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    構(gòu)建鈣熒光探針細(xì)胞用于探究胞漿和線粒體鈣對(duì)ATP刺激的響應(yīng)

    2019-04-02 11:34:20王愷趙海鑫李金亮夏晴
    生物技術(shù)通訊 2019年1期
    關(guān)鍵詞:內(nèi)鈣胞漿腺病毒

    王愷,趙海鑫,李金亮,夏晴

    國(guó)家生物醫(yī)學(xué)分析中心,北京100850

    腺嘌呤核苷三磷酸(adenosine triphosphate,ATP)是重要的細(xì)胞內(nèi)代謝產(chǎn)物,作為能量載體為幾乎所有的細(xì)胞生命活動(dòng)提供能量,同時(shí),ATP也是一種重要的信號(hào)分子,參與細(xì)胞內(nèi)和從細(xì)胞外到細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞[1-2]。在缺氧、病原體感染引起的細(xì)胞凋亡和組織損傷情況下,ATP可由細(xì)胞釋放至胞外作為一種危險(xiǎn)信號(hào)參與信息傳遞,并且,有報(bào)道在化療或某些物理治療時(shí),壞死的腫瘤細(xì)胞會(huì)將胞內(nèi)ATP釋放到微環(huán)境中,引起周圍腫瘤細(xì)胞和微環(huán)境中巨噬細(xì)胞的響應(yīng)[3-4]。因此,深入研究細(xì)胞對(duì)外部環(huán)境中ATP刺激的響應(yīng),對(duì)于理解胞外ATP這一危險(xiǎn)信號(hào)在某些組織損傷情況下的信號(hào)傳遞作用、腫瘤細(xì)胞內(nèi)部生命活動(dòng)與外部環(huán)境的聯(lián)系,以及腫瘤細(xì)胞響應(yīng)微環(huán)境物質(zhì)刺激的方式具有重要意義。

    細(xì)胞外ATP可通過(guò)刺激細(xì)胞膜上的嘌呤類受體P2X7分子,引起細(xì)胞內(nèi)鈣穩(wěn)態(tài)的改變,從而引起細(xì)胞的免疫反應(yīng)和代謝狀態(tài)改變等[3,5-6]。鈣離子是機(jī)體各種生理活動(dòng)必不可少的離子,參與膜電勢(shì)維持、神經(jīng)傳導(dǎo)、能量生產(chǎn)等重要的生理生化過(guò)程。同時(shí),鈣離子作為一種細(xì)胞內(nèi)廣泛存在的第二信使,參與了細(xì)胞內(nèi)外的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和信息傳遞[7]。

    在本研究中,我們采用胞漿和線粒體定位鈣探針GCaMP6的腺病毒分別感染人宮頸癌細(xì)胞HeLa[8-9],驗(yàn)證感染成功率和表達(dá)情況,研究在外源ATP刺激下HeLa細(xì)胞內(nèi)部鈣離子穩(wěn)態(tài)的改變,希望為觀察細(xì)胞內(nèi)不同結(jié)構(gòu)組分鈣離子的動(dòng)態(tài)變化提供有力的工具。

    1 材料與方法

    1.1 材料

    人宮頸癌HeLa細(xì)胞系購(gòu)自American Type Culture Collection(ATCC);DMEM基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胰蛋白酶、雙抗(青霉素、鏈霉素)購(gòu)自邁晨科技有限公司(北京);胎牛血清、Opti-MAM培養(yǎng)基購(gòu)自Gibco公司;Lab-Tek八腔室蓋玻片、ATP購(gòu)自Thermo Fisher公司;Krebs-Ringer改良緩沖液(KRB)(125 mmol/L NaCl,5 mmol/L KCl,1 mmol/L Na3PO4,1 mmol/L MgSO4,5.5 mmol/L葡萄糖,20 mmol/L HEPES,pH7.4)為實(shí)驗(yàn)室自行配制;全長(zhǎng)線粒體鈣探針DNA來(lái)自意大利Padua大學(xué)Diego De Stefani實(shí)驗(yàn)室;cyto-GCaMP6和4mt-GCaMP6鈣探針腺病毒為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建;P2X7受體拮抗劑A438079來(lái)自Selleck公司。

    1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

    HeLa細(xì)胞用含10%胎牛血清及1%雙抗的DMEM培養(yǎng)基,在5%二氧化碳條件下,37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

    1.3 腺病毒感染

    將HeLa細(xì)胞用胰蛋白酶消化后,用DMEM培養(yǎng)基重懸并計(jì)數(shù),按3×104/孔的數(shù)量均勻種在Lab-Tek八腔室蓋玻片中,待細(xì)胞完全貼壁并狀態(tài)良好時(shí),每孔更換為200μL新鮮DMEM培養(yǎng)基,加入10μL腺病毒濃縮液,置于37℃培養(yǎng)箱中,6 h后更換為新鮮培養(yǎng)基并繼續(xù)培養(yǎng)。

    1.4 倒置熒光顯微鏡下觀察熒光探針表達(dá)情況

    在腺病毒感染細(xì)胞24 h后,將細(xì)胞置于倒置熒光顯微鏡下,在波長(zhǎng)為488 nm的激發(fā)光下觀察細(xì)胞的發(fā)光情況,從而確定腺病毒感染效率和熒光探針表達(dá)效果。

    1.5 鈣離子熒光探針動(dòng)態(tài)成像

    將轉(zhuǎn)染熒光探針腺病毒的HeLa細(xì)胞更換培養(yǎng)基,用生理鹽水洗3次以去除原有的DMEM培養(yǎng)基,每孔加入300μL預(yù)熱的KRB,在Ultra?VIEW spinning-disc confocal microscope(Perkin Elmer)熒光成像系統(tǒng)下觀察,激發(fā)光波長(zhǎng)488 nm,按3 s/幀的間隔連續(xù)拍攝。用Volocity軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,每組統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)n=20。

    1.6 ATP刺激下細(xì)胞鈣離子動(dòng)態(tài)成像

    將種植于Lab-Tek八腔室蓋玻片中的待觀察細(xì)胞更換培養(yǎng)基,用生理鹽水清洗3次后每孔加入150μL預(yù)熱的KRB,于共聚焦熒光顯微鏡成像系統(tǒng)下,以3 s/幀的間隔拍攝30 s,提前用預(yù)熱的KRB稀釋ATP至目標(biāo)濃度,快速向?qū)?yīng)腔室細(xì)胞滴加150μL終濃度為10μmol/L的ATP溶液,繼續(xù)拍攝。對(duì)于需要進(jìn)行抑制劑預(yù)處理的細(xì)胞,在拍攝前1 h即更換含有10μmol/L A438079的KRB預(yù)處理,其他操作一致。用Volocity軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,每組統(tǒng)計(jì)細(xì)胞數(shù)n=20。

    2 結(jié)果

    2.1 腺病毒感染后熒光探針在相應(yīng)細(xì)胞結(jié)構(gòu)中得到表達(dá)

    按照標(biāo)準(zhǔn)腺病毒轉(zhuǎn)染步驟進(jìn)行操作,將cyto-GCaMP6和4mt-GCaMP6這2種不同定位的鈣探針腺病毒感染HeLa細(xì)胞,24 h后在倒置顯微鏡下初步觀察,在共聚焦熒光顯微鏡下拍攝確認(rèn)。結(jié)果顯示,感染cyto-GCaMP6腺病毒后,HeLa細(xì)胞內(nèi)熒光探針GFP信號(hào)定位于胞漿,信號(hào)較強(qiáng),細(xì)胞維持良好的生長(zhǎng)狀態(tài);感染4mt-GCaMP6腺病毒后,HeLa細(xì)胞線粒體絲網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)有明顯的GFP信號(hào)表達(dá),細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好(圖1)。

    2.2 細(xì)胞外ATP刺激HeLa細(xì)胞胞漿發(fā)生瞬時(shí)鈣瞬變

    在共聚焦熒光顯微鏡下對(duì)感染了cyto-GCaMP6腺病毒的HeLa細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)態(tài)成像,我們發(fā)現(xiàn)在對(duì)細(xì)胞加入10μmol/L外源ATP刺激時(shí),細(xì)胞內(nèi)綠色熒光信號(hào)在6 s內(nèi)發(fā)生約10倍的瞬時(shí)增強(qiáng),持續(xù)約200 s后逐漸回落到基礎(chǔ)水平。這說(shuō)明,HeLa細(xì)胞能夠響應(yīng)細(xì)胞外ATP的刺激,從而發(fā)生胞漿鈣離子濃度的瞬時(shí)上升即胞漿鈣瞬變[10],這可能是HeLa細(xì)胞對(duì)細(xì)胞外ATP刺激的一種響應(yīng)機(jī)制(圖2)。

    2.3 細(xì)胞外ATP的加入刺激HeLa細(xì)胞線粒體發(fā)生瞬時(shí)鈣瞬變

    同上,在共聚焦熒光顯微鏡下對(duì)感染了4mt-GCaMP6腺病毒的HeLa細(xì)胞進(jìn)行動(dòng)態(tài)成像,在對(duì)細(xì)胞加入10μmol/L外源ATP刺激時(shí),我們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞線粒體綠色熒光信號(hào)強(qiáng)度在9 s左右發(fā)生大約4倍的瞬時(shí)上升即線粒體鈣瞬變,約300 s后熒光強(qiáng)度逐漸下降到較低水平(圖3)。已知,細(xì)胞線粒體內(nèi)鈣離子的來(lái)源主要是胞漿[11-12],因此,此結(jié)果說(shuō)明在ATP刺激下,HeLa細(xì)胞內(nèi)整體鈣離子穩(wěn)態(tài)會(huì)發(fā)生改變,線粒體會(huì)從胞漿攝入大量的鈣離子,引起線粒體內(nèi)鈣離子濃度的上調(diào)。

    2.4 HeLa細(xì)胞通過(guò)細(xì)胞膜上的P2X7受體對(duì)細(xì)胞外ATP刺激進(jìn)行鈣瞬變的響應(yīng)

    據(jù)報(bào)道,真核細(xì)胞細(xì)胞膜上存在核酸類物質(zhì)的受體家族分子[13],其中P2X7受體能夠結(jié)合ATP分子,從而將刺激信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)入細(xì)胞,引起胞內(nèi)的生理活動(dòng)改變[5-6]。我們發(fā)現(xiàn),用P2X7受體抑制劑A438079處理細(xì)胞后[14],細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)和熒光探針表達(dá)情況并不受影響,但是在ATP刺激下,細(xì)胞內(nèi)胞漿鈣離子濃度和線粒體鈣離子濃度的上升都受到了抑制(圖4)。這說(shuō)明,細(xì)胞外ATP能夠通過(guò)HeLa細(xì)胞膜上的P2X7受體引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子穩(wěn)態(tài)的改變。通過(guò)這種信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制,細(xì)胞能夠快速響應(yīng)外界ATP的信號(hào)刺激。

    圖1 胞漿鈣探針cyto-GCaMP6(A)與線粒體鈣探針4mt-GCaMP6(B)在HeLa細(xì)胞中的表達(dá)

    3 討論

    作為一種重要的信號(hào)分子,鈣離子對(duì)很多器官和組織細(xì)胞內(nèi)的生理活動(dòng)具有關(guān)鍵的調(diào)控作用。在受到外來(lái)刺激和內(nèi)環(huán)境變化刺激時(shí),細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度會(huì)發(fā)生波動(dòng),從而引起細(xì)胞內(nèi)生理活動(dòng)狀態(tài)的改變。已知細(xì)胞內(nèi)主要的鈣離子庫(kù)是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和線粒體,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的鈣離子可以通過(guò)釋放到胞漿從而被線粒體攝取,引起線粒體活性的變化,這對(duì)于線粒體能量代謝、形態(tài)維持、氧化狀態(tài)的調(diào)節(jié)具有重要意義[11]。

    圖2 外源ATP刺激引起HeLa細(xì)胞胞漿鈣離子探針熒光信號(hào)瞬時(shí)上升

    圖3 外源ATP刺激引起HeLa細(xì)胞線粒體鈣離子探針熒光信號(hào)瞬時(shí)上升

    圖4 ATP受體通道抑制劑A438079處理抑制外源ATP刺激引起的胞漿鈣瞬變(A)和線粒體鈣瞬變(B)

    在此工作中,我們用基因編碼鈣探針對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)HeLa細(xì)胞可以對(duì)細(xì)胞外ATP刺激產(chǎn)生快速反應(yīng),發(fā)生瞬時(shí)的胞漿鈣瞬變和線粒體鈣瞬變。這說(shuō)明,HeLa細(xì)胞可以通過(guò)改變細(xì)胞內(nèi)鈣離子的穩(wěn)態(tài)對(duì)外界環(huán)境的ATP變化產(chǎn)生靈敏的反應(yīng),而這種能力是通過(guò)細(xì)胞膜上的P2X7受體介導(dǎo)的。研究表明在某些劇烈的細(xì)胞損傷條件例如放化療刺激下,死亡的腫瘤細(xì)胞會(huì)向外環(huán)境釋放出內(nèi)容物,這些細(xì)胞內(nèi)大量的ATP等核酸類物質(zhì)也會(huì)出現(xiàn)在外環(huán)境中,被周圍的其他細(xì)胞所感應(yīng)到,在病原體感染、組織損傷中,ATP作為危險(xiǎn)信號(hào),也介導(dǎo)了細(xì)胞炎癥性損傷應(yīng)答[2-4,15]。本研究成功構(gòu)建了能在活體細(xì)胞內(nèi)通過(guò)熒光探針實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)鈣離子響應(yīng)胞外ATP刺激的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)體系,為進(jìn)一步深入探究ATP等危險(xiǎn)信號(hào)導(dǎo)致細(xì)胞的炎性損傷機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

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