樣性。林開勤［44-45］研究開發(fā)獲得15個(gè)多態(tài)性SSR標(biāo)記，并成功應(yīng)用SSR分子標(biāo)記探明貴州杜仲的遺傳多樣性與親緣關(guān)系，為杜仲的合理保護(hù)、種質(zhì)資源收集與遺傳改良提供理論依據(jù)。勵(lì)娜等［46］通過簡單重復(fù)序列分子標(biāo)記探討了28個(gè)雷公藤屬植物野生居群的遺傳多樣性和遺傳結(jié)構(gòu)。結(jié)果表明，雷公藤屬植物具有較高遺傳多樣性水平，植物居群間存在較高的遺傳分化。

3 小結(jié)與展望

分子標(biāo)記技術(shù)被用于藥用植物分類與中藥材的鑒定研究以來，受到DNA提取困難、測序費(fèi)用高昂等問題的困擾，但隨著研究的深入，高通量測序技術(shù)的飛速發(fā)展和測序成本的不斷降低，新一代高通量測序技術(shù)對(duì)中藥材全基因組范圍進(jìn)行測序，產(chǎn)生豐富的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，對(duì)分子標(biāo)記的發(fā)展產(chǎn)生了有力的推動(dòng)作用。SSR分子標(biāo)記已在物種鑒定、遺傳多樣性分析等方面發(fā)揮重要作用，說明分子標(biāo)記技術(shù)在中藥材物種、種質(zhì)資源，建立標(biāo)準(zhǔn)數(shù)據(jù)庫和分子身份證體系等方面的應(yīng)用，不僅有利于中藥材的質(zhì)量控制，還在中藥材種質(zhì)資源保護(hù)、評(píng)價(jià)與利用以及中藥材新品種選育等領(lǐng)域均能發(fā)揮重要的推動(dòng)作用。SSR除了作為一種分子標(biāo)記外，還具有功能上的意義，如在染色體組織上的影響，對(duì)基因活性、DNA復(fù)制、細(xì)胞周期和糾錯(cuò)修復(fù)系統(tǒng)的調(diào)節(jié)、基因功能分析等。

如今，隨著對(duì)中藥材的需求日益增加，對(duì)其中藥材鑒定的要求也會(huì)日益提高。中藥鑒定學(xué)作為中藥研究、生產(chǎn)制造、臨床應(yīng)用等的前提保障，其對(duì)中醫(yī)藥行業(yè)的健康、持續(xù)、穩(wěn)定發(fā)展具有重要意義。每一種藥材鑒定方法都存在一定的局限性，要充分了解各種鑒定方法的優(yōu)勢(shì)并將其合理應(yīng)用，從而對(duì)現(xiàn)有的方法進(jìn)行合理的改進(jìn)和補(bǔ)充。值得強(qiáng)調(diào)的是，在引入新技術(shù)新方法的同時(shí)，不能拋棄傳統(tǒng)鑒別方法，將兩者合理的結(jié)合使用，才能使中藥鑒定學(xué)得到更合理和長遠(yuǎn)的發(fā)展。目前，分子標(biāo)記技術(shù)可以對(duì)藥材的真?zhèn)?、產(chǎn)地來源、年限、成藥等進(jìn)行鑒別，但藥材品質(zhì)的優(yōu)劣還要依靠其他科學(xué)儀器、方法或者人工鑒別等新方法判斷。中藥分子鑒別準(zhǔn)確、快速，但因?yàn)樵O(shè)備技術(shù)等條件的限制，大多在實(shí)驗(yàn)室中完成。若能進(jìn)一步擴(kuò)大該技術(shù)的應(yīng)用范圍，如藥材流通市場、藥企、藥房等，那么中藥材的準(zhǔn)確鑒定將會(huì)更加便捷。針對(duì)這一情況，袁媛等［47］提出了中藥分子鑒別現(xiàn)場運(yùn)用的策略，根據(jù)具體檢測對(duì)象的實(shí)際情況，為各個(gè)環(huán)節(jié)上選擇最優(yōu)技術(shù)，搭建最適技術(shù)體系，用于中藥快速、現(xiàn)場鑒別。隨著系統(tǒng)生物基因組科學(xué)、代謝組學(xué)及蛋白質(zhì)組學(xué)為基礎(chǔ)的學(xué)科的不斷完善和發(fā)展，充分運(yùn)用現(xiàn)代計(jì)算機(jī)科學(xué)技術(shù)、仿生技術(shù)及顯微技術(shù)等為輔助，中藥鑒定技術(shù)發(fā)展將朝著更加快速、精準(zhǔn)、便捷的方向發(fā)展。