瑞戈非尼抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞增殖的研究

武瑾，趙鵬，姜棋予，馬燕，張木子荷，王威，李樹(shù)，郭妤姝

1.解放軍總醫(yī)院第六醫(yī)學(xué)中心 藥劑科，北京100048；2.內(nèi)蒙古軍區(qū)衛(wèi)生防疫隊(duì)，內(nèi)蒙古 呼和浩特010051；3.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心 臨床研究管理中心，北京100039；4.解放軍總醫(yī)院第一醫(yī)學(xué)中心 消化內(nèi)科，北京100039；5.解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心 藥學(xué)部，北京100039

乳腺癌是嚴(yán)重危害我國(guó)女性健康的惡性腫瘤，其患病率占所有惡性腫瘤的7%～10%[1]。根據(jù)雌激素受體（estrogen recptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermalgrowth factor receptor-2，HER2）等的表達(dá)，乳腺癌可分為內(nèi)分泌依賴型、HER2陽(yáng)性型及三陰性乳腺癌[2]。三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）約占所有乳腺癌類型的15%～20%，發(fā)病率較高，具有進(jìn)展快、侵襲能力強(qiáng)、易發(fā)生局部復(fù)發(fā)和遠(yuǎn)處多發(fā)轉(zhuǎn)移的特點(diǎn)，患者的生存期及預(yù)后較差[3-4]。近幾年針對(duì)ER和HER2靶點(diǎn)的抗乳腺癌小分子藥物和抗體相繼投入臨床使用，顯示了一定的乳腺癌治療效果，例如他莫昔芬、氟維司群、曲妥珠單抗等[4-5]。然而三陰性乳腺癌目前治療策略選擇較少，亟需能夠治療三陰性乳腺癌的藥物和方法。瑞戈非尼（regorafenib）是拜耳公司研發(fā)的口服多靶點(diǎn)酪氨酸激酶抑制劑，能夠抑制血管生成、抑制腫瘤細(xì)胞增殖并調(diào)控腫瘤微環(huán)境，從而達(dá)到抑制腫瘤增殖與侵襲的目的[6]。目前美國(guó)食品藥品管理局（FDA）已批準(zhǔn)用于結(jié)直腸癌、胃腸道間質(zhì)瘤及肝癌的治療[7]。瑞戈非尼是否能夠抑制三陰性乳腺癌目前尚無(wú)研究報(bào)道。本研究中，我們采用三陰性乳腺癌細(xì)胞的裸鼠皮下腫瘤模型和肝臟原位轉(zhuǎn)移模型，探討瑞戈非尼是否對(duì)三陰性乳腺癌具有抑制作用。

1 材料與方法

1.1 材料

SPF級(jí)免疫缺陷小鼠（BALB/c品系的胸腺缺失小鼠）購(gòu)自北京市斯貝福生物科技有限公司；吸入麻醉劑異氟烷購(gòu)自深圳沃瑞德公司；小動(dòng)物實(shí)驗(yàn)相關(guān)手術(shù)器械為本實(shí)驗(yàn)室提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼養(yǎng)及動(dòng)物手術(shù)于解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心臨床研究管理中心實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心開(kāi)展。飼養(yǎng)條件為溫度22～23℃，環(huán)境濕度50%，自由進(jìn)食和飲水，按3R原則給予人道關(guān)懷。

MDA-MB-231細(xì)胞系（高侵襲性三陰性乳腺癌細(xì)胞）[8]由解放軍總醫(yī)院第五醫(yī)學(xué)中心馮帆博士惠賜，用含10%胎牛血清（FBS）的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)（均為Invitrogen公司產(chǎn)品）；分子實(shí)驗(yàn)RNA提取試劑盒購(gòu)自Qiagen公司；qPCR一步法擴(kuò)增試劑盒購(gòu)自KAPA公司；ABI 7500 Real-Time PCR儀為本實(shí)驗(yàn)室提供；肝臟腫瘤多發(fā)與彌散病灶照片的定量分析采用Image J軟件（版本號(hào)1.51j8），由美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院（NIH）發(fā)布。

1.2 免疫缺陷裸鼠皮下成瘤實(shí)驗(yàn)

在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞，生長(zhǎng)至80%密度時(shí)收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，用滅菌生理鹽水重懸，備用。于5～6周齡BALB/c免疫缺陷小鼠雙側(cè)后肢內(nèi)側(cè)皮下注射上述MDA-MB-231細(xì)胞懸液，每個(gè)后肢注射細(xì)胞量為1×106，接種3 d后對(duì)小鼠進(jìn)行灌胃給藥，瑞戈非尼組給予2 mg/kg瑞戈非尼，對(duì)照組給予PBS溶劑對(duì)照，隔日固定時(shí)間給藥。持續(xù)給藥3周后處死動(dòng)物，解剖小鼠下肢獲得腫瘤組織，稱重，測(cè)量腫瘤組織的長(zhǎng)度與寬度，按照公式（腫瘤體積=腫瘤長(zhǎng)度×腫瘤寬度×腫瘤寬度/2）估算腫瘤體積，并以腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量計(jì)算抑制率。

1.3 免疫缺陷裸鼠肝臟腫瘤多發(fā)與彌散病灶模型的建立[9]

在含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基中培養(yǎng)MDA-MB-231細(xì)胞，生長(zhǎng)至80%密度時(shí)收集細(xì)胞并計(jì)數(shù)，用滅菌生理鹽水重懸，控制細(xì)胞濃度為2.5×106/mL。用吸入麻醉劑異氟烷，麻醉機(jī)持續(xù)麻醉5～6周齡BALB/c免疫缺陷小鼠（首次麻醉濃度為3.5%，持續(xù)麻醉濃度為2.0%），并將小鼠固定。用滅菌手術(shù)器械沿腹部劍突下方按小鼠肝臟位置斜切1.5 cm開(kāi)口，分離筋膜層，小心擠出肝右葉，暴露肝門靜脈，用滅菌注射器向肝門靜脈注射200μL上述MDA-MB-231細(xì)胞懸液，注入總細(xì)胞量為5×105。接種完畢，將肝臟輕柔推回腹腔內(nèi)縫合，避免出血。按照1.2所述方法按瑞戈非尼組和對(duì)照組灌胃給藥，3周后處死小鼠并對(duì)肝臟組織進(jìn)行PET/CT檢測(cè)。

1.4 小動(dòng)物PET/CT檢測(cè)

BALB/c免疫缺陷小鼠經(jīng)尾靜脈注射約200 μCi核素探針18F-FDG，30 min后收集動(dòng)物血液標(biāo)本，處死動(dòng)物并解剖肝臟，立即對(duì)肝臟組織進(jìn)行PET/CT檢測(cè)，按照18F-FDG核素掃描模式，進(jìn)行12 min掃描采像[10-11]。用蓋革計(jì)數(shù)器測(cè)量肝臟和血液的核素強(qiáng)度，同時(shí)對(duì)肝臟組織進(jìn)行拍照。

1.5 實(shí)時(shí)定量PCR（qPCR）實(shí)驗(yàn)

對(duì)1.2方法獲得的皮下腫瘤研磨并提取總RNA，用一步法qPCR進(jìn)行檢測(cè)。設(shè)置三重復(fù)和陰性對(duì)照，分別檢測(cè)E-鈣黏蛋白、N-鈣黏蛋白、波形蛋白（vimentin）、基質(zhì)金屬蛋白酶3（MMP-3）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）、組織基質(zhì)金屬蛋白酶抑制劑1（TIMP-1）的基因表達(dá)情況，以GAP?DH為內(nèi)參。qPCR實(shí)驗(yàn)使用的引物見(jiàn)表1。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié)果以x±SD顯示，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS17.0軟件，單因素方差分析比較x±SD方法計(jì)算P值，以P＜0.05為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 瑞戈非尼對(duì)MDA-MB-231皮下成瘤具有抑制作用

經(jīng)過(guò)3周的隔日灌胃給藥治療，瑞戈非尼組小鼠皮下腫瘤明顯小于對(duì)照組（圖1A）。圖1B為皮下腫瘤體積的定量結(jié)果，圖1C為腫瘤稱重結(jié)果，圖1D為腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量的抑制率結(jié)果，瑞戈非尼對(duì)裸鼠皮下成瘤的腫瘤質(zhì)量和腫瘤體積的抑制率約為63%。這表明，服用瑞戈非尼能夠抑制三陰性乳腺癌細(xì)胞在裸鼠體內(nèi)的生長(zhǎng)。

2.2 瑞戈非尼對(duì)MDA-MB-231的裸鼠肝臟多發(fā)與彌散腫瘤病灶具有生長(zhǎng)抑制作用

裸鼠經(jīng)肝門靜脈注射5×105三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231以模擬三陰性乳腺癌肝轉(zhuǎn)移作用，接種細(xì)胞后即進(jìn)行瑞戈非尼治療，經(jīng)過(guò)3周生長(zhǎng)，瑞戈非尼持續(xù)給藥能夠顯著抑制肝臟多發(fā)與彌散病灶的生長(zhǎng)。對(duì)小鼠肝臟的PET/CT拍攝圖片與定量結(jié)果顯示（圖2A、B），瑞戈非尼組動(dòng)物肝臟相對(duì)于血液的核素信號(hào)明顯低于溶劑對(duì)照組。經(jīng)Image J軟件對(duì)肝臟照片進(jìn)行多發(fā)于彌散病灶面積定量（圖C），瑞戈非尼組散發(fā)病灶面積顯著低于對(duì)照組。這表明，瑞戈非尼對(duì)于三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231在裸鼠肝臟原位多發(fā)于彌散腫瘤模型中具有生長(zhǎng)明確的抑制作用，其對(duì)乳腺癌肝轉(zhuǎn)移等乳腺癌轉(zhuǎn)移作用具有臨床診療價(jià)值。

2.3 瑞戈非尼抑制三陰性乳腺癌MDA-MB-231增殖的分子機(jī)制

對(duì)瑞戈非尼組MDA-MB-231細(xì)胞在裸鼠皮下形成的腫瘤進(jìn)行總RNA提取和qPCR實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)瑞戈非尼對(duì)MDA-MB-231細(xì)胞上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移、侵襲的影響。結(jié)果如圖3A、B、C，瑞戈非尼能夠升高M(jìn)DA-MB-231上皮標(biāo)志物E-鈣黏蛋白表達(dá)，降低間質(zhì)標(biāo)志物N-鈣黏蛋白和波形蛋白的表達(dá)，抑制MDA-MB-231的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化。圖3D、E、F顯示，瑞戈非尼能夠降低MMP-3與MMP-9的表達(dá)，同時(shí)升高TIMP-1的表達(dá)，表明瑞戈非尼能夠抑制MDAMB-231的轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)。

表1 qPCR實(shí)驗(yàn)引物

3 討論

三陰性乳腺癌往往具有高侵襲性、易遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、化療后易復(fù)發(fā)等特點(diǎn)，導(dǎo)致預(yù)后較差，越來(lái)越引起人們的重視。除此之外，對(duì)于化療敏感的三陰性乳腺癌患者也僅有15%～20%，大部分患者沒(méi)有有效的治療藥物[12]，因此研究三陰性乳腺癌新型有效的治療方法顯得尤為重要。目前研究[13]表明，三陰性乳腺癌缺乏特定的分子靶點(diǎn)，這增加了三陰性乳腺癌藥物研發(fā)的難度。瑞戈非尼是一種多靶標(biāo)蛋白激酶抑制劑，能夠通過(guò)作用于腫瘤細(xì)胞增殖、腫瘤血管生成及腫瘤微環(huán)境相關(guān)靶點(diǎn)，發(fā)揮多重抗腫瘤作用?？梢种频陌悬c(diǎn)有VEG?FR-1、VEGFR-2、VEGFR-3、TIE-2、BRAF、KIT、RET、PDGFR和FGFR，目前瑞戈非尼已獲批用于治療晚期結(jié)直腸癌、胃腸間質(zhì)瘤和肝細(xì)胞癌。本研究結(jié)果揭示了瑞戈非尼對(duì)三陰性乳腺癌的體內(nèi)生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移侵襲作用具有明確的抑制作用。

圖1 瑞戈非尼抑制MDA-MB-231裸鼠皮下成瘤

圖2 瑞戈非尼抑制MDA-MB-231在肝臟原位生長(zhǎng)

圖3 瑞戈非尼抑制MDA-MB-231的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)移、侵襲

MDA-MB-231是高侵襲性的三陰性乳腺癌細(xì)胞系，也是目前相關(guān)研究最為公認(rèn)和常用的模型。我們培養(yǎng)獲得MDA-MB-231細(xì)胞建立裸鼠皮下腫瘤模型以及干門靜脈注射建立裸鼠肝臟原位多發(fā)與彌散轉(zhuǎn)移模型模擬三陰性乳腺癌在體內(nèi)的增殖與肝臟轉(zhuǎn)移，顯示瑞戈非尼治療對(duì)MDA-MB-231的體內(nèi)生長(zhǎng)與轉(zhuǎn)移、侵襲作用具有明確的抑制作用。初步探討了瑞戈非尼作用的分子機(jī)制。瑞戈非尼治療能顯著上調(diào)上皮標(biāo)識(shí)物E-鈣黏蛋白、下調(diào)間質(zhì)標(biāo)識(shí)物N-鈣黏蛋白與波形蛋白的表達(dá)，表明瑞戈非能抑制MDA-MB-231的上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化作用。同時(shí)，瑞戈非尼治療還能下調(diào)MMP3與MMP9的表達(dá)，上調(diào)TIMP1的表達(dá)，表明瑞戈非尼能明確抑制MDAMB-231轉(zhuǎn)移和侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)以減緩細(xì)胞的轉(zhuǎn)移與侵襲作用。上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化是惡性腫瘤細(xì)胞惡變、轉(zhuǎn)移/侵襲及抗腫瘤藥物耐藥的主要調(diào)節(jié)機(jī)制之一，而MMP能夠直接降解與破壞細(xì)胞外基質(zhì)與基底膜，最終加速惡性腫瘤細(xì)胞轉(zhuǎn)移與侵襲作用。

綜上所述，我們通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ图皺C(jī)制實(shí)驗(yàn)，初步闡明了瑞戈非尼對(duì)三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231的抑制作用，不僅拓展了對(duì)新型分子靶向藥物瑞戈非尼的認(rèn)識(shí)，也為三陰性乳腺癌治療提供了更多可能選擇。