前體代謝工程提高紅霉素產(chǎn)量的研究進(jìn)展

張萬祥，汪焰勝，吳杭，張部昌

安徽大學(xué)a.物質(zhì)科學(xué)與信息技術(shù)研究院；b.生命科學(xué)學(xué)院；安徽 合肥230601

糖多孢紅霉菌是革蘭陽性放線菌，常用于大規(guī)模生產(chǎn)紅霉素[1]。紅霉素是抗革蘭陽性菌廣譜抗生素,自1952年首次分離問世后，一直占據(jù)主流醫(yī)藥市場[2]。為增強(qiáng)紅霉素對胃酸的穩(wěn)定性并克服細(xì)菌的耐藥性，通過對紅霉素結(jié)構(gòu)進(jìn)行修飾，產(chǎn)生了以克拉霉素為代表的第二代紅霉素和以泰利霉素為代表的第三代紅霉素[3]。紅霉素在抗生素類藥物領(lǐng)域表現(xiàn)出驚人的經(jīng)濟(jì)價值和巨大的新藥開發(fā)潛能[4]，這使得提高紅霉素產(chǎn)量的研究顯得尤為重要。

為提高紅霉素產(chǎn)量，滿足市場需求，近年來各項(xiàng)研究層出不窮，但高產(chǎn)菌株的篩選策略通常有2種：一是經(jīng)典菌株隨機(jī)突變篩選，這種方法通常需要多次隨機(jī)突變，耗時耗力；二是理性基因工程改造[5-6]。前體是次級代謝生產(chǎn)的決定性因素之一[7]，通過增加前體供應(yīng)，改變前體代謝流向，是提高次級代謝產(chǎn)物的重要思路。

自Thompson等[8-9]首次從糖多孢紅霉菌中克隆出紅霉素抗性基因ermE開始，紅霉素生物合成通路逐漸被解析清楚。2004年Lum等[10]發(fā)現(xiàn)紅霉素高產(chǎn)與前體代謝調(diào)控有關(guān)，通過增加紅霉素前體供應(yīng)和對相關(guān)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子進(jìn)行改造能夠提高紅霉素產(chǎn)量。我們針對前體代謝工程改造，綜述了近年來有關(guān)提高紅霉素產(chǎn)量的研究進(jìn)展。

1 紅霉素A生物合成途徑

紅霉素A生物合成途徑的解析是利用代謝工程提高紅霉素產(chǎn)量的前提。紅霉素的生物合成分為2個階段，即聚酮骨架的合成和后修飾階段。以1分子丙酰輔酶A為起始單元，6分子甲基丙二酰輔酶A為延伸單元，經(jīng)Ⅰ型聚酮合酶（polyketide synthaseⅠ，PKSⅠ）催化合成6-脫氧紅霉素內(nèi)酯B（6-deoxyerythronolide B，6-dEB）；在EryF、EryBⅤ、EryCⅢ/EryCⅡ作用下依次發(fā)生羥基化、糖基化生成紅霉素內(nèi)酯B（erythronolide B，EB）、3-O-mycarosl-紅霉內(nèi)酯B（3-O-mycarosylerythronolide B，MEB）和第一個具有生物學(xué)活性的紅霉素D。紅霉素D到紅霉素A有2條途徑：一是先在EryG作用下甲基化生成紅霉素B，再經(jīng)EryK羥基化生成紅霉素A；另一條途徑是在EryK的作用下羥基化生成紅霉素C，再經(jīng)EryG甲基化生成紅霉素A[11-13]。紅霉素A生物合成模型的建立為前體代謝的研究奠定了基礎(chǔ)，其合成通路上前體的代謝改造對紅霉素合成具有重要影響。

2 前體喂養(yǎng)途徑

丙酰輔酶A和甲基丙二酰輔酶A是紅霉素合成的重要前體，增加其含量是提高紅霉素產(chǎn)量的重要策略[7,14]。GlnR家族多效性調(diào)控因子DasR的缺失會引起SACE_1456-1459、SACE_5638-5640的轉(zhuǎn)錄水平顯著下調(diào)，從而使丙酰輔酶A和甲基丙二酰輔酶A的合成水平降低，最終導(dǎo)致紅霉素產(chǎn)量下降[15]。研究表明，體外補(bǔ)充正丙醇能夠增加甲基丙二酰輔酶A和丙酰輔酶A含量，最終導(dǎo)致紅霉素產(chǎn)量上升[14,16]。

2.1 丙酰輔酶A喂養(yǎng)途徑

奇數(shù)或分支脂肪酸的β氧化產(chǎn)物是丙酰輔酶A的一部分來源[17]。比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，工業(yè)高產(chǎn)菌株E3相比NRRL23338，表現(xiàn)出對脂肪酸分解途徑的激活作用，參與脂肪酸分解代謝上調(diào)的基因有SACE_4038、SACE_4125、SACE_4571、SACE_6363等[18]。與之對應(yīng)，在培養(yǎng)基中添加油脂能提高紅霉素產(chǎn)量[19-20]。

分支氨基酸（纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸）的降解也是丙酰輔酶A的一部分來源[21-22]，因此針對分支氨基酸降解途徑酶基因和相關(guān)調(diào)控因子的改造是一條重要思路。比較轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，分支氨基酸分解途徑中編碼一些關(guān)鍵酶的基因如SACE_4125、SACE_4571、SACE_4570、SACE_4672等在工業(yè)菌株E3中顯著上調(diào)[18]。

糖多孢紅霉菌中過表達(dá)與分支氨基酸相關(guān)的3個基因/操縱子ilvB1（SACE_4565）、bdkOp（SACE_3952）和mmsOp1（SACE_1456-59），分別導(dǎo)致紅霉素產(chǎn)量提高74%、67%和250%[23]。在利福平抗性基因rif缺失突變株中發(fā)現(xiàn)纈氨酸分解途徑的SACE_1456-1459基因顯著上調(diào)，從而導(dǎo)致紅霉素產(chǎn)量上升約4倍[24]。2017年本實(shí)驗(yàn)室在糖多孢紅霉菌中發(fā)現(xiàn)lrp（SACE_5388）的敲除會導(dǎo)致分支氨基酸ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（SACE_5387-5386）轉(zhuǎn)錄水平提高，在A226中過表達(dá)SACE_5387-5386導(dǎo)致紅霉素產(chǎn)量上升31%。體外分別添加纈氨酸、異亮氨酸和亮氨酸，紅霉素A產(chǎn)量相應(yīng)提高47%、35%和16%[25]。Xu等[22]發(fā)現(xiàn)PccD能直接作用在參與分支氨基酸降解的bkd操縱子（SACE_3880-3884）上，敲除pccD能使bkd操縱子轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)5倍，過表達(dá)bkd操縱子紅霉素產(chǎn)量提高38%。

除分支氨基酸外，其他一些氨基酸降解也能產(chǎn)生丙酰輔酶A，如甲硫氨酸[17]、天冬氨酸、蘇氨酸[26]等。Clelia等[27]發(fā)現(xiàn)通過缺失參與嘌呤嘧啶及硫胺素合成的一些關(guān)鍵酶的編碼基因purF（SACE_7125）、purH（SACE_6664）、thiO（SACE_0506）、thiC（SACE_0511）、pyrC（SACE_2080），可改變代謝流，提高絲氨酸、甘氨酸、蘇氨酸的代謝，進(jìn)而提高丙酰輔酶A含量。呂偉等[28]在發(fā)酵培養(yǎng)基中添加天冬氨酸導(dǎo)致紅霉素A產(chǎn)量上升。

2.2 甲基丙二酰輔酶A喂養(yǎng)途徑

在鏈霉菌中發(fā)現(xiàn)至少4條途徑與甲基丙二酰輔酶A合成有關(guān)：丙酰輔酶A羧化酶（proprionyl-CoA carboxylase，PCC）途徑（羧化丙酰輔酶A生成甲基丙二酰輔酶A）、甲基丙二酰輔酶A變位酶（methyl?malonyl-CoA mutase，MCM）途徑（催化琥珀酰輔酶A與甲基丙二酰輔酶A的可逆異構(gòu)化）、源于乙酰輔酶A的MeaA途徑[29]和巴豆酰輔酶A還原酶（crotonyl-CoA reductase，CCR）途徑[30]，但在糖多孢紅霉菌中只發(fā)現(xiàn)PCC和MCM途徑[18,21,31]。

2.2.1 PCC途徑丙酰輔酶A不僅是紅霉素的起始單元，也是甲基丙二酰輔酶A的前體[21,32]。丙酰輔酶A的吸收在微生物中有2條途徑：一是經(jīng)過甲基檸檬酸途徑（methylcitrate cycle，MCC）轉(zhuǎn)化成丙酮酸；二是通過PCC途徑催化丙酰輔酶A生成甲基丙二酰輔酶A。糖多孢紅霉菌基因組中沒有發(fā)現(xiàn)編碼MCC途徑相關(guān)酶的基因[21,33-34]。糖多孢紅霉菌的這種代謝模式可能有利于丙酰輔酶A轉(zhuǎn)化成甲基丙二酰輔酶A，繼而有利于紅霉素的合成。

基因組測序分析表明，糖多孢紅霉菌中至少存在6個編碼PCC的區(qū)域（SACE_0026-0028、SACE_3241-3242、SACE_3398-3400、SACE_3856/6509、SACE_4237、SACE_7038-7039）[21,31]，目 前只有SACE_4237和SACE_3398-3400被報道。比較轉(zhuǎn)錄組分析發(fā)現(xiàn)，SACE_4237在紅霉素高產(chǎn)菌株E3中的轉(zhuǎn)錄水平明顯比NRRL23338高，表明紅霉素高產(chǎn)可能與SACE_4237這一PCC編碼基因的高表達(dá)有關(guān)[18]。2017年Xu等[21]發(fā)現(xiàn)TetR家族轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子PccD（SACE_3396）能夠直接抑制pccB（SACE_3398）、pccC（SACE_3399）和pccA（SACE_3400）的轉(zhuǎn)錄，且發(fā)現(xiàn)甲基丙二酸能夠作為效應(yīng)分子解除PccD對pccBC的結(jié)合作用，在糖多孢紅霉菌中敲除pccD促進(jìn)丙酰輔酶A轉(zhuǎn)化成甲基丙二酰輔酶A從而導(dǎo)致紅霉素產(chǎn)量上升。

2.2.2 MCM途徑糖多糖紅霉菌中MCM途徑的一個關(guān)鍵酶MutB可催化琥珀酰輔酶A和甲基丙二酰輔酶A的可逆轉(zhuǎn)化，且其催化方向受培養(yǎng)基的影響：在油基培養(yǎng)基中，催化方向向甲基丙二酰輔酶A，有利于紅霉素的合成；在可溶性碳水化合物培養(yǎng)基中，催化方向向琥珀酰輔酶A，進(jìn)入TCA循環(huán)[35-36]。因此，通過基因工程手段將整個MCM操縱子整合到糖多孢紅霉菌染色體上并在油基培養(yǎng)基條件下可以促進(jìn)琥珀酰輔酶A轉(zhuǎn)變成甲基丙二酰輔酶A，最終提高紅霉素產(chǎn)量[37]；而在可溶性碳水化合物基質(zhì)培養(yǎng)基中，mutB敲除突變株的紅霉素產(chǎn)量較出發(fā)菌株提高約126%[36]。值得注意的是，琥珀酰輔酶A經(jīng)MutB催化生成的是（2R）-甲基丙二酰輔酶A，須通過MCM途徑中的異構(gòu)酶（如SACE_6238）異構(gòu)化產(chǎn)生（2S）-異構(gòu)體，雖然目前還沒有關(guān)于該酶的研究報道[18]。

3 糖基化修飾改造

紅霉素A的大環(huán)內(nèi)酯骨架上C-3和C-5位置附著2個脫氧糖，糖基的存在對紅霉素的生理活性與生物合成產(chǎn)量至關(guān)重要[38]。增加糖基供應(yīng)是提高抗生素產(chǎn)量的一個重要方向，如在井岡霉素生物合成中發(fā)現(xiàn)，添加高濃度的UDP-葡萄糖（井岡霉素糖基供體）或超量表達(dá)UDP-葡萄糖焦磷酸化酶均能提升其產(chǎn)量[39]。糖多孢紅霉菌在糖基化方面的研究多集中在紅霉素衍生物方面，對于紅霉素產(chǎn)量方面的研究較少。本實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)來自委內(nèi)瑞拉鏈霉菌的糖基轉(zhuǎn)移酶DesⅦ/DesⅧ不僅能夠替代EryCⅢ的功能，在MEB的C-5位置上連接D-德糖胺，而且具有比EryBⅤ更高的效率催化L-霉菌糖連接到EB的C-3位置上，在eryBV基因缺失突變株中異源表達(dá)DesⅦ/DesⅧ，可提高紅霉素的產(chǎn)量[40]。

4 甲基化修飾改造

紅霉素B和C是紅霉素A的直接前體，可分別被EryK和EryG催化形成紅霉素A。EryK/EryG的平衡對紅霉素的生物合成效率有重要影響。Chen等[13]通過優(yōu)化eryK/eryG拷貝數(shù)比例（3∶2），顯著提高紅霉素產(chǎn)量與純度。

EryG是S-腺苷甲硫氨酸（S-adenosylmethio?nine，SAM）依賴型的甲基化酶，增加甲基化反應(yīng)的底物（SAM）濃度能夠提高催化效率使紅霉素產(chǎn)量上升[41]。SAM合成酶（SAM synthetase，MetK）可催化L-甲硫氨酸和ATP形成SAM。添加外源SAM或過表達(dá)metK可提高相應(yīng)次級代謝產(chǎn)物產(chǎn)量[42-43]。在糖多孢紅霉菌基因組中整合來自壯觀鏈霉菌的metK，紅霉素A產(chǎn)量上升132%；添加外源SAM也可提高紅霉素產(chǎn)量[41]。在大腸桿菌BAP1（pBP130/pBP144）中共表達(dá)metK可使紅霉素母環(huán)6-脫氧紅霉素內(nèi)酯B的產(chǎn)量提高約85%[12]。本實(shí)驗(yàn)室在糖多孢紅霉菌野生菌株和工業(yè)菌株中分別串聯(lián)過表達(dá)metK、透明顫菌血紅蛋白基因vhbS和全局性調(diào)控基因adpA，均可顯著提高紅霉素產(chǎn)量[44]。

5 結(jié)語

增加前體供應(yīng)和提高紅霉素生物合成通路中相應(yīng)酶活是提高紅霉素產(chǎn)量的重要策略。目前這些研究已取得一定進(jìn)展，但仍具有挖掘的潛力。紅霉素合成通路涉及多種前體代謝，然而目前這些前體供應(yīng)通路仍有不清晰之處。丙酰輔酶A的來源，除了本文中論述的脂肪酸和氨基酸，還有其他來源有待深入研究，如膽固醇的降解[17,45-46]等；糖多孢紅霉菌中，甲基丙二酰輔酶A的供應(yīng)未發(fā)現(xiàn)MeaA和CCR通路[18,21,31]，是否存在其他替代路線？這些均是值得深入探討的問題。

紅霉素合成過程涉及多種酶，但對這些酶進(jìn)行改造以提高紅霉素產(chǎn)量的研究較少。通過改造酶的活性位點(diǎn)或增加相應(yīng)的輔因子提高催化效率，也是提高紅霉素產(chǎn)量的重要思路。

此外，糖多孢紅霉菌中初級代謝與次級代謝的平衡也有待研究。葡萄糖作為碳源參與糖多孢紅霉菌的初級代謝，過量添加葡萄糖卻導(dǎo)致次級代謝產(chǎn)物紅霉素產(chǎn)量下降，同時正丙醇和豆油等有利于次級代謝的底物利用率下降[16,20]。這表明，初級代謝與次級代謝并不是相互獨(dú)立的，它們之間的平衡對紅霉素等的次級代謝合成具有重要影響。針對初級、次級代謝平衡的研究，對提高紅霉素產(chǎn)量具有重要意義。