線粒體與卵子老化

劉曉娉，黃睿

(中山大學(xué)附屬第六醫(yī)院生殖醫(yī)學(xué)研究中心，廣州 510655)

自從輔助生殖技術(shù)的出現(xiàn)，排卵障礙、內(nèi)分泌異常、盆腔炎性疾病等不孕患者的生育難題得到了很大程度的解決。但高齡婦女的助孕結(jié)局一直不盡人意，近幾十年的研究結(jié)果提示導(dǎo)致高齡女性生育能力下降的主要因素是卵子老化[1]。線粒體是卵子內(nèi)含量最多的細(xì)胞器，能產(chǎn)生ATP和多種生物合成中間體，為卵子的成熟、受精及胚胎發(fā)育過程提供能量，同時(shí)參與細(xì)胞內(nèi)多種生命活動(dòng)過程，如維持鈣離子穩(wěn)態(tài)、胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞代謝等。

在單個(gè)原始生殖細(xì)胞中線粒體數(shù)量<10個(gè)，在卵子發(fā)育成熟過程中，其線粒體數(shù)量增至1×106個(gè)以上，這提示線粒體數(shù)量和功能可作為衡量卵子質(zhì)量的重要指標(biāo)[2]。與年輕女性相比，高齡女性卵子中的線粒體DNA(mtDNA)突變率明顯增高而拷貝數(shù)及線粒體膜電位明顯降低[3-4]，理論上改善線粒體功能和/或增加正常線粒體數(shù)量可以提高老化卵子質(zhì)量，改善其發(fā)育潛能。自1997年將健康女性的卵細(xì)胞漿注射入質(zhì)量差的卵子中并獲得活產(chǎn)的案例報(bào)道以來，各種線粒體替代治療和線粒體移植技術(shù)相繼問世，其中包括原核移植、紡錘體移植、極體移植、自體顆粒細(xì)胞線粒體移植、自體卵原前體細(xì)胞線粒體移植、自體脂肪干細(xì)胞線粒體移植、自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞線粒體移植等。然而由于安全隱患及倫理問題等因素，這些技術(shù)的臨床應(yīng)用推廣備受爭(zhēng)議。同時(shí)，我們對(duì)線粒體移植的作用機(jī)制了解甚少。本文將闡述線粒體與卵子質(zhì)量之間的關(guān)系，進(jìn)而介紹線粒體移植在生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的發(fā)展歷史和分析其可能的作用機(jī)制。

一、線粒體與卵子質(zhì)量

線粒體是半自主性細(xì)胞器，呈扁長(zhǎng)形，由外膜、內(nèi)膜、嵴和基質(zhì)構(gòu)成。人類線粒體遺傳物質(zhì)(mtDNA)長(zhǎng)約16.6 kb，呈雙鏈環(huán)狀，無組蛋白，其包含37個(gè)基因，編碼2種線粒體rRNA、22種tRNA和13種氧化磷酸化酶復(fù)合體蛋白亞基。線粒體是卵子胞質(zhì)中數(shù)量最多的細(xì)胞器，不僅為卵子成熟、受精及胚胎發(fā)育過程提供能量，同時(shí)調(diào)控鈣離子穩(wěn)態(tài)、細(xì)胞凋亡自噬等生命活動(dòng)過程，其數(shù)量及功能異常將會(huì)對(duì)卵子受精和胚胎發(fā)育結(jié)局造成影響。

1.mtDNA拷貝數(shù)與卵子質(zhì)量：mtDNA拷貝數(shù)在不同類型細(xì)胞中存在差異。與體細(xì)胞相比，成熟卵子mtDNA含量至少多一個(gè)數(shù)量級(jí)。在卵子發(fā)生、囊胚發(fā)育及著床后發(fā)育等階段都有mtDNA復(fù)制活動(dòng)[5]。原始生殖細(xì)胞中含有約200個(gè)mtDNA拷貝數(shù)，隨著卵子發(fā)生，線粒體數(shù)量和mtDNA拷貝數(shù)均逐漸增加，直至卵子成熟完成受精時(shí)mtDNA拷貝數(shù)達(dá)到峰值；在囊胚發(fā)育階段，總體mtDNA拷貝數(shù)逐漸減少，但與內(nèi)細(xì)胞團(tuán)相比，滋養(yǎng)外胚層中的mtDNA拷貝數(shù)顯著增加，而內(nèi)細(xì)胞團(tuán)則維持低水平的mtDNA復(fù)制。著床前期參與原腸胚形成的胚胎干細(xì)胞mtDNA開始復(fù)制，余未分化細(xì)胞內(nèi)mtDNA數(shù)量隨著細(xì)胞復(fù)制而減少，稱為“mtDNA稀釋”；直至著床后期，mtDNA稀釋停止，因已積累了足夠量的mtDNA，未分化細(xì)胞發(fā)揮新的特定的細(xì)胞功能[6]。

成熟卵子中需要有充足的mtDNA拷貝數(shù)，從而確保在胚胎著床后，每個(gè)子細(xì)胞有足夠的mtDNA用于復(fù)制重啟，為著床后的胚胎發(fā)育過程提供足夠的能量。該mtDNA拷貝數(shù)下限值即為卵子發(fā)育能力的關(guān)鍵閾值，在人類該閾值為100 000[7]。小鼠實(shí)驗(yàn)表明，mtDNA拷貝數(shù)減少導(dǎo)致胚胎囊胚形成率下降[8]；而成功體外受精卵的平均mtDNA拷貝數(shù)也顯著高于未成功受精卵的mtDNA拷貝數(shù)[3]。這說明卵子中的mtDNA拷貝數(shù)影響其發(fā)育潛能和受精能力，增加線粒體數(shù)量可能提高發(fā)育潛能、增強(qiáng)受精能力。因此，線粒體數(shù)量或mtDNA拷貝數(shù)可以作為衡量卵子質(zhì)量?jī)?yōu)劣的標(biāo)志之一。

2.mtDNA突變與卵子質(zhì)量：mtDNA缺少組蛋白，鄰近的電子傳遞鏈能產(chǎn)生大量的活性氧(ROS)，且mtDNA的修復(fù)酶能力有限，使其容易發(fā)生突變，mtDNA的突變率是核基因的25倍[9]。突變mtDNA的聚集可以通過影響呼吸鏈功能干擾卵子的成熟。在卵子成熟過程中，微管和細(xì)胞分裂活動(dòng)的必要能量由線粒體提供。一旦呼吸鏈功能受到損傷，ATP產(chǎn)生減少，線粒體不能提供足夠的能量，就會(huì)干擾紡錘體上微管蛋白聚合和解聚，影響減數(shù)分裂染色體的分離，影響卵子質(zhì)量。

目前為止，研究人員已經(jīng)找出超過150種不同的mtDNA突變方式。早在1993年，Kitagawa等[10]首次發(fā)現(xiàn)人類卵巢組織存在mtDNA4977 bp缺失，且隨著年齡的增加，其缺失率也明顯增加。之后Keefe等[11]證實(shí)與年輕女性相比，高齡女性有更高的mtDNA 4977 bp缺失率，且認(rèn)為這與其生育潛能低下有關(guān)。除此之外，Hsieh等[12]在人卵中檢測(cè)到了另外12種mtDNA缺失，并認(rèn)為mtDNA缺失可導(dǎo)致線粒體功能障礙和ATP生成受損，從而干擾卵子受精和進(jìn)一步的胚胎發(fā)育。機(jī)體在有氧代謝過程中伴隨著ROS的產(chǎn)生隨著年齡的增加機(jī)體所累積的ROS會(huì)增加，高齡婦女卵子中高濃度的ROS以及受損的抗氧化防御機(jī)制使得mtDNA的突變率增高，進(jìn)而引發(fā)受精率低、胚胎發(fā)育異常及反復(fù)流產(chǎn)等不良結(jié)局[13]。

3.氧化應(yīng)激與卵子質(zhì)量：線粒體在產(chǎn)生ATP的同時(shí)伴隨著ROS的產(chǎn)生。正常情況下，機(jī)體內(nèi)氧化水平和抗氧化水平處于一種動(dòng)態(tài)平衡中。研究表明，適量的ROS參與卵泡發(fā)育、卵子成熟、排卵、黃體生成和卵泡閉鎖等生理活動(dòng)過程[14]。機(jī)體內(nèi)ROS與抗氧化劑之間的動(dòng)態(tài)平衡對(duì)卵子正常生長(zhǎng)發(fā)育有著重要的作用，機(jī)體的抗氧化能力隨著年齡增長(zhǎng)而減弱，隨之面臨的是ROS的積累。過多的ROS可破壞線粒體內(nèi)膜的極性孔(mPT)，導(dǎo)致鈣離子和細(xì)胞色素C外流，造成線粒體膜電位消失，線粒體凋亡程序啟動(dòng)導(dǎo)致減數(shù)分裂周期停滯和細(xì)胞凋亡[15]，在胚胎中則表現(xiàn)為卵裂球溶解及細(xì)胞碎片增多。另外，高濃度ROS抑制鈉鈣交換體和鈣離子信號(hào)分子鈣調(diào)蛋白活性，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣池儲(chǔ)存鈣離子減少而細(xì)胞質(zhì)中鈣離子增加，打破原有的鈣離子穩(wěn)態(tài)平衡[16]，最終致使卵子凋亡。研究報(bào)道，與形態(tài)正常的胚胎相比，出現(xiàn)細(xì)胞碎片的胚胎中ATP和ROS水平顯著升高[17]；對(duì)小鼠MⅡ期卵進(jìn)行光致敏造成線粒體損傷后，后續(xù)的胚胎發(fā)育及胎鼠的出生率均受到影響[18]。

線粒體在卵子成熟、受精及胚胎發(fā)育過程中有著至關(guān)重要的作用，線粒體數(shù)量不足和(或)功能障礙都將影響妊娠結(jié)局。線粒體治療的出現(xiàn)為這類問題的解決提供了新的方向。

二、線粒體治療發(fā)展歷史

1.線粒體替代療法：線粒體替代療法(mitochondrial replacement therapy，MRT)，即用健康的外源性線粒體補(bǔ)充或替代卵子或合子內(nèi)異常的線粒體，可以改善卵子質(zhì)量提高其發(fā)育潛能，但其產(chǎn)生的安全隱患和倫理問題引發(fā)爭(zhēng)議。早在1997年，Cohen等[19]首次將健康女性的卵細(xì)胞漿注射到反復(fù)卵子質(zhì)量差的患者卵子中并獲得活產(chǎn)。次年，Van Blerkom等[20]將卵子中富含線粒體的胞質(zhì)分離并注射入另一MⅡ期卵中，發(fā)現(xiàn)受體卵子ATP含量增加且保持一定的活性。但引入外來的胞質(zhì)會(huì)帶來異質(zhì)性的安全問題，同時(shí)胞質(zhì)內(nèi)含有的其他生物成分是否會(huì)對(duì)卵子造成傷害也是未知的。隨著克隆技術(shù)的發(fā)展，除了卵胞質(zhì)移植外，原核移植(pronuclei transfer，PNT)、生發(fā)泡移植(germinal vesicle transfer，GVT)、紡錘體移植(spindle transfer，ST)及極體移植(polar body transfer，PBT)等技術(shù)相繼出現(xiàn)。2016年，世界首例“三親嬰兒”于墨西哥誕生，該案例正是利用ST技術(shù)后進(jìn)行輔助生殖技術(shù)助孕并最終產(chǎn)出子代。然而，外源性線粒體的引入可導(dǎo)致后代攜帶兩種不同來源的線粒體，線粒體的異質(zhì)性或許可以通過表觀遺傳影響子代的性狀，可能給子代帶來即時(shí)或長(zhǎng)期的健康隱患。同時(shí)，由于第三方遺傳物質(zhì)的引入所形成的“三親嬰兒”也勢(shì)必會(huì)引起法律和倫理上的爭(zhēng)議。

2.線粒體移植技術(shù)：線粒體移植技術(shù)，即體外分離供體細(xì)胞的線粒體，將其通過顯微注射注入MⅡ期卵子。既避免了分離卵胞質(zhì)和核移植等技術(shù)要求高的問題，也可利用自體細(xì)胞作為供體，最大程度減少了后續(xù)的倫理問題，現(xiàn)已成為該領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

Tzeng等[21]在2001年首次報(bào)道了自體顆粒細(xì)胞來源線粒體移植入卵子并成功妊娠的案例?？琢罴t等[22]的研究表明自體顆粒細(xì)胞線粒體移植可明顯改善胚胎發(fā)育質(zhì)量，提高妊娠率。加拿大OvaScience公司分離患者卵巢里的卵原前體細(xì)胞(卵巢干細(xì)胞)，從中分離提取線粒體注射入卵子中，并進(jìn)行體外受精，誕生了世界上首個(gè)“干細(xì)胞嬰兒”。2015年，Oktay等[23]對(duì)10位反復(fù)助孕失敗的患者進(jìn)行卵原前體細(xì)胞線粒體移植，臨床妊娠率達(dá)40%。但Labarta等[24]的一項(xiàng)卵原前體細(xì)胞線粒體移植隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示這項(xiàng)技術(shù)并不能改善妊娠結(jié)局，盡管該研究利用分子標(biāo)記物對(duì)線粒體供體細(xì)胞進(jìn)行了鑒定，但并不能完全明確其細(xì)胞性質(zhì)，同時(shí)研究報(bào)道也沒有明確其注射線粒體拷貝數(shù)的定量方法及具體注射劑量，因此并不能據(jù)此否定其對(duì)人類卵子質(zhì)量的改善作用。2018年梁曉燕團(tuán)隊(duì)報(bào)道了首例應(yīng)用自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來源的線粒體移植入卵子后，行輔助生殖技術(shù)助孕并成功活產(chǎn)男嬰的案例[25]。除了臨床研究以外，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)肝細(xì)胞或自體脂肪組織來源的線粒體移植入卵子后均可以明顯提高老齡小鼠卵子的發(fā)育潛能[26-27]。

三、線粒體移植改善卵子質(zhì)量的可能機(jī)制

卵子中線粒體過少或mtDNA突變會(huì)導(dǎo)致線粒體功能異常，影響卵子成熟、受精及胚胎發(fā)育，理論上增加線粒體數(shù)量或改善線粒體功能可以提高卵子質(zhì)量，改善妊娠結(jié)局。已有文獻(xiàn)表明，分離純化的線粒體可以快速、直接進(jìn)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞中并正常發(fā)揮自身功能[28]。那么，線粒體移植后是如何改善卵子質(zhì)量的？下面就幾種可能的作用機(jī)制進(jìn)行闡述。

ATP的產(chǎn)生依賴于線粒體內(nèi)膜上一條完整的氧化呼吸鏈復(fù)合體。氧化呼吸鏈的損傷將導(dǎo)致ROS水平上升，ATP水平下降。Tarin等[29]提出卵子老化的“氧自由基——線粒體損傷學(xué)說”，認(rèn)為隨著年齡的增長(zhǎng)，卵子內(nèi)會(huì)堆積過多的ROS繼而影響ATP的生成，能量生成受阻會(huì)干擾紡錘體微管蛋白的聚合解聚過程，染色體分離過程受到影響，從而導(dǎo)致非整倍體的發(fā)生。將體外分離的線粒體注射入卵子后，增加了mtDNA的拷貝數(shù)，增加ATP的生成[29]，使微管蛋白聚合和解聚過程的能量得以補(bǔ)充，減少卵子非整倍體的發(fā)生，從而提高卵子發(fā)育潛能。

線粒體具有高度的活動(dòng)性，可以連續(xù)不斷地進(jìn)行融合與分裂。線粒體的融合與分裂平衡對(duì)維持線粒體正常形態(tài)、功能有重要作用。線粒體融合蛋白Mfn2對(duì)小鼠卵子成熟至關(guān)重要[30]，當(dāng)敲除線粒體融合基因后可導(dǎo)致卵子成熟障礙，胚胎發(fā)育潛能及相應(yīng)的胚胎質(zhì)量下降。老化卵子中高濃度的ROS促進(jìn)線粒體分裂，從而破壞線粒體的數(shù)量平衡。高齡女性卵子與年輕女性卵子相比，線粒體分裂活動(dòng)更加旺盛，從而產(chǎn)生更多的線粒體碎片[31]。過多的線粒體分裂活動(dòng)可通過ROS/NF-kB信號(hào)通路上調(diào)基質(zhì)相互作用分子(STIM1)表達(dá)和鈣池操縱性鈣內(nèi)流從而導(dǎo)致胞漿鈣離子濃度增加[32]。眾所周知，依賴于鈣離子的釋放和/或積累的信號(hào)通路在動(dòng)物胚胎的各種發(fā)育進(jìn)程中起著重要作用，可影響細(xì)胞的分化命運(yùn)和形態(tài)。外源性線粒體進(jìn)入卵子后，可能重新調(diào)節(jié)線粒體融合和分裂的穩(wěn)態(tài)平衡，調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)外鈣離子濃度，使得細(xì)胞各項(xiàng)生理活動(dòng)得以正常進(jìn)行，從而改善老化卵子質(zhì)量，提高其發(fā)育潛能。

另一方面，老化卵子中ROS的積累導(dǎo)致氧化損傷，導(dǎo)致線粒體功能障礙和細(xì)胞損傷[33]，其中過量的ROS累積會(huì)影響線粒體自噬。ROS調(diào)控線粒體自噬的機(jī)制包括ROS-PINK1/Parkin、ROS-HIF1-BNIP3/Nix、ROS-FOXO3-LC3/BNIP3和ROS-NRF2-P62等通路[34-37]。Niu等[38]的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PINK1的下調(diào)誘導(dǎo)線粒體伸長(zhǎng)和腫脹，降低線粒體DNA拷貝數(shù)，導(dǎo)致ATP缺乏，顯著增加自噬和凋亡，顯著影響囊胚的形成和質(zhì)量。ROS作為PINK1/Parkin通路的上游信號(hào)分子，老化卵子內(nèi)高濃度的ROS是否下調(diào)了PINK1的表達(dá)使自噬功能受損最終導(dǎo)致卵子發(fā)育潛能變差，以及外源性線粒體是否通過重新調(diào)控線粒體自噬而改善卵子質(zhì)量，這需要進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)去探索。

四、展望

在近二十幾年里，輔助生殖技術(shù)有了巨大的進(jìn)步，但卵子老化及胚胎質(zhì)量低下仍然是生殖醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的難題，越來越多的學(xué)者將目光聚焦在線粒體移植治療上，但目前對(duì)線粒體移植治療的臨床應(yīng)用所帶來的倫理和安全問題存在爭(zhēng)議。關(guān)于線粒體移植療法的循證醫(yī)學(xué)證據(jù)及基礎(chǔ)研究相對(duì)較少，其有效性和安全性也需要更多的實(shí)驗(yàn)研究進(jìn)一步驗(yàn)證。