基于固態(tài)基底的SERS免疫檢測(cè)新方法研究

賈小飛，榮振，何小羊，肖瑞，王升啟

1.北京工業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)與生物工程學(xué)院，北京100124；2.軍事科學(xué)院 軍事醫(yī)學(xué)研究院輻射醫(yī)學(xué)研究所，北京100850

免疫分析作為一種可靠、簡(jiǎn)單且便宜的方法，用于鑒定和定量復(fù)雜溶液樣品中特定抗體或抗原的存在[1-2]。這種基于抗體與抗原特異性結(jié)合的檢測(cè)方法已廣泛應(yīng)用于生化研究[3]、臨床診斷[4]、環(huán)境監(jiān)測(cè)[5]和食品安全檢測(cè)[6]等領(lǐng)域。

表面增強(qiáng)拉曼散射（surface-enhanced Ra?man scattering，SERS）光譜具有光譜帶窄、靈敏度高、多通道檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn)，結(jié)合免疫檢測(cè)技術(shù)，可以應(yīng)用于蛋白質(zhì)、病毒、細(xì)菌等的檢測(cè)[7]。目前，基于SERS的免疫檢測(cè)技術(shù)通常依賴(lài)于液態(tài)SERS免疫磁珠基底[8]、固態(tài)SERS免疫芯片基底[9]和SERS免疫層析基底[10]。在國(guó)內(nèi)外的研究中，用于制備SERS免疫磁珠的磁性納米顆粒包括銀殼磁珠、金殼磁珠以及普通的羧基化磁珠，其中銀殼磁珠和金殼磁珠具有SERS增強(qiáng)能力[11]?；诿庖叽胖榈腟ERS免疫檢測(cè)一般可實(shí)現(xiàn)單通道和雙通道檢測(cè)。而固態(tài)SERS免疫芯片基底由于具有預(yù)定義的多個(gè)孔陣列，可實(shí)現(xiàn)多通道檢測(cè)[12]。固態(tài)SERS免疫芯片基底包括金膜基底、銀膜基底、石英玻璃基底等，其中金膜基底/銀膜基底可以與SERS檢測(cè)探針[13]之間形成熱點(diǎn)效應(yīng)，達(dá)到高靈敏檢測(cè)的目的；但是金膜基底/銀膜基底制備復(fù)雜，價(jià)格昂貴[14]。石英玻璃是一種最簡(jiǎn)單的檢測(cè)基底，但本身無(wú)SERS增強(qiáng)能力，只能依靠具有極強(qiáng)信號(hào)的SERS檢測(cè)探針達(dá)到高靈敏檢測(cè)的目的[14]。SERS-免疫層析檢測(cè)技術(shù)是以條狀纖維層析膜為固相基底，將SERS檢測(cè)探針與免疫層析技術(shù)相結(jié)合的快速、高靈敏免疫分析方法，但也較難實(shí)現(xiàn)多通道和集成化檢測(cè)[15-16]。

在本研究中，我們以醛基化單晶硅片作為SERS免疫檢測(cè)基底，具有背景噪聲低、性質(zhì)均一和修飾方法簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)。在硅片基底上進(jìn)行免疫檢測(cè)人IgM，引入辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的檢測(cè)抗體（羊抗人IgM-HRP），HRP催化5，5'-二巰基代雙（2-硝基苯甲酸）-酪胺（DTNB-Tyr）標(biāo)記的SERS檢測(cè)探針（Au-DTNB-Tyr NPs）沉積，提供拉曼信號(hào)；利用金標(biāo)銀染技術(shù)，在金顆粒周?chē)脬y顆粒，放大SERS信號(hào)，達(dá)到高靈敏檢測(cè)的目的。且固態(tài)硅片基底具有高通量檢測(cè)的潛力。此方法的建立可為多種相關(guān)疾病的集成化檢測(cè)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

氯金酸、硝酸銀、檸檬酸鈉（國(guó)藥集團(tuán)）；羊抗人IgM、人IgM、羊抗人IgM-HRP、5,5'-二巰基代雙（2-硝基苯甲酸）（DTNB）、酪胺（tyramine，Tyr）（Sigma公司）；DTNB-Tyr（本實(shí)驗(yàn)室合成）；銀染試劑（本實(shí)驗(yàn)室配制，A液為硝酸銀水溶液，B液為氫醌檸檬酸緩沖溶液）；單晶硅片（浙江立晶公司）；加熱磁力攪拌器（北京世紀(jì)華科公司）；離心機(jī)（Eppendorf公司）；Milli-Q超純水系統(tǒng)（Millipore獲得）；Hitachi H-7650透射電鏡（日立公司）；Shi?madzu 2600紫外分光光度計(jì)（島津公司）；i-Ra?man Plus BWS465-785H拉曼光譜儀（B&W Tek公司）；ZEISS EVO LS10掃描電鏡（蔡司公司）。

1.2 SERS檢測(cè)探針（Au-DTNB-Tyr NPs）的制備

首先，利用檸檬酸鈉還原氯金酸的方法制備Au納米顆粒（Au NPs）。將100 mL 0.001 g/L的氯金酸溶液加熱煮沸，攪拌，然后快速加入1.5 mL 0.1 g/L的檸檬酸鈉溶液，繼續(xù)加熱20 min，制備出約31 nm的Au NPs溶液。

將2.5μL 10 mmol/L的DTNB-Tyr/乙醇溶液加入1 mL Au NPs溶液中，終濃度為25μmol/L，靜置反應(yīng)3 h，7000 r/min離心8 min，棄上清，用2 mmol/L硼酸鈉緩沖液（BBS）洗滌1次，將SERS探針沉淀保存在2 mmol/L BBS溶液里備用。

1.3 基于硅片基底的SERS免疫檢測(cè)人IgM

1.3.1 免疫芯片制備在醛基化硅片的各個(gè)孔陣列中央滴加1μL 1 mg/mL的捕獲抗體（羊抗人IgM），孵育過(guò)夜；然后加入5μL 0.1 g/L的BSA溶液，37℃孵育2 h，以封閉未結(jié)合抗體的區(qū)域；用1×PBST洗滌，晾干，備用。

1.3.2 SERS免疫檢測(cè)在免疫芯片的相應(yīng)孔里加入5μL不同濃度的人IgM（1μg/mL、100 ng/mL、10 ng/mL、1 ng/mL、100 pg/mL、10 pg/mL），PBS作為空白對(duì)照，37℃反應(yīng)30 min，1×PBST洗滌3次，晾干；在每個(gè)孔里加入5μL檢測(cè)抗體（羊抗人IgM-HRP），37℃反應(yīng)30 min，1×PBST洗滌3次，晾干；在每個(gè)孔里加入5μL SERS檢測(cè)探針，37℃反應(yīng)30 min，1×PBST洗滌2次，水洗1次，晾干；在每個(gè)孔里加入5μL銀染試劑（A、B液等比例混合），避光反應(yīng)2 min，水洗滌1次，晾干。

1.3.3 SERS信號(hào)采集使用便攜式拉曼光譜儀，功率10 mW，采集時(shí)間5 s，任意選取反應(yīng)區(qū)的5個(gè)點(diǎn)進(jìn)行信號(hào)采集，在檢測(cè)儀器上通過(guò)軟件在1337 cm-1位移處讀取峰值，在檢測(cè)人IgM時(shí)，峰值越高表明IgM濃度越高。

2 結(jié)果

2.1 基于固態(tài)硅片基底的SERS免疫檢測(cè)原理

基于醛基化硅片固態(tài)基底的SERS免疫檢測(cè)原理見(jiàn)圖1。在醛基化硅片的相應(yīng)孔里包被捕獲抗體，制備SERS免疫固態(tài)芯片，在反應(yīng)孔里進(jìn)行免疫檢測(cè)人IgM，形成免疫復(fù)合物（抗人IgM-人IgM-抗人IgM-HRP），引入HRP，HRP催化酪胺偶聯(lián)的SERS檢測(cè)探針（Au-DTNB-Tyr NPs）沉積，利用金標(biāo)銀染技術(shù)，A液和B液在反應(yīng)孔里發(fā)生還原反應(yīng)，大量銀離子被催化還原成銀顆粒，起到放大SERS信號(hào)的作用，達(dá)到高靈敏和定量檢測(cè)人IgM的目的。

2.2 SERS檢測(cè)探針的表征

圖2A的透射電鏡圖顯示Au NPs大小均勻，分散性良好，適合制備SERS檢測(cè)探針。圖2B粒徑分布圖表明Au NPs的粒徑大小約為31 nm，與預(yù)測(cè)大小相符。DTNB-Tyr通過(guò)金-巰鍵與Au NPs結(jié)合，制備Au-DTNB-Tyr NPs，圖2C的紫外-可見(jiàn)吸收光譜結(jié)果表明，與Au NPs溶液相比，Au-DTNB-Tyr NPs溶液的吸收峰并未發(fā)生變化。圖2D的拉曼光譜信號(hào)表明，Au-DTNB-Tyr NPs表現(xiàn)出DTNB的特征峰。以上結(jié)果均說(shuō)明SERS檢測(cè)探針Au-DTNB-Tyr NPs制備成功。

2.3 羊抗人IgM-HRP濃度的優(yōu)化

按照1.3所述實(shí)驗(yàn)步驟檢測(cè)一定濃度的人IgM（1μg/mL），選擇不同稀釋比例（1∶500～1∶5000）的羊抗人IgM-HRP進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)拉曼信號(hào)，獲得拉曼光譜圖（圖3A），繪制不同濃度羊抗人IgM-HRP條件下的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度值（圖3B）。結(jié)果表明，羊抗人IgM-HRP的用量決定了拉曼信號(hào)的強(qiáng)度，以DTNB位于1337 cm-1位移處的主峰用于比較SERS信號(hào)的強(qiáng)弱，其濃度在1∶500～1∶1000時(shí)拉曼信號(hào)強(qiáng)度較強(qiáng)，并且強(qiáng)度基本一致；當(dāng)稀釋至1∶1000以下時(shí)，拉曼信號(hào)強(qiáng)度急劇下降。所以，本研究選取羊抗人IgM-HRP的工作濃度為1∶1000。

2.4 基于固態(tài)硅片基底的SERS免疫檢測(cè)定量分析人IgM

按照1.3所述實(shí)驗(yàn)步驟，檢測(cè)不同濃度的人IgM。由圖4A可見(jiàn)，當(dāng)人IgM濃度降低時(shí)，免疫反應(yīng)區(qū)域的SERS信號(hào)變?nèi)?，?dāng)人IgM濃度下降至10 pg/mL時(shí)，1337 cm-1位移處的主峰顯著，空白對(duì)照幾乎無(wú)信號(hào)。因此，基于硅片固態(tài)基底的SERS免疫檢測(cè)人IgM的檢測(cè)限是10 pg/mL。繪制以拉曼主峰1337 cm-1位移處的SERS信號(hào)強(qiáng)度和人IgM濃度（10 pg/mL～1μg/mL）對(duì)數(shù)之間的校正曲線如圖4B，在人IgM濃度為10 pg/mL～1μg/mL時(shí)具有良好的線性關(guān)系（R2=0.993），誤差線代表了5次獨(dú)立測(cè)量值的標(biāo)準(zhǔn)差。

圖1 基于硅片基底的SERS免疫檢測(cè)原理示意圖

圖5是基于硅片固態(tài)基底的SERS免疫檢測(cè)濃度為10 ng/mL和1μg/mL的人IgM的掃描電鏡圖，顯示了銀染前（圖5A、C）和銀染后（圖5B、D）SERS檢測(cè)探針和銀顆粒的沉積情況，其沉積量與人IgM的濃度呈正相關(guān)。

3 討論

在本研究中，我們建立了基于固態(tài)硅片基底的SERS免疫檢測(cè)新技術(shù)，引入了新型SERS檢測(cè)探針Au-DTNB-Tyr NPs，再結(jié)合金標(biāo)銀染技術(shù)，在SERS檢測(cè)探針周?chē)脬y顆粒，起到增強(qiáng)SERS信號(hào)的作用。通過(guò)上述SERS檢測(cè)探針和金標(biāo)銀染技術(shù)的引入，可高靈敏定量檢測(cè)人IgM，其檢測(cè)限為10 pg/mL。

圖2 SERS檢測(cè)探針的表征

圖3 不同羊抗人IgM-HRP稀釋比例下的拉曼光譜（A）和在主峰1337 cm-1位移處的相對(duì)信號(hào)強(qiáng)度（B）

圖4 基于固態(tài)硅片基底的SERS免疫檢測(cè)定量分析人IgM

圖5 基于固態(tài)硅片基底的SERS免疫檢測(cè)濃度為10 ng/mL（A、B）和1μg/mL（C、D）人IgM的銀染前（A、C）、后（B、D）掃描電鏡圖

應(yīng)選取合適粒徑大小的Au納米顆粒制備SERS檢測(cè)探針，若膠體金太小，SERS增強(qiáng)作用太弱，而太大的膠體金會(huì)有空間位阻，所以選取30 nm左右的Au NPs。合成的新型化合物DTNBTyr，既具有拉曼分子的特征，又具有HRP催化底物的性質(zhì)；DTNB-Tyr修飾Au NPs制備的新型SERS檢測(cè)探針，既可以提供拉曼信號(hào)，又可以被HRP催化發(fā)生沉積。

HRP可以催化底物酪胺發(fā)生沉積，但是在反應(yīng)過(guò)程中不被消耗，所需量比較小。為了達(dá)到高靈敏和定量檢測(cè)的目的，對(duì)免疫檢測(cè)中所用的檢測(cè)抗體（羊抗人IgM-HRP）的濃度進(jìn)行了優(yōu)化，其最佳工作濃度為1∶1000。

在銀染前，SERS檢測(cè)探針沉積在免疫反應(yīng)區(qū)域，沉積的量與所檢測(cè)人IgM的濃度有關(guān)，濃度越高（1μg/mL），沉積的量越多；濃度越低（10 ng/mL），沉積的量越少。在銀染后，大量銀顆粒被還原在SERS檢測(cè)探針周?chē)?，銀顆粒的沉積量與SERS檢測(cè)探針的量也呈正相關(guān)。所以，此種SERS免疫檢測(cè)方法可以達(dá)到定量和高靈敏檢測(cè)人IgM的目的。此外，本研究中的SERS檢測(cè)探針Au-DTNB-Tyr NPs可作為通用探針，結(jié)合固態(tài)基底的多通道特征，具有實(shí)現(xiàn)多種抗原或者病原體的集成化檢測(cè)的潛力。