纖維素降解酶研究進展

王曉濤，魏佩玲，胡 波，宮 平（新疆畜牧科學院，烏魯木齊 830000）

當前地球上面臨著環(huán)境、食品、能源等多方危機，刺激了社會對可再生資源的利用需求。纖維素是一種廣泛存在的可再生生物資源，主要來源于種植園的農作物，此外來自谷物和豆類油性種子的木質纖維素殘渣數(shù)量也十分豐富[1]。這些不能被動物直接利用的木質纖維素如果能夠轉化為可被利用的物質，將對于工業(yè)和農業(yè)經濟的發(fā)展有極大的價值。目前物理法、化學法和生物學方法是主要的纖維素原料轉化生產方式，物理法和化學法由于對環(huán)境有污染且生產工藝復雜、成本相對高昂而在實際應用中有所限制。所以使用生物法—即利用纖維素降解酶是當前利用纖維素資源的研究熱點。

迄今為止，纖維素酶在商用上已超過30年，具有廣泛的來源，在工業(yè)上其主要來源是具有降解木質纖維素能力的微生物。雖然纖維素酶的降解機制尚未完全明確，但纖維素酶已在各個行業(yè)廣泛應用并被認可。本文總結了目前纖維素酶的來源、分類、降解機制以及活力測定方面的研究結果，在此基礎上探討了纖維素酶在生產應用中需要解決的問題，并且對纖維素酶的實際應用潛力進行了總結和展望，期望為進一步探索高效、經濟、環(huán)保的纖維素酶提供研究依據(jù)。

1 纖維素酶的來源

纖維素酶的來源廣泛，目前在反芻動物瘤胃、動物腸道、植物和昆蟲體內都有獲得纖維素酶的報道[2]，但由于這些來源的提取成本和技術等問題鮮少被研究并運用到實際生產中，因此，目前仍是以多種能產生纖維素降解酶的微生物為研究重點，其中包括真菌、細菌、放線菌。其中放線菌由于纖維素酶的產量極低而很少被研究。由于真菌和細菌可產生能夠廣泛溶解結晶纖維素的高活性胞外纖維素酶，并且有的真菌和細菌能同時產生降解夠結晶纖維素所需的全部三種纖維素酶[3]，因此而被廣泛研究。雖然目前分離鑒定了多種能產生纖維素降解酶的菌株，但其中只有很少菌株能產生達到工業(yè)應用要求的酶活的纖維素酶[4]。

1.1 真菌

相對細菌而言，真菌能夠分泌更多的胞外纖維素酶到培養(yǎng)基中并且對酶液進行分離純化也更容易，因此對于工業(yè)生產來說更易于操作。此外真菌的糖苷纖維素酶沒有細菌復雜，所以可以通過基因重組在增殖迅速的大腸桿菌上表達來提高產酶效率。目前商用的纖維素酶大多來自一些瘤胃厭氧菌、里氏木霉以及白腐菌等擔子菌。里氏木霉因其能產生酶譜全且活力高的纖維素酶，所以50多年來對該真菌產纖維素酶能力的研究更為完善。但有研究表明大多數(shù)真菌所產生的纖維素酶為酸性，這類酶對于堿性環(huán)境不耐受且處于高溫環(huán)境下會失活。因此，對于這些酸性纖維素酶應當進行分子改造，提高其適應pH范圍。

1.2 細菌

當前普遍認為真菌是更好的纖維素酶生產者，這可能與很少直接研究比較細菌來源和真菌來源的纖維素酶有關，但兩者其實各有其實際應用價值。由于真菌普遍需要氧氣才能生長且所產基本為耐酸纖維素降解酶，因此在一些含氧較少或需要中性或堿性纖維素降解酶的工業(yè)生產過程中，芽孢桿菌、乳酸桿菌等細菌來源的纖維素酶的研究在生產應用上就具有較大的經濟價值和現(xiàn)實意義。如最近發(fā)現(xiàn)貝萊斯芽孢桿菌ZY-1-1基因組含有纖維素和木聚糖酶降解基因，并且該菌株產這兩種酶能力很強[5]，來源于枯草芽孢桿菌BTN7A的β-1,3-1,4葡聚糖內切酶具有很強的酶活性[6]。

目前許多需氧菌和厭氧菌都被證明能產生纖維素酶，對此研究更多的是這兩者在生物降解時所表現(xiàn)的纖維素酶系統(tǒng)的差異。微生物所表現(xiàn)的纖維素酶的生產能力在溫度、pH和其他多種因素不同的情況下具有很大差異，這也提示了自然環(huán)境中纖維素酶的廣泛可得性，同時為將來利用這些不同來源不同性質的纖維素酶基因的優(yōu)化條件提供了研究基礎。

1.3 極端微生物

由于最近在利用纖維素降解的生物燃料和生物能源的生產過程中，需要根據(jù)特殊的工業(yè)需求進行不同的預處理，因此，對于產纖維素酶的微生物要求能夠能耐受極端的環(huán)境，如高溫，強酸強堿等。近年來在對極端微生物來源的纖維素降解酶的研究中也發(fā)現(xiàn)了很多能產纖維素酶的極端古細菌[7]。目前已有從諸如高山、極地、溫泉等極端的環(huán)境中分離出具有產纖維素酶能力的微生物。王繼蓮等從東帕米爾高原不倫口湖群濕地分離到一株低溫纖維素酶產生菌枯草芽孢桿菌BCL2[8]；王翀等從湖南周邊稻田中、易旻等從雞糞蘑菇渣高溫堆肥中分別分離到高溫纖維素酶產生菌芽孢桿菌[9,10]；黨佳佳等從遼河河口區(qū)蘆葦濕地分離出一株高產酶的耐鹽纖維素降解菌LHK-T3[11]。這些菌株的分離鑒定，為生產耐高溫、耐低溫和耐鹽纖維素酶提供了基礎。

真菌和細菌產生的纖維素酶在生產應用上各有優(yōu)缺點。真菌所產的胞外酶易于分離純化，其本身產酶率高且酶系較全面，但對環(huán)境適應性較差，更適合酸性條件下的工業(yè)應用。細菌產纖維素酶量少，且較少產生胞外酶，提純技術要求高，由于在紡織、洗滌劑等應用上，多數(shù)需要中性和堿性纖維素酶，因此細菌產生的纖維素酶有更好的商用價值，并且在飼料工業(yè)中，需要一些耐高溫的纖維素酶，因此極端細菌所產纖維素酶的潛力具有重要價值。

1.4 動物纖維素酶

研究者首次證明了蝸牛中存在內源性纖維素酶，而后從植物寄生的線蟲中獲得了一種內切β-1，4-葡聚糖酶的cDNA，進一步證實了動物體內內源性纖維素酶存在。目前認為環(huán)毛蚓、福壽螺、蝸牛、線蟲、白蟻、文蛤、鮑魚及天牛等物種體內都具有纖維素酶。 Watanabe等首次報道了白蟻纖維素酶的基因，證明動物有自身的纖維素內切酶[12]。Wang等在2003年首次發(fā)現(xiàn)了福壽螺腸道內具有多功能纖維素酶EGX[13]。王婷婷發(fā)現(xiàn)，文蛤內臟中存在完整的纖維素酶系，其中內切纖維素酶的活性較高，且酶活測定數(shù)據(jù)穩(wěn)定性良好[14]。陶志鵬以鮑魚為研究對象，從內臟中分離純化出一種纖維素酶，并運用分子生物學手段克隆得到編碼纖維素酶的全序列[15]。但目前從動物內臟獲得的纖維素酶活性不一，因此，今后的主要研究還要繼續(xù)尋找具有較高活性纖維素酶的生物物種。

2 纖維素酶的分類

纖維素酶是一種包括多種水解酶的復雜酶系，現(xiàn)代研究認為其主要包括3種作用各異的酶組分：

（1）內切葡萄糖苷酶（endo-1,4-β-glucanase，EG 或 CMCase）：它能水隨機水解 β-1,4 糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截斷，其作用的是融解的纖維素衍生物或者膨脹和部分降解的纖維素,但不能作用于結晶纖維素。主要產物是纖維素寡糖,纖維二糖等。

（2）外切葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-glucanase）：這類酶在天然纖維素的降解過程中起主導作用,主要作用于纖維素分子末端，水解β-1,4糖苷鍵，每次酶切下一個纖維二糖單位，所以也稱其為纖維二糖水解酶。

（3）β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase）：它的主要作用是將纖維二糖和短的纖維寡糖降解為葡萄糖，該類酶的專一性比較差。

3 降解機制

關于纖維素降解的機制尚不明確。最早提出的C1-Cx假說，其認為必須由不同類型的纖維素酶依一定的步驟作用于纖維素才能完成降解過程。此外其他被提出的還有順序作用假說、短纖維形成假說等。但目前最被認可的是協(xié)同作用理論，自20世紀70年代首次被提出，目前所知的主要有4種典型協(xié)同作用[16]：（1）內切和外切葡聚糖纖維素酶之間的協(xié)同作用；（2）底物中還原性和非還原性末端的外切葡聚糖纖維素酶之間的協(xié)同作用；（3）內切或者外切葡聚糖纖維素酶與內切葡聚糖纖維素酶之間的協(xié)同作用；（4）β-葡萄糖苷酶與其他纖維素酶之間的協(xié)同作用。但也有研究表明不同的纖維材料中結晶區(qū)和非結晶區(qū)的比例不同，并且其他組分和物理結構上均有差異，所以水解時需要的纖維素酶比例也會不同[17,18]。

迄今為止，人們對纖維素酶分類和作用機理的認識程度表明，高效利用纖維素的關鍵在于正確結合每個纖維素酶活性作用關系以及提高其生產水平，任何一種纖維素酶在工業(yè)生產上都具有相應利用價值。

4 纖維素酶的活性測定

不同類型纖維素酶的活力測定都有其特定的測定方式。目前有單獨酶活力和總酶活力的測定方法[19,20]。但目前對纖維素酶活性測定沒有統(tǒng)一標準，并且評價方法不規(guī)范[21]。對于測定酶活力的條件也尚未有統(tǒng)一的標準。

目前國內測定纖維素降解酶方法是以纖維素酶水解纖維素產生的還原糖量作為酶活力標準，常利用3,5-二硝基水楊酸（DNS）來進行測定。但DNS法的結果可能會受其試劑新鮮度、反應條件、濾紙裁剪方法等影響，對所測酶活力值有一定的影響，DNS試劑用量在1～3 mL范圍時所測得的酶活力值與其用量成反比[22]，邵錦挺等人對微型化DNS法進行了研究，提高了DNS測定方法的準確性[23]。

羧甲基纖維素鈉糖化法常用于內切葡聚糖酶的活力測定。但生產廠家的不同也會對酶活力結果產生影響，顧賽紅等人[24]通過對此的研究表明酶活力測定的靈敏度與羧甲基纖維素鈉的品質有關，其濃度最適范圍是在0.1～0.4吸光度。外切葡聚糖酶的活力測定有兩種不同的底物，分別為對硝基酚纖維二糖和微晶纖維素，前者有一定特異性，但需結合抑制劑來抑制β-葡萄糖苷酶的進一步水解，后者則需要先進行復雜而高昂的提純步驟后才能確實反映其單一酶活力。β-葡萄糖苷酶的活力測定一般可采用分光光度法、熒光法和比色法[25]，根據(jù)方法不同其底物也相應不同，但一般選用纖維二糖作為底物。目前，總纖維素酶的活力測定一般采用濾紙片降解法，將具有中等聚合度與結晶度的濾紙選作反應底物，測定底物產生量。但由于尚未有濾紙質量的嚴格標準，其結構、結晶度、淀粉含量等會因廠家不同而存在差異，對最終特定條件下單位時間降解所生成的單糖量結果有所影響。國際上曾將Whatman1號濾紙作為統(tǒng)一底物，但國內仍未統(tǒng)一[26]。對高活性纖維素酶的初篩階段常采用濾紙崩解法和透明圈法。濾紙片崩解法，即將濾紙片作為底物，加入纖維素酶后，計算纖維素酶將濾紙片完全降解所需要的時間。時間越短，纖維素酶活性越高。反之，活性越低。目前該方法也得到改良，通過測定纖維素酶酶解產物中葡萄糖的含量，準確地計算出纖維素酶的活性。雖然方法精準，但是耗時長[27]。透明圈法中透明圈和菌落直徑的比值作為相對酶活的大小。但其受不同溫度、時間、pH、底物濃度、碳氮比例、離子濃度、表面活性因子等條件的影響，所以所觀察到的結果僅能作為其存在纖維素酶或可利用纖維素的初步判斷依據(jù)[28]。纖維素酶活測定中對于酶活定義以及針對不同酶活力測定的底物、實驗材料和實驗步驟的統(tǒng)一對于橫向比較目前已有的纖維素酶降解能力以及對于未來篩選和優(yōu)化高酶活的纖維素酶都具有重大價值。

5 基因工程技術生產纖維素酶

近年來也有許多相關研究嘗試利用生物工程技術將纖維素降解微生物的酶基因在大腸桿菌及釀酒酵母上表達以獲取活性更高、產率更大、酶系更完整或具有特殊活性的纖維素酶。研究報道，利用大腸桿菌BL21（DE3）成功表達出了融合纖維素酶Cel42-Cel22[29]和內切β-1,4-葡聚糖酶基因[30]；利用乳酸菌表達來源于多粘類芽孢桿菌β-葡萄糖苷酶基因bglA、bglB及內切β-葡聚糖酶基因[31]；利用畢赤酵母表達Endo2基因獲得一種新型耐高溫內切葡聚糖基因[32]。但利用基因工程技術表達出來的酶數(shù)量少，活性不定，在工業(yè)生產上還要進一步優(yōu)化菌株培養(yǎng)條件和產酶條件。

6 應用與展望

纖維素酶目前被廣泛作為降解纖維素的環(huán)境友好型生物酶類應用于各個領域，特別是在紡織、造紙、畜牧、食品、能源等方面具有極大的市場需求量。最初纖維素酶被應用于紡織工業(yè)中來調整織物的特性和品質以符合人們需求[33]。在造紙工業(yè)中則被用以處理紙張纖維成紙性能、改善紙漿性能以及將廢紙脫墨以便循環(huán)利用[34]。酸性纖維素酶在畜牧行業(yè)中利用較為廣泛，是目前研究重點。飼料中添加纖維素酶可以提高飼料消化利用率，提高飼料營養(yǎng)價值，并且能夠預防和治療一些家畜胃腸疾病[35,36]。在食品工業(yè)中主要被應用于發(fā)酵處理食品，提高加工果蔬汁和酒時的產出率，并且也被應用于食醋和醬油的釀制[37]。其他有所報道的應用有：在結合纖維素酶處理煙草提高其品質，提高人參有效成分提取率，在洗滌劑中應用時能在去污的同時對織物有增色和柔化的效果，此外在石油工業(yè)的洗井和植物遺傳轉化育種方面的應用也有報道。而在能源和環(huán)境保護方面，目前經纖維素酶對自然界廣泛存在的纖維素進行生物轉化所得的生物乙醇是被普遍看好的新型燃料，目前正在積極探索其在能源生產領域方面的研究。因此，纖維素酶在工業(yè)和農業(yè)上都是具有市場潛力的酶。

由于生產加工工藝和生產效率等多方面的問題，目前纖維素酶在實際應用仍有很多問題函待解決。當務之急是更深入研究相關纖維素酶的作用機制，調整不同組分比例以適應不同工業(yè)應用需求，統(tǒng)一酶活性測定標準并開發(fā)和優(yōu)化不同環(huán)境下具有高酶活的纖維素酶，改善當前的生產技術水平降低生產成本，以滿足市場對可持續(xù)發(fā)展的新型酶制劑的需求。