家畜產(chǎn)氣莢膜梭菌病的診斷與防治

朱 波，張梅梅，祖新政，趙俊亮*，王登峰

（1.新疆呼圖壁種牛場(chǎng)有限公司，新疆 呼圖壁縣 831100；2.新疆畜牧科學(xué)院獸醫(yī)研究所（新疆畜牧科學(xué)院動(dòng)物臨床醫(yī)學(xué)研究中心），烏魯木齊 830000）

產(chǎn)氣莢膜梭菌(Clostridium perfringens)，舊稱魏氏梭菌，是一種廣泛分布于水源、土壤等自然界以及動(dòng)物腸道中的條件致病性細(xì)菌，該菌環(huán)境耐受性強(qiáng)、致病因子多種多樣，常導(dǎo)致人和多種家畜發(fā)生不同臨床癥狀的疾病，如：人氣性壞疽、食物中毒，牛羊猝死綜合癥、羊腸毒血癥、牛腸道出血綜合癥、羔羊痢疾、仔豬紅痢、禽壞死性腸炎等[1]。由于產(chǎn)氣莢膜梭菌的導(dǎo)致的疾病發(fā)病急、病程短、病死率高，它的流行常給家畜養(yǎng)殖業(yè)造成嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[2]。自20世紀(jì)80年代以來，國內(nèi)一些研究單位成功研制了產(chǎn)氣莢膜梭菌多價(jià)滅活疫苗，為該病的有效防治做出了重要貢獻(xiàn)。但近年來，即使在一些免疫畜群，仍然出現(xiàn)產(chǎn)氣莢膜梭菌的感染，如何有效防控該病成為當(dāng)前家畜養(yǎng)殖業(yè)可否健康發(fā)展的障礙之一。有鑒于此，本文綜述了產(chǎn)氣莢膜梭菌診斷和檢測(cè)方法，并從疫苗預(yù)防和抗生素治療等方面進(jìn)行防治技術(shù)方面總結(jié)，為基層臨床獸醫(yī)提供該病的預(yù)防和治療參考資料。

1 實(shí)驗(yàn)室診斷

敗血癥型產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的診斷相對(duì)簡(jiǎn)單，根據(jù)死亡動(dòng)物的臨床癥狀、剖檢病理變化（主要表現(xiàn)為敗血癥的臨床癥狀和剖檢病理變化）和顯微鏡檢查、直接涂片的革蘭氏染色和細(xì)菌培養(yǎng)可以做初步診斷，其中，產(chǎn)氣莢膜梭菌在動(dòng)物死亡后獲得的病變或病理組織中被檢出，可以確定其可能是致病因素；但大腸桿菌等其他細(xì)菌也可以引起動(dòng)物敗血癥死亡，動(dòng)物死亡后，產(chǎn)氣莢膜梭菌可快速侵入，此時(shí)檢出該菌就不能確定其為致病菌，需要進(jìn)行血清中和試驗(yàn)進(jìn)行確診。

1.1 病原學(xué)診斷

細(xì)菌的分離培養(yǎng)和鑒定是進(jìn)行細(xì)菌性傳染病確診的常用診斷方法。根據(jù)感染疾病臨床特征、革蘭氏染色特性、細(xì)菌形態(tài)和生化特性可以對(duì)該類細(xì)菌的感染做出初步診斷[3]。產(chǎn)氣莢膜梭菌常規(guī)生化鑒定通常采用糖發(fā)酵試驗(yàn)、七葉苷水解試驗(yàn)、產(chǎn)吲哚試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠水解試驗(yàn)、乳蛋白水解試驗(yàn)中的“暴烈”發(fā)酵反應(yīng)等[4]。此外，基于氣相-液相色譜對(duì)代謝產(chǎn)物短鏈脂肪酸的分析同樣用于產(chǎn)氣莢膜梭菌的鑒定，揮發(fā)性脂肪酸色譜分析顯示，產(chǎn)氣莢膜梭菌產(chǎn)乙酸、丙酸、丁酸[5]，部分菌株也可產(chǎn)琥珀酸和乳酸[6]，但該方法尚不能進(jìn)行亞型（如毒素型）區(qū)分，且費(fèi)時(shí)費(fèi)力、檢測(cè)成本高等難以廣泛應(yīng)用于臨床檢測(cè)。

隨著微生物及傳染病研究的深入，對(duì)微生物進(jìn)行型、亞型、株乃至分子水平上的鑒定顯得極為重要。分子生物學(xué)理論和技術(shù)在傳染病檢測(cè)與診斷中的廣泛應(yīng)用，使得細(xì)菌鑒定更加準(zhǔn)確、快捷和經(jīng)濟(jì)節(jié)約。當(dāng)前，用于產(chǎn)氣莢膜梭病診斷的技術(shù)主要有聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（PCR）技術(shù)、16S rRNA序列測(cè)定和同源分析技術(shù)、核酸探針技術(shù)等。

1.1.1 PCR技術(shù)

依據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌α毒素、β毒素、ε毒素和ι毒素的型特異基因發(fā)展而來的多重PCR方法廣泛應(yīng)用于產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素型的鑒定[7,8]。同時(shí)，還可以根據(jù)生產(chǎn)和研究需要，設(shè)計(jì)特異PCR引物用于特定來源菌株的鑒定，如對(duì)糞便樣本中腸毒性產(chǎn)氣莢膜梭菌的鑒定等[9]。由于該方法具有快捷、簡(jiǎn)便、易操作等優(yōu)點(diǎn)，已取代血清中和試驗(yàn)用于產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒素分型。

1.1.2 16S rRNA序列測(cè)定和同源分析技術(shù)

16S rRNA是病原菌檢測(cè)和鑒定的一種強(qiáng)有力工具，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)病原菌進(jìn)行快速、微量、準(zhǔn)確地分類鑒定。根據(jù)GenBank公布的產(chǎn)氣莢膜梭菌16S rRNA序列分析發(fā)現(xiàn)，產(chǎn)氣莢膜梭菌種間16S rRNA同源性達(dá)到了99.8%以上，表現(xiàn)高度保守，目前多對(duì)國際通用細(xì)菌16S rRNA PCR擴(kuò)增引物可供選擇，測(cè)序通過獲得16S rRNA序列可以快速準(zhǔn)確地進(jìn)行種的鑒定[10]。Smith等人利用該方法擴(kuò)增16S rRNA片段、測(cè)序并在NCBI網(wǎng)站BLAST搜索后，與已知產(chǎn)氣莢膜梭菌16S rRNA序列相似性為100%，確定為產(chǎn)氣莢膜梭菌[11]。與傳統(tǒng)生化鑒定方法，該方法較為快捷、準(zhǔn)確地給出試驗(yàn)結(jié)果，減少了試驗(yàn)環(huán)節(jié)操作不當(dāng)或失誤造成的結(jié)果誤判。

1.1.3 核酸探針技術(shù)

Van Damme-Jongsten[12]等人報(bào)道了用32P標(biāo)記探針檢測(cè)食物中毒樣品中的腸毒性產(chǎn)氣莢膜梭菌的研究；我國杜薔等人[13]建立了基于地高辛標(biāo)記的腸毒素特異性基因原位雜交檢測(cè)方法，該方法不僅具有較高的敏感性和特異性，同時(shí)還克服了32P標(biāo)記探針的放射污染的問題。

1.1.4 SDS-PAGE技術(shù)

SDS-PAGE技術(shù)是利用聚丙烯酰胺凝膠的分子篩效應(yīng)，根據(jù)不同毒素型菌株所產(chǎn)生的主要毒素蛋白相對(duì)分子質(zhì)量、形狀及其所帶電荷量的差異實(shí)現(xiàn)對(duì)其梯度分開，進(jìn)而根據(jù)菌株含有的主要毒素進(jìn)行毒素分型。于曉霞等[14]建立了SDS-PAGE毒素分型方法，并開展了臨床分離株的分型調(diào)查，其檢測(cè)結(jié)果與多重PCR檢測(cè)結(jié)果具有較高的一致性。雖然該方法較為簡(jiǎn)單快捷，但由于不同菌株分泌毒素能力存在一定差異，菌液上清毒素處理是確保檢測(cè)結(jié)果可靠性的關(guān)鍵，因此還有待更多試驗(yàn)數(shù)據(jù)予以驗(yàn)證。

1.1.5 基因芯片技術(shù)

基因芯片又稱DNA微陣列(DNA microarray)，是采用原位合成或直接點(diǎn)樣的方法將DNA片段或寡核苷酸片段排列在基片表面形成微矩陣，待檢樣品用同位素或熒光分子標(biāo)記后，與微矩陣上探針通過DNA-DNA堿基配對(duì)雜交，經(jīng)過掃描及計(jì)算機(jī)分析即可獲得樣品中大量的基因序列及表達(dá)信息，達(dá)到敏感、高通量、特異性地分析生物信息的目的[15]。趙渝徽[16]利用該技術(shù)成功構(gòu)建了壓電石英晶體傳感器產(chǎn)氣莢膜梭菌基因芯片檢測(cè)系統(tǒng)，能夠有效檢測(cè)產(chǎn)氣莢膜梭菌的毒素基因并能分型鑒定三種產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素。

1.2 血清學(xué)診斷

產(chǎn)氣莢膜梭菌感染的血清型診斷主要有血清中和試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)，它們可應(yīng)用于感染菌株的血清型鑒定或所產(chǎn)毒素的定型，也可用于感染菌株的血清抗體水平檢測(cè)。

1.2.1 血清中和試驗(yàn)

血清中和試驗(yàn)是評(píng)價(jià)產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素效價(jià)和毒素分型的經(jīng)典方法，廣泛用于疫苗效果評(píng)價(jià)和菌株分型鑒定。該方法把產(chǎn)氣莢膜梭菌培養(yǎng)上清毒素、培養(yǎng)上清毒素與抗血清中和后混合物接種小鼠或豚鼠，通過觀察小鼠是否被保護(hù)，豚鼠皮膚是否發(fā)生壞死等臨床指標(biāo)進(jìn)行判定。由于體外培養(yǎng)的ε毒素、ι毒素以原毒素形式存在于上清中，需經(jīng)胰蛋白酶等酶激活后才具有毒素活性；并且，毒素分型試驗(yàn)中需要多次中和試驗(yàn)才能判定結(jié)果，導(dǎo)致該方法費(fèi)時(shí)費(fèi)力且耗費(fèi)較高，并不利于臨床實(shí)際操作[17,18]。當(dāng)前，廣泛建立的ELISA和PCR方法可解決上述不足。

1.2.2 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)

ELISA診斷方法具有快速、簡(jiǎn)便、特異、敏感和高通量的檢測(cè)特點(diǎn)，澳大利亞Uzal等人[19]建立了間接 ELISA（Indirect ELISA）和競(jìng)爭(zhēng) ELISA（competitive ELISA）方法用于評(píng)價(jià) ε毒素抗血清效價(jià)，兩種ELISA方法與小鼠血清中和試驗(yàn)關(guān)聯(lián)系數(shù)分別為0.99、0.98，結(jié)果基本一致。McCourt等人[20]報(bào)告了夾心EILSA（Sandwich ELISA）用于產(chǎn)氣莢膜梭菌壞死性腸炎的診斷，診斷結(jié)果也與商品化夾心ELISA診斷試劑盒檢測(cè)結(jié)果相同。國內(nèi)也有研究人員報(bào)道用間接ELISA和斑點(diǎn)ELISA（dot-ELISA）進(jìn)行腸毒血癥診斷的研究[21,22]，也取得了較好結(jié)果。但由于產(chǎn)氣莢膜梭菌不同血清型菌株所產(chǎn)毒素種類復(fù)雜多樣，使得產(chǎn)氣莢膜梭菌病的ELISA診斷與檢測(cè)在我國尚處在試驗(yàn)研究階段。

2 防 治

產(chǎn)氣莢膜梭菌是腸道菌群的一部分，外界環(huán)境的突然變化或其它應(yīng)激破壞動(dòng)物腸道菌群的穩(wěn)態(tài)，從而導(dǎo)致梭菌的快速、大量繁殖，釋放的毒素導(dǎo)致疾病的暴發(fā)。該病發(fā)病急、病程短且死率高，故防治中以免疫預(yù)防為主；同時(shí)，減少抗生素的使用和應(yīng)激防止動(dòng)物腸道菌群的失衡在預(yù)防該病中也有積極作用。此外，維持腸道穩(wěn)態(tài)、克服外界刺激的益生菌等微生態(tài)制劑可能有一定的預(yù)防作用。發(fā)病后，及時(shí)發(fā)現(xiàn)并在發(fā)病早期使用抗生素治療可能會(huì)降低損失。

2.1 免疫預(yù)防

目前，滅活疫苗是預(yù)防產(chǎn)氣莢膜梭菌性疾病的主要有效方法。制苗菌株一般選擇一定區(qū)域內(nèi)優(yōu)勢(shì)毒素型菌株，通過發(fā)酵生產(chǎn)外泌毒素，經(jīng)甲醛等方法滅活后加佐劑制備成類毒素疫苗。國內(nèi)常見的疫苗有以腐敗梭菌和產(chǎn)氣莢膜梭菌C型（或B型）、D型菌種制備的預(yù)防羊快疫、羊猝狙、腸毒血癥和羔羊痢疾的三聯(lián)四防疫苗和經(jīng)工藝改良的三聯(lián)四防疫濃縮苗。這類疫苗已經(jīng)商業(yè)化生產(chǎn)并廣泛應(yīng)用綿羊梭菌病的防治。除此之外，我國王克領(lǐng)、薛家賓等人分別研制出了兔出血癥-魏氏梭菌病-巴氏桿菌病三聯(lián)苗[23,24]；趙立峰用本地分離的鹿源產(chǎn)氣莢膜梭菌研制出鹿出血性腸炎疫苗[25]。

在國外，家畜產(chǎn)氣莢膜梭菌病免疫也是牛羊免疫程序中的重要組成部分，如用于預(yù)防牛羊腸毒血癥和梭菌性腸炎的UltrabacRCD疫苗，為產(chǎn)氣莢膜梭菌C型和D型菌苗-類毒素疫苗；用于家畜多種梭菌病免疫預(yù)防的Ultrabac8疫苗，為肖韋梭菌-腐敗梭菌-溶血梭菌-諾維梭菌-污泥梭菌-C型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗，和Ultrabac7/Somubac疫苗，為肖韋梭菌-腐敗梭菌-諾維梭菌-污泥梭菌-C型和D型產(chǎn)氣莢膜梭菌疫苗；Scourguard4KC為牛輪狀病毒-冠狀病毒滅活苗-C型產(chǎn)氣莢膜梭菌-大腸桿菌菌苗-類毒素疫苗，用于預(yù)防健康和妊娠牛群腹瀉??；C型產(chǎn)氣莢膜梭菌-大腸桿菌菌苗-類毒素疫苗（Scourmune-C）用于預(yù)防豬的大腸桿菌病和梭菌性腸毒血癥。

2.2 抗生素的治療

雖然產(chǎn)氣莢膜梭菌所引起的疫病發(fā)病急，死亡快，但在發(fā)病初期（尚未大量產(chǎn)生毒素階段），采用敏感抗生素進(jìn)行治療，仍可取得一定的治療效果。根據(jù)產(chǎn)氣莢膜梭菌的耐藥基因檢測(cè)、序列分析和臨床的應(yīng)用，臨床分離株普遍對(duì)青霉素G、頭孢菌素、四環(huán)素、氯霉素、鹽霉素、莫能菌素、呋喃唑酮、利福平、桿菌肽、卡巴多、紅霉素、林可霉素、克林霉素、氨丙啉、雙呋脒腙和維吉尼亞霉素敏感，但對(duì)黃霉素和氨基糖苷類抗生素有抵抗力[26,28]。但也有報(bào)道稱從豬和家禽分離的一些菌株對(duì)四環(huán)素、桿菌肽、維吉尼亞霉素、大環(huán)內(nèi)酯-林可酰胺類（macrolide-lincosamide）抗生素和其他用于促進(jìn)生長和預(yù)防疾病的抗菌劑具有獲得性耐藥性[28]，并有一項(xiàng)研究報(bào)道稱來自家畜的大多數(shù)菌株對(duì)鏈霉素、紅霉素、頭孢菌素、林可霉素、四環(huán)素、桿菌肽和羧芐青霉素有抵抗力，甚至有超過15%的分離株對(duì)青霉素有抵抗力[28]。因此，根據(jù)當(dāng)?shù)亓餍芯昴退帬顩r，選擇敏感類抗生素進(jìn)行該病的早期治療，可能會(huì)降低產(chǎn)氣莢膜梭菌病造成的損失。

此外，維護(hù)動(dòng)物腸道菌群的穩(wěn)態(tài)可減少梭菌病的發(fā)生。益生菌在維持腸道穩(wěn)態(tài)、克服外界刺激、抵御產(chǎn)氣莢膜梭菌病感染中可發(fā)揮重要作用[27]。Teo等人[29]等從健康雞胃腸道篩選到一株新型枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），該菌可分泌一種抗梭菌因子，能夠有效抑制產(chǎn)氣莢膜梭菌在內(nèi)的多種細(xì)菌的生長繁殖。該項(xiàng)研究也為產(chǎn)氣莢膜梭菌的生物防治提供了可能。

3 結(jié) 語

產(chǎn)氣莢膜梭菌的感染是近年來家畜養(yǎng)殖業(yè)中的流行較廣、死亡率較高的疫病之一。雖然傳統(tǒng)的類毒素疫苗在防治中發(fā)揮著重要作用，但由于長期高密度的免疫，由疫苗毒株所覆蓋的產(chǎn)氣莢膜梭菌毒素得到了較好的控制，近年來，由于毒力因子的水平轉(zhuǎn)移及其新毒素的發(fā)現(xiàn)，使得該菌引起或繼發(fā)的感染有所加重。此外，產(chǎn)氣莢膜梭菌作為一種條件性致病菌，飼養(yǎng)方式、飼草料結(jié)構(gòu)以及氣候條件的突然改變，都提高了產(chǎn)氣莢膜梭菌病流行的風(fēng)險(xiǎn)。在當(dāng)前形勢(shì)下，傳統(tǒng)疫苗廣泛代表性菌株的篩選、新型高效疫苗的研制以及抗產(chǎn)氣莢膜梭菌新型靶標(biāo)藥物的開發(fā)仍是未來防治該病的重要措施之一。在采用疫苗、藥物進(jìn)行防治的同時(shí)，細(xì)化日常管理、保持良好的飼養(yǎng)環(huán)境、維持飼草料結(jié)構(gòu)的平衡也是有效防控該病的主要措施。只有通過營養(yǎng)、日常管理、合理藥物使用與高效疫苗的研發(fā)等綜合措施，才能有效預(yù)防產(chǎn)氣莢膜梭菌的感染、降低該病的發(fā)病率，從而有利于家畜養(yǎng)殖業(yè)的健康發(fā)展。