中和白細(xì)胞介素17對博來霉素誘導(dǎo)小鼠肺纖維化的干預(yù)作用*

宋桂芹，馬立飛，趙鐵軍，張效云

（河北北方學(xué)院 1.生物化學(xué)教研室，2.生命科學(xué)中心，河北 張家口 075000）

肺纖維化是一種慢性、進(jìn)展性的肺間質(zhì)性疾病，以彌漫性肺泡炎、成纖維細(xì)胞大量病理性增生，以及細(xì)胞外異常沉積為主要病理特征。其對人類健康危害極大，近年來發(fā)病呈上升趨勢，是大多數(shù)間質(zhì)性肺疾病的最終病理結(jié)果。盡管近幾年在闡明肺纖維化的病理生理學(xué)方面研究取得了顯著的進(jìn)展，同時人們也在細(xì)胞和分子水平加深了對肺纖維化機(jī)制的認(rèn)識，但是在臨床上仍缺乏有效的治療方法，病死率高，預(yù)后極差[1]，因此進(jìn)一步探索其發(fā)病機(jī)制和拓展其治療策略具有重要的理論和實際意義。

白細(xì)胞介素17（interleukin-17, IL-17）是主要由活化的CD+T細(xì)胞亞群TH17細(xì)胞生成的炎癥細(xì)胞因子[2]。IL-17家族中至少存在6個成員，即IL-17A到IL-17F，其中IL-17A最早被發(fā)現(xiàn)且作用最廣泛[3]。IL-17A具有很強(qiáng)的募集粒細(xì)胞及促進(jìn)多種炎癥細(xì)胞因子合成并釋放的作用，如IL-6、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallo proteinases, MMPs）等，同時具有協(xié)同炎癥因子擴(kuò)大炎癥效應(yīng)的作用，與機(jī)體的免疫性疾病、炎癥及腫瘤等有關(guān)[4]。本研究以博來霉素（Bleomycin,BLM）誘導(dǎo)肺纖維化小鼠為模型，通過檢測中和IL-17A后支氣管肺泡灌洗液（bronchoalveolar lavage fluid,BALF）中炎癥細(xì)胞和IL-1β、IL-10、IL-17A、γ干擾素（Interferon-γ, IFN-γ）4種細(xì)胞因子，以及羥脯氨酸（Hydroxyprine, HYP）、丙二醛（Malonaldehyde,MDA）、活性氧（reactive oxygen species, ROS）含量在肺纖維化過程中的變化來評價中和IL-17A對肺纖維化過程的干預(yù)作用，為進(jìn)一步探索肺纖維化的發(fā)生機(jī)制及臨床治療提供新的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

小鼠C57BL/6 96只，SPF/VAF級，雌性，6～8周齡，體重（17±1）g，購自北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部，許可證號分別為SCXK-2012-0004和SCXK-2012-0001。標(biāo)記動物后分籠飼養(yǎng)，溫度18～24℃，光暗周期交替。

1.2 主要藥品與試劑

BLM購自日本化藥株式會社（批號640110），HYP、ROS及MDA試劑盒購自南京建成生物研究所，IL-17A中和抗體和同型抗體IgG2A購自美國R & D System公司，IL-1β、IL-10、IL-17A、IFN-γ酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒購自美國eBioscience公司。

1.3 主要儀器

普通光學(xué)顯微鏡、熒光酶標(biāo)儀、722分光光度計、小鼠固定操作臺、胰島素注射器、直型靜脈滯留針、載玻片均由河北北方學(xué)院生物化學(xué)教研室提供。

1.4 方法

1.4.1 動物分組 96只實驗小鼠隨機(jī)分為4組，分別為抗體干預(yù)組、同型抗體對照組（IgG2A組）、博來霉素組（BLM組）、正常對照組（NC組），每組24只。

1.4.2 肺纖維化模型復(fù)制及處置 小鼠稱體重后，用3.5%水合氯醛注射液腹腔麻醉（0.1 ml/10 g體重），向抗體干預(yù)組、IgG2A組、BLM組小鼠的氣管內(nèi)注入生理鹽水溶解的BLM（5 mg/kg），向NC組小鼠注入等量生理鹽水。于注射BLM后的第4、9、14、19和22天抗體干預(yù)組尾靜脈注射IL-17A中和抗體（400 μg/kg），IgG2A組尾靜脈注射IgG2A抗體（400 μg/kg），BLM組和NC組則給予等量生理鹽水。分別于飼養(yǎng)的第7、14和28天將4組小鼠分批處死，取BALF涂片進(jìn)行細(xì)胞計數(shù)；通過試劑盒檢測IL-1β、IL-10、IL-17A、IFN-γ的含量變化；留取肺組織置于液氮-70℃冷凍保存，用于HYP、MDA及ROS含量的檢測。

1.4.3 BALF的制備及涂片 分別于復(fù)制模型后第7、14和28天從每組中隨機(jī)選取6只小鼠，摘除眼球取血，處死，氣管插管，PBS 1 ml灌洗肺組織2次，輕輕按摩，收獲BALF。將獲得的BALF 在4℃、1 400 r/min離心10 min，分離上清液，用于細(xì)胞因子檢測。用100 μl PBS重懸沉淀，充入計數(shù)池在光學(xué)顯微鏡下計數(shù)細(xì)胞總數(shù)，涂片行瑞氏染色并在油鏡下細(xì)胞分類計數(shù)，分別計數(shù)淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞（＞200個有核細(xì)胞 /片）。

1.4.4 BALF中 IL-1β、IL-10、IL-17A、IFN-γ 的測定 按IL-1β、IL-10、IL-17A、IFN-γ ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算樣本中IL-1β、IL-10、IL-17A、IFN-γ的含量。

1.4.5 肺組織ROS、HYP及MDA的測定 參照文獻(xiàn)[5]制備10%的肺組織勻漿液，低溫離心取上清液，嚴(yán)格按照試劑盒說明書行肺組織ROS、HYP及MDA的測定。

1.4.6 小鼠肺組織病理學(xué)評價 復(fù)制模型后，第28天處死4組剩余存活小鼠，并分別取右肺下葉于4%多聚甲醛中固定，經(jīng)脫水、浸蠟和包埋后制作厚度5 μm石蠟切片，行Masson染色，參照SZAPIEL等[6]的方法，在光學(xué)顯微鏡下觀察肺組織病理學(xué)改變。肺纖維化程度的評定標(biāo)準(zhǔn)：0級，無纖維化；1級，輕度纖維化，且面積＜20%全肺；2級，中度纖維化，且面積占20%～50%全肺；3級，重度纖維化，且面積＞50%全肺，肺泡結(jié)構(gòu)非常紊亂。

1.5 統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)分析采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，各組數(shù)據(jù)采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠的一般情況

NC組小鼠精神狀態(tài)均良好，飲食和飲水正常，體重有不同程度的上升，無小鼠死亡。BLM組、IgG2A組和抗體干預(yù)組的小鼠在復(fù)制模型后不久即出現(xiàn)活動度下降，精神萎靡，同時出現(xiàn)不同程度的飲食和飲水減少，在復(fù)制模型后的第9天，除個別小鼠外，體重又開始回升，并趨于穩(wěn)定。BLM組在第11天死亡1只，IgG2A組在第13天死亡1只，抗體干預(yù)組和NC組無小鼠死亡。

2.2 各組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、中性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞以及單核細(xì)胞數(shù)量的變化情況

各組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①各組不同時間點的細(xì)胞總數(shù)有差異（F=14 790.397，P=0.000）。②各組間BALF中的細(xì)胞總數(shù)有差異（F=350.258，P=0.000）；其他組中BALF中細(xì)胞總數(shù)高于NC組（P＜0.05）。IgG2A組和BLM組的細(xì)胞總數(shù)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。而抗體干預(yù)組、IgG2A組和BLM組的表達(dá)高峰在第14天，其中抗體干預(yù)組低于IgG2A組和BLM組（P＜0.05）。③各組細(xì)胞總數(shù)的變化趨勢有差異（F=1 069.935，P=0.000）。見表 1。

各組小鼠BALF中中性粒細(xì)胞數(shù)比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①各組不同時間點的中性粒細(xì)胞計數(shù)有差異（F=2 155.813，P=0.000）。②各組間的中性粒細(xì)胞計數(shù)有差異（F=367.880，P=0.000）；其他組中性粒細(xì)胞計數(shù)高于NC組，其高峰均在第14天，其中抗體干預(yù)組低于IgG2A組和BLM組（P＜0.05）。③各組中性粒細(xì)胞計數(shù)的變化趨勢有差異（F=229.875，P=0.000）。隨著時間推移，中性粒細(xì)胞計數(shù)呈逐漸下降趨勢。見表2。

各組小鼠BALF中淋巴細(xì)胞計數(shù)比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①各組不同時間點的淋巴細(xì)胞計數(shù)有差異（F=61.430，P=0.000）；②各組間的淋巴細(xì)胞計數(shù)有差異（F=456.240，P=0.000）；抗體干預(yù)組低于IgG2A組和BLM組（P＜0.05）。③各組淋巴細(xì)胞計數(shù)的變化趨勢有差異（F=29.647，P=0.000）。見表 3。

各組小鼠BALF中單核細(xì)胞計數(shù)比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①各組不同時間點的單核細(xì)胞計數(shù)有差異（F=461.806，P=0.000）。②各組間的單核細(xì)胞計數(shù)有差異（F=137.742，P=0.000）；單核細(xì)胞在第14天時達(dá)高峰，其中抗體干預(yù)組低于IgG2A組和BLM組（P＜0.05）。③各組單核細(xì)胞計數(shù)的變化趨勢有差異（F=57.197，P=0.000）。見表4。

2.3 BALF中IL-1β、IL-10、IL-17A、IFN-γ的含量比較

各組小鼠BALF中IL-1β的含量比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①各組不同時間點IL-1β的含量有差異（F=9.534，P=0.001）。②各組間IL-1β的含量有差異（F=98.320，P=0.000）；BLM組、IgG2A組及抗體干預(yù)組各時間點IL-1β表達(dá)量與NC組比較升高（P＜0.05），其表達(dá)高峰均在第7天；IgG2A組和BLM組的表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；抗體干預(yù)組各時間點IL-1β表達(dá)量與BLM組比較下降（P＜0.05）。③各組IL-1β的含量的變化趨勢無差異（F=0.990，P=0.445）。見表5。

表1 各組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)比較（n =6，×106個 /ml，±s）

表1 各組小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)比較（n =6，×106個 /ml，±s）

組別 ____第7天 ___第14天 ___第28天NC 組 5.48±0.39 6.41±0.42 5.80±0.54 BLM 組 65.27±4.42 81.17±4.53 36.85±4.40 IgG2A組 60.43±3.21 75.92±5.38 35.94±3.52抗體干預(yù)組 __40.32±3.59 __53.38±4.07 __22.57±3.41

表2 各組小鼠BALF中中性粒細(xì)胞計數(shù)比較（n =6，×106個 /ml，±s）

表2 各組小鼠BALF中中性粒細(xì)胞計數(shù)比較（n =6，×106個 /ml，±s）

組別 ____第7天 ___第14天 第28天NC 組 2.45±0.39 2.67±0.41 2.62±0.31 BLM 組 29.05±2.84 41.00±2.15 18.45±1.45 IgG2A 組 26.65±2.04 39.32±1.50 16.94±1.36抗體干預(yù)組_____20.83±1.55____30.23±1.94_______8.5_________1±0.95

表3 各組小鼠BALF中淋巴細(xì)胞計數(shù)比較（n =6，×106個 /ml，±s）

表3 各組小鼠BALF中淋巴細(xì)胞計數(shù)比較（n =6，×106個 /ml，±s）

組別 第7天 第14天 第28天NC 組 0.51±0.07 0.79±0.12 0.80±0.07 BLM 組 5.96±0.19 6.75±0.82 5.22±0.74 IgG2A 組 5.08±0.43 6.86±0.53 5.78±0.41抗體干預(yù)組 4.03±0.21 5.23±0.20 2.26±0.45

表4 各組小鼠BALF中單核細(xì)胞計數(shù)比較（n =6，×106個 /ml，±s）

表4 各組小鼠BALF中單核細(xì)胞計數(shù)比較（n =6，×106個 /ml，±s）

組別 第7天 第14天 第28天NC 組 2.55±0.40 2.73±0.51 2.32±0.29 BLM 組 26.68±4.33 30.45±2.79 13.05±1.74 IgG2A組 23.00±3.23 28.38±2.84 10.45±1.48抗體干預(yù)組 15.95±2.68 21.42±2.19 10.09±1.08

表5 各組小鼠BALF中IL-1β的含量比較（n =6，pg/ml，±s）

表5 各組小鼠BALF中IL-1β的含量比較（n =6，pg/ml，±s）

組別 第7天 第14天 第28天NC 組 2.24±0.95 1.63±0.50 2.21±0.86 BLM 組 8.35±1.25 7.78±1.59 6.71±2.41 IgG2A 組 8.03±1.13 7.43±1.52 6.89±1.91抗體干預(yù)組 4.54±0.10 3.82±1.45 2.51±1.01

各組小鼠BALF中IL-10的含量比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①各組不同時間的IL-10的含量有差異（F=71.313，P=0.000）。②各組間IL-10的含量有差異（F=814.548，P=0.000）。NC組BALF中有少量IL-10的表達(dá)，而抗體干預(yù)組、IgG2A組和BLM組各時間段表達(dá)量增高，與NC組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），IgG2A組和BLM組的表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；抗體干預(yù)組、IgG2A組和BLM組表達(dá)高峰均在第14天，而抗體干預(yù)組表達(dá)量低于BLM組（P＜0.05）。③各組IL-10含量的變化趨勢有差異（F=17.858，P=0.000）。見表6。

表6 各組小鼠BALF中IL-10的含量比較（n =6，pg/ml，±s）

表6 各組小鼠BALF中IL-10的含量比較（n =6，pg/ml，±s）

組別 第7天 第14天 第28天NC 組 13.14±2.61 12.89±3.05 13.11±3.25 BLM 組 52.06±3.21 65.36±3.01 43.41±4.59 IgG2A 組 50.95±2.92 54.01±3.06 42.53±3.24抗體干預(yù)組 23.98±3.38 30.45±3.68 19.67±3.08

各組小鼠BALF中IL-17A的含量比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①各組不同時間點IL-17A的含量有差異（F=201.904，P=0.000）。②各組間IL-17A的含量有差異（F=1 126.394，P=0.000）；IL-17A在NC組各時間點BALF中有少量表達(dá)；抗體干預(yù)組、IgG2A組和BLM組各時間點表達(dá)量高于NC組，IgG2A組和BLM組的表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；抗體干預(yù)組、IgG2A組和BLM組第7天時均達(dá)最高峰，隨時間增加IL-17A含量逐漸減少，但于第28天仍高于NC組（P＜0.05），其中抗體干預(yù)組表達(dá)量低于BLM組（P＜0.05）。③各組IL-17A的含量變化趨勢有差異（F=38.894，P=0.000）。見表7。

表7 各組小鼠BALF中IL-17A的含量比較（n =6，pg/ml，±s）

表7 各組小鼠BALF中IL-17A的含量比較（n =6，pg/ml，±s）

組別 第7天 第14天 第28天NC 組 0.07±0.01 0.09±0.01 0.11±0.01 BLM 組 1.05±0.06 0.82±0.07 0.69±0.01 IgG2A 組 0.97±0.05 0.85±0.03 0.64±0.02抗體干預(yù)組 0.35±0.07 0.29±0.05 0.20±0.08

各組小鼠BALF中IFN-γ的含量比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①各組不同時間點IFN-γ的含量有差異（F=399.298，P=0.000）。②各組間IFN-γ的含量有差異（F=55.787，P=0.000）；抗體干預(yù)組、IgG2A組和BLM組BALF中IFN-γ濃度各時間點表達(dá)量較NC組增高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；IgG2A組和BLM組的表達(dá)比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）?？贵w干預(yù)組、IgG2A組和BLM組表達(dá)高峰均在第7天，而抗體干預(yù)組表達(dá)量低于BLM組（P＜0.05）。③各組IFN-γ含量隨時間的變化趨勢有差異（F=19.791，P=0.000）。見表 8。

表8 各組小鼠BALF中IFN-γ的含量比較（n =6，pg/ml，±s）

表8 各組小鼠BALF中IFN-γ的含量比較（n =6，pg/ml，±s）

組別 第7天 第14天 第28天NC 組 22.76±4.59 20.65±3.51 19.92±2.55 BLM 組 49.88±4.51 46.01±5.05 29.35±3.04 IgG2A 組 49.21±4.31 43.43±5.22 33.83±2.95抗體干預(yù)組 40.63±4.58 34.58±4.51 22.28±2.06

2.4 各組小鼠HYP、MDA及ROS的含量比較

各組小鼠HYP、MDA及ROS比較，采用重復(fù)測量設(shè)計的方差分析，結(jié)果：①各組不同時間點HYP、MDA及ROS的含量有差異（F=916.819、398.672和287.788，均P=0.000）。②各組間HYP、MDA及ROS的含量有差異（F=381.450、501.796和370.548，均P=0.000）；抗體干預(yù)組、IgG2A組和BLM組中HYP、MDA及ROS的含量在各個時間點與NC組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。在各個時間點，BLM組與IgG2A組比較，HYP、MDA以及ROS的含量比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；而抗體干預(yù)組與BLM組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。③各組HYP、MDA及ROS含量的變化趨勢有差異（F=70.307、19.745和39.747，均P=0.000）。見表 9～11。

表9 各組小鼠HYP的含量比較（n =10，μg/mg，±s）

表9 各組小鼠HYP的含量比較（n =10，μg/mg，±s）

組別 第7天 第14天 第28天NC 組 0.40±0.01 0.40±0.02 0.40±0.01 BLM 組 0.50±0.02 0.69±0.03 0.90±0.01 IgG2A組 0.49±0.01 0.65±0.04 0.88±0.03抗體干預(yù)組 0.45±0.02 0.56±0.04 0.76±0.04

表10 各組小鼠MDA的含量比較（n =10，nmol/mg，±s）

表10 各組小鼠MDA的含量比較（n =10，nmol/mg，±s）

組別 第7天 第14天 第28天NC 組 2.18±0.17 2.33±0.15 2.23±0.14 BLM 組 8.21±0.25 6.94±0.74 5.57±0.54 IgG2A 組 8.15±0.26 6.67±0.21 5.27±0.24抗體干預(yù)組 6.55±0.21 5.44±0.24 4.35±0.19

表11 各組小鼠ROS的含量比較（n =6，u/mg，±s）

表11 各組小鼠ROS的含量比較（n =6，u/mg，±s）

組別 第7天 第14天 第28天NC 組 90.44±3.24 87.38±2.25 90.93±3.90 BLM 組 160.95±3.95 136.35±7.02 116.04±4.37 IgG2A 組 154.39±5.01 131.43±6.34 112.50±2.76抗體干預(yù)組 132.85±5.86 116.82±6.35 101.71±3.11

2.5 各組小鼠肺組織病理學(xué)評價

NC組小鼠肺組織的Masson染色顯示肺組織輪廓清晰，纖維化未發(fā)生，肺間質(zhì)未見膠原沉積；IgG2A組和BLM組肺組織纖維化明顯，并且可見大量膠原沉積；抗體干預(yù)組的肺組織纖維化程度輕于IgG2A組和BLM組。見附圖。

附圖 各組小鼠肺組織的病理切片 （Masson×100）

3 討論

肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展進(jìn)程主要包括肺組織的持續(xù)性炎癥損傷、正常的組織結(jié)構(gòu)被破壞以及大量成纖維細(xì)胞灶形成，最終導(dǎo)致肺損傷部位的多次反復(fù)組織修復(fù)，即肺損傷和肺纖維化2個階段。炎癥細(xì)胞是肺纖維化發(fā)生發(fā)展的重要參與者。肺纖維化早期表現(xiàn)為肺泡炎，即肺泡上皮細(xì)胞首先被損傷，肺泡內(nèi)出現(xiàn)出血水腫，大量炎癥細(xì)胞浸潤，該炎癥細(xì)胞會釋放出毒性物質(zhì)或細(xì)胞因子等，引起肺組織損傷和結(jié)構(gòu)破壞。本實驗在給予BLM后的小鼠表現(xiàn)為炎癥反應(yīng)，BALF中細(xì)胞總數(shù)增加，早期為急性中性粒細(xì)胞浸潤，隨后過渡為淋巴細(xì)胞增多的慢性表現(xiàn)，與IBICKI等[7]的研究結(jié)果一致，同時單核細(xì)胞的數(shù)目也在第14天達(dá)到高峰。而注射IL-17A中和抗體后的小鼠BALF中細(xì)胞總數(shù)、淋巴細(xì)胞、單核細(xì)胞、中性粒細(xì)胞的個數(shù)均有下降，說明IL-17A中和抗體可使炎癥反應(yīng)減弱。由此推斷如果在肺纖維化早期控制炎癥反應(yīng)，勢必會減輕非纖維化的程度。

在肺纖維化的發(fā)生和發(fā)展過程中，由病變部位的多種細(xì)胞合成并分泌的許多細(xì)胞因子，它們之間相互影響、相互作用，就形成復(fù)雜的細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)。肺纖維化發(fā)病機(jī)制的研究中細(xì)胞因子和細(xì)胞因子網(wǎng)絡(luò)的研究受到越來越多的關(guān)注。細(xì)胞因子及細(xì)胞因子復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)不但在肺泡早期炎癥階段發(fā)揮重要的作用，在隨后組織修復(fù)及纖維化的過程中也發(fā)揮著極其重要的作用。

IL-1β主要由活化的單核巨噬細(xì)胞產(chǎn)生，是機(jī)體前炎癥免疫反應(yīng)的主要誘導(dǎo)劑。本研究發(fā)現(xiàn)，IL-1β在大鼠肺纖維化發(fā)生的早期表達(dá)增加，并于肺泡炎癥階段達(dá)到峰值，而隨著肺纖維化的進(jìn)一步發(fā)展又下降，并達(dá)到正常水平，提示IL-1β主要在肺纖維化發(fā)生的早期起作用，可能在肺纖維化的發(fā)生中起誘導(dǎo)反應(yīng)的作用。

IL-10是已知的免疫和炎癥抑制因子，主要由淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和肥大細(xì)胞等產(chǎn)生。實驗中發(fā)現(xiàn)在病變早期BALF中其表達(dá)水平即增高，第14天后處于高表達(dá)狀態(tài)，且長時間保持，說明IL-10在肺纖維化形成各階段同樣發(fā)揮重要作用。

WILSON等[8]通過不同的肺纖維化模型證實在肺纖維化發(fā)生、發(fā)展的進(jìn)程中，IL-17A的表達(dá)會升高，與其相關(guān)的細(xì)胞信號通路也會在肺纖維化組織中被激活而引起一系列的效應(yīng)。同時有研究表明在缺乏IL-17A作用的受體的過敏性肺炎小鼠的模型中，肺部炎癥和肺纖維化的癥狀會減輕[9]，進(jìn)而證明IL-17A在肺纖維化的形成的進(jìn)程中具有非常重要作用。在本研究中，抗體干預(yù)組、IgG2A組和BLM組的IL-17含量在復(fù)制模型后第7天時均達(dá)最高峰，之后IL-17A含量逐漸減少，但于第28天仍高于NC組。

IFN-γ主要由活化的T細(xì)胞和NK細(xì)胞產(chǎn)生，在炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，具有抗纖維化作用，可以減緩肺纖維化的進(jìn)程。SEGEL等[10]研究表明，氣管內(nèi)注射BLM的小鼠，其肺部產(chǎn)生的IFN-γ在早期炎癥反應(yīng)階段增多，其持續(xù)表達(dá)對減輕纖維化程度很重要。本研究發(fā)現(xiàn)，抗體干預(yù)組、IgG2A組和BLM組IFN-γ含量高峰均在第7天，隨后逐步降低，各個時間點IFN-γ含量與NC組比較無差異。

ROS是有氧代謝生成的，化學(xué)性質(zhì)比較活潑的一類含氧物質(zhì)，主要包括氧自由基及其活性衍生物。氧自由基與其他物質(zhì)發(fā)生反應(yīng)，可繼發(fā)產(chǎn)生具有活潑生物活性的衍生物，如過氧化氫（H2O2）、脂質(zhì)過氧化物等。早在1987年CANTIN等[11]的研究中檢測到肺纖維化患者的BALF中H2O2和O2-等氧化物異常升高，證明氧化應(yīng)激與肺纖維化的發(fā)生是密切相關(guān)的。之后各國的科學(xué)家們開展大量的相關(guān)性研究，為闡明肺纖維發(fā)生的機(jī)制以及尋求有效的治療方案提供了一條新的途徑。有研究發(fā)現(xiàn)[12]，在BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠的模型中，發(fā)現(xiàn)有大量的ROS的釋放，并且其抗氧化體系也隨之發(fā)生改變，同時，若應(yīng)用抗氧化劑N-乙酰半胱氨酸治療BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠，可有效減輕肺纖維化的程度。有研究發(fā)現(xiàn)[13]，將小鼠的p47 phox基因敲除，因不能生成ROS，所以在BLM作用后并未發(fā)生明顯的肺纖維化。因此證明ROS參與肺纖維化的發(fā)生、發(fā)展的過程。MDA是氧自由基攻擊生物膜的不飽和脂肪酸而引發(fā)脂質(zhì)發(fā)生過氧化反應(yīng)的產(chǎn)物之一，因此測定MDA的含量可以反映體內(nèi)脂質(zhì)過氧化程度，并且能間接反映機(jī)體細(xì)胞受損傷程度[14]。本研究中，在復(fù)制模型后的第7、14及28天，抗體干預(yù)組小鼠肺組織ROS、MDA的含量與BLM組比較有差異。由此，推斷IL-17A中和抗體有利于減輕BLM誘導(dǎo)的小鼠肺纖維化氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而在一定程度上減輕了肺纖維化的程度。

HYP是機(jī)體膠原蛋白的主要組成成分，占到其氨基酸總量的13%左右。僅1%左右的HYP存在于彈性蛋白中，其余的幾乎均存在于膠原中。而膠原是機(jī)體器官發(fā)生纖維化的時候，細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分。因此測定肺組織中的HYP的含量可以了解膠原組織的分解代謝情況，進(jìn)而反映機(jī)體組織器官的纖維化程度。本研究中，抗體干預(yù)組小鼠肺組織HYP含量在各個時間點與BLM組相比有差異，進(jìn)一步說明IL-17A中和抗體有利于減輕肺纖維化程度。

綜上所述，中和IL-17A在BLM誘導(dǎo)的肺纖維化小鼠，能減弱肺組織的炎癥反應(yīng)，降低某些重要細(xì)胞因子的表達(dá)，減弱氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而有效減輕肺纖維化的程度，改善小鼠的肺功能。為闡明肺纖維化的發(fā)病機(jī)制以及為臨床上研制逆轉(zhuǎn)肺纖維化的藥物提供了新的方向。