數(shù)字PCR在肺癌診療中的應(yīng)用研究*

王 萍，韓苗苗，朱雁風(fēng) 綜述，席守民 審校

(河南科技大學(xué)：1.醫(yī)學(xué)院；2.材料科學(xué)與工程學(xué)院，河南洛陽 471000)

1985年由MULLIS發(fā)明的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)是生命科學(xué)領(lǐng)域的一項重大成就。第一代傳統(tǒng)的PCR技術(shù)需要根據(jù)瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果對擴增產(chǎn)物進行定性和半定量分析，并且容易產(chǎn)生假陽性。第二代的實時熒光定量PCR(quantitative PCR，qPCR)利用熒光探針或染料實現(xiàn)對靶標(biāo)基因的定量分析，但其定量過程需依賴于內(nèi)參基因或標(biāo)準(zhǔn)曲線，所以用于檢測核酸分子只是相對定量，并且其靈敏度也不能完全滿足分子生物學(xué)研究的需求。數(shù)字PCR(digital PCR，dPCR)是第三代PCR技術(shù)，可實現(xiàn)對核酸拷貝數(shù)的絕對定量，不受擴增曲線的循環(huán)閾值(cycle threshold，Ct)、內(nèi)參基因和標(biāo)準(zhǔn)曲線的影響，并且靈敏度和準(zhǔn)確度更高，這些優(yōu)點使得它在眾多領(lǐng)域迅速得到應(yīng)用。

1 dPCR技術(shù)的原理

1992年，SYKES等[1]使用有限稀釋、PCR和泊松分布檢測了低豐度的IgH重鏈基因突變，這一研究奠定了dPCR的雛形。1999年，VOGELSTEIN等[2]在檢測結(jié)腸癌患者糞便中Kras基因突變時，通過將樣本DNA稀釋并等分到384孔板中進行微升級的PCR反應(yīng)，從而實現(xiàn)對樣品中的Kras突變進行定量的目的，并首次正式提出了dPCR的概念。從廣義上講，經(jīng)典的PCR技術(shù)可以用于定性或定量分析，即研究目標(biāo)分子的性質(zhì)或確定目標(biāo)分子的數(shù)量。dPCR與經(jīng)典的PCR在這方面類似，不同之處在于dPCR技術(shù)在PCR擴增前將模板DNA稀釋到單分子水平并分散至許多微反應(yīng)單元，這導(dǎo)致在每個反應(yīng)單元中的模板數(shù)為0或1個。在PCR擴增后，含有靶DNA序列的反應(yīng)單元會顯示熒光陽性信號(定義為“1”)，而沒有靶序列的單元中只能觀察到背景熒光(定義為“0”)。然而，通常每個反應(yīng)單元中可含有至少兩個DNA模板分子，因此必須使用泊松分布公式進行校正，以減少反應(yīng)單元中由多個目標(biāo)模板的出現(xiàn)產(chǎn)生的誤差[3-4]。最后，根據(jù)泊松分布和熒光信號陽性反應(yīng)單元與所有反應(yīng)單元的比例，實現(xiàn)量化靶DNA的初始拷貝數(shù)或分析靶分子性質(zhì)的目的。

2 dPCR技術(shù)的分類

根據(jù)反應(yīng)單元形成的方式，dPCR技術(shù)主要分為三類：微反應(yīng)室/孔板、微流控芯片和微滴dPCR。

2.1 微反應(yīng)室/孔板dPCR 微孔板式dPCR是最早出現(xiàn)的dPCR技術(shù)。dPCR技術(shù)初期就是通過手工逐級稀釋并將樣品分配至96或384微孔板中進行PCR反應(yīng)。這種操作方式不僅繁瑣、試劑消耗量大、檢測通量小，其靈敏度也不能滿足實驗需求。除了PCR的擴增效率外，dPCR技術(shù)的檢測靈敏度主要取決于樣品分解的反應(yīng)單元數(shù)目n。理論上，反應(yīng)單元數(shù)目越多，dPCR的靈敏度越高，其檢測的準(zhǔn)確度也越高。MORRISON等[5]通過使用不銹鋼芯片，將反應(yīng)單元數(shù)達到了3 072個，每個反應(yīng)單元體積只有33 nL。該芯片用于dPCR技術(shù)中，與384孔板dPCR相比，其反應(yīng)體積降低了64倍，分析通量提高了24倍。但是這種方法需借助高通量自動點樣儀或機械手等設(shè)備，從而增加了操作的復(fù)雜性，提高了系統(tǒng)的成本[6]。

2.2 微流控芯片dPCR 由于微流控技術(shù)可以實現(xiàn)液體樣品納升甚至皮升級的分解，因此待測樣品可以獲得更大分解數(shù)目，使得dPCR技術(shù)的檢測靈敏度、可信度和動態(tài)范圍度得到極大改善。同時，通過使用微流控芯片可以進行多個平行反應(yīng)，它具有體積小、成本低和通量高的優(yōu)點，是理想的dPCR平臺。目前，國內(nèi)外許多研究課題組和公司已開發(fā)出以微流控芯片為核心組件的dPCR系統(tǒng)[7-10]，如Fluidigm公司的BioMarkTM基因分析系統(tǒng)和Life Technologies公司的QuantStudioTM3D系統(tǒng)。

2.3 微滴dPCR 液滴dPCR源于乳液PCR技術(shù)[11-12]。其核心是在PCR擴增前將反應(yīng)體系進行微滴化處理，利用油包水技術(shù)將反應(yīng)液分割成納升甚至皮升級的微滴，每個液滴含有1個或0個靶分子，并且每個液滴都是一個獨立的PCR反應(yīng)單元，在PCR反應(yīng)結(jié)束后可檢測每個油包水乳滴的熒光信號以達到定量的目的。Bio-Rad公司的QX100TM和QX200TM均為使用液滴技術(shù)的dPCR系統(tǒng)。

3 dPCR技術(shù)的優(yōu)勢

3.1 絕對定量 目前，qPCR仍然是核酸定量分析中更受歡迎的方法，主要是因為成本較低。標(biāo)準(zhǔn)品或內(nèi)參基因的使用是qPCR數(shù)據(jù)分析的核心，并可能因?qū)嶒炇叶悺Ｏ啾戎?，dPCR采用終點熒光檢測和陽性反應(yīng)單元比例進行定量分析，不依賴于標(biāo)準(zhǔn)曲線和內(nèi)參基因，實現(xiàn)真正意義上的絕對定量。

3.2 抑制劑耐受性強 與qPCR相比，dPCR對酶抑制劑的耐受性很強[13]，原因是dPCR在反應(yīng)液平均分配到每個反應(yīng)單元的過程中，一些PCR抑制劑也被均勻分配到反應(yīng)單元中，從而降低了抑制劑對反應(yīng)的干擾。而qPCR由于受到抑制劑的影響，會降低擴增效率。

3.3 高靈敏度和精確度 盡管qPCR和dPCR兩種技術(shù)在核酸檢測方面的熒光化學(xué)本質(zhì)是相同的，但dPCR體系采用成千上萬的反應(yīng)分區(qū)，可以精確地檢測出變化很小的目的序列。相對于qPCR，dPCR定量分析的變異系數(shù)(精確度的度量指標(biāo))明顯較低[14]。此外，在模板分配的過程中降低了背景DNA和其他污染物水平，從而提高了反應(yīng)單元中的信噪比，提高了檢測靈敏度[15]。這一優(yōu)勢使得dPCR可以用于分析復(fù)雜臨床標(biāo)本如血液、腦脊液中游離DNA的突變，為臨床用藥和治療提供更多信息。

3.4 高通量單細(xì)胞基因組測序 單細(xì)胞基因組測序是通過在單個細(xì)胞水平上對全基因組進行擴增和測序的一項新技術(shù)，可為研究單個細(xì)胞的行為、機制等提供新方向。大細(xì)胞群的單細(xì)胞基因組測序應(yīng)用一直受限于基因組制備過程中隔離單個細(xì)胞的技術(shù)挑戰(zhàn)。而數(shù)字PCR可將一個傳統(tǒng)的PCR反應(yīng)分割成數(shù)百萬的獨立皮升級反應(yīng)，基于此，LAN等[16]利用液滴微流體技術(shù)來分離細(xì)胞，將細(xì)胞基因組碎片化并將獨特的條形碼加到所有基因組片段上，這種方法可以在幾小時內(nèi)處理50 000多個細(xì)胞。然后，所有細(xì)胞的條形碼可以被匯集和測序，并通過條形碼分組，提供了單細(xì)胞基因組的庫。研究者利用這種方法分析了環(huán)境樣品微生物群落中抗菌藥物抗性基因、毒性因子和噬菌體序列的分布情況。

4 dPCR技術(shù)在肺癌診療中的應(yīng)用

4.1 肺癌診斷 微RNA(miR)-21-5p和miR-335-3p在肺癌患者血漿中呈現(xiàn)異常表達[17]。MA等[18]利用dPCR分析了36例肺癌患者和38例健康對照血漿中的miR-21-5p和miR-335-3p的拷貝數(shù)。研究結(jié)果表明，qPCR只能檢測到血漿中miR-21-5p的拷貝數(shù)，而dPCR可同時檢測到血漿中的miR-21-5p和miR-335-3p的拷貝數(shù)，說明dPCR對低豐度核酸的檢測更敏感。根據(jù)dPCR定量分析結(jié)果，血漿miRNA區(qū)分肺癌患者和健康對照的靈敏度和特異度分別為71.8%和80.6%。MiR-31和MiR-210的聯(lián)合檢測可用于肺癌的診斷[19]。LI等[20]利用dPCR對35例肺癌患者和40例健康對照的痰液中miR-31和miR-210進行檢測，結(jié)果顯示兩個miRNAs聯(lián)合用于肺癌診斷的靈敏度和特異度分別為65.71%和85.00%。作者的研究小組發(fā)現(xiàn)miR-126在肺癌患者血清中異常表達，并構(gòu)建了一種基于微流控芯片的乳滴dPCR技術(shù)檢測了20例早期肺癌患者和配對正常肺組織中miR-126的表達，通過分析受試者工作特征 (ROC)曲線顯示，相對于qPCR，dPCR可以更準(zhǔn)確地區(qū)分正常組織和肺癌組織[21-22]。

4.2 靶向治療方案制訂 表皮生長因子受體(EGFR)是一種腫瘤靶向治療分子，并在國內(nèi)外得到認(rèn)可。EGFR突變是對小分子酪氨酸激酶抑制劑(tyrosine kinase inhibitor，TKI)敏感的一個強預(yù)測因子。非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)患者EGFR基因19號外顯子的缺失和21號外顯子L858R錯義突變可以大大提高其對TKI的敏感性[23]。YUNG等[24]利用微流控dPCR檢測了35例NSCLC患者治療前的血漿標(biāo)本中EGFR基因突變，并用測序方法檢測患者組織中該基因突變。結(jié)果顯示，dPCR檢測到血漿中19號外顯子缺失突變和21號外顯子L858R錯義突變的比例分別為17%和26%，與組織檢測相比，血漿EGFR基因突變分析的靈敏度和特異度分別為92%和100%。這表明dPCR可用于分析血漿中低豐度EGFR基因突變，并為臨床用藥提供依據(jù)。

4.3 耐藥監(jiān)測 EGFR-TKIs已被證明可有效治療EGFR激活突變的NSCLC患者。然而，大多數(shù)接受EGFR-TKIs治療的患者最終會產(chǎn)生耐藥性，其中約50%的患者都具有EGFR T790M突變。WATANABE等[25]利用乳滴dPCR檢測了373例具有EGFR激活突變的NSCLC患者組織中EGFR T790M突變的情況。結(jié)果顯示，治療前T790M突變的總發(fā)生率為79.9%，頻率為0.009%～26.9%，由于大多數(shù)治療前T790M突變頻率低于0.1%，臨床上常規(guī)檢測方法無法檢測到。因此，dPCR更適合于微量樣品的T790M突變檢測，有潛力作為高靈敏度的診斷工具用于個體化治療的選擇。

雖然組織標(biāo)本對于研究EGFR-TKIs的耐藥機制十分重要，但是對于有些NSCLC患者來說，獲取組織標(biāo)本十分困難，并且組織標(biāo)本的連續(xù)獲取對患者來說創(chuàng)傷性也很大。據(jù)報道，肺癌患者血漿標(biāo)本中循環(huán)游離DNA(circulating cell-free DNA，cfDNA)的水平高于健康人[26]，循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA，ctDNA)是cfDNA的一部分，并且腫瘤患者的ctDNA可反映腫瘤突變信息，與腫瘤組織具有良好的一致性，并且ctDNA的檢測具有連續(xù)、方便和微創(chuàng)的優(yōu)勢，但其在血漿中的含量很低[27-29]?；诖?，ISHII等[30]利用dPCR檢測了NSCLC患者血漿中T790M突變，檢測的靈敏度和特異性分別為81.8%和85.7%，并且血漿和組織標(biāo)本中突變的一致性高達83.3%。這表明dPCR可以作為高靈敏的檢測方法用于血漿標(biāo)本中T790M突變的檢測，為耐藥監(jiān)測提供依據(jù)。OXNARD等[31]利用乳滴dPCR在NSCLC患者的血漿標(biāo)本中通過對EGFR和KRAS基因突變定量檢測，可以提前幾周預(yù)測臨床耐藥性的發(fā)生，從而指導(dǎo)治療。

4.4 預(yù)后預(yù)測 WANG等[32]利用dPCR和突變阻滯擴增系統(tǒng)(amplification refractory mutation system，ARMS)監(jiān)測了135例晚期NSCLC患者用EGFR-TKI治療6個月后的生存情況。結(jié)果顯示，dPCR對于ctDNA中EGFR T790M突變的檢測限為0.03%。在TKI治療前后的血漿標(biāo)本中，dPCR檢測到的T790M突變頻率均高于ARMS，并且與TKI治療前不具有T790M突變患者相比，具有T790M突變的患者的無進展生存時間和總生存時間要差。研究表明，通過dPCR檢測ctDNA中T790M突變可以為EGFR-TKI預(yù)后提供一種非侵入性和靈敏的檢測方法。Kras是一種致癌驅(qū)動基因，30%的NSCLC患者都有Kras基因突變，并且該基因突變與預(yù)后不良相關(guān)。GUIBERT等[33]利用dPCR檢測了32例肺腺癌患者中的血漿和循環(huán)腫瘤細(xì)胞中的游離DNA。研究結(jié)果顯示，循環(huán)游離DNA中Kras基因突變的檢測可以作為治療反應(yīng)差的預(yù)測因子。

5 小 結(jié)

常規(guī)的PCR技術(shù)對稀有分子遺傳變化的定量分析能力有限，由于dPCR具有高靈敏度和準(zhǔn)確性，有助于檢測復(fù)雜背景下的罕見突變，因此在許多領(lǐng)域已得到應(yīng)用。這將有助于促進癌癥的個體化治療，耐藥性研究及腫瘤的預(yù)后監(jiān)測。盡管dPCR的第一個商業(yè)化平臺已于2006年上市，并在眾多領(lǐng)域已有應(yīng)用，但與成熟的qPCR技術(shù)相比，由于dPCR技術(shù)上有一些局限性，使得它在臨床上的應(yīng)用仍處于初級階段。(1)dPCR分析過程需要高度特異性的等位探針來降低反應(yīng)的交叉性和假陽性。(2)需要大量的樣本量來覆蓋研究的突變類型。(3)樣品分離過程中DNA的變性會將兩條單鏈DNA分配到不同的反應(yīng)單元中，從而導(dǎo)致反應(yīng)結(jié)束后靶標(biāo)分子的拷貝數(shù)高于實際值。相反，樣品的不均勻性及分液體積的變化會導(dǎo)致靶標(biāo)分子的拷貝數(shù)低于實際值[32，34]。雖然存在一些局限性，但隨著對實驗方法的不斷研究，dPCR技術(shù)也會進一步完善和發(fā)展，相信dPCR技術(shù)具有廣闊的應(yīng)用前景，有望成為基因研究的前沿技術(shù)，并可在不久的將來作為常規(guī)技術(shù)用于臨床試驗。