細(xì)胞凋亡磁共振分子影像研究現(xiàn)狀

趙相軒，溫鋒，盧再鳴，郭啟勇

作者單位：

中國(guó)醫(yī)科大學(xué)附屬盛京醫(yī)院放射科，遼寧省醫(yī)學(xué)影像重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，沈陽(yáng) 110004

細(xì)胞凋亡是細(xì)胞程序死亡的最常見(jiàn)形式之一，為人體生長(zhǎng)發(fā)育和維持自身穩(wěn)定所必需生理過(guò)程，細(xì)胞凋亡異常將導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生[1]。對(duì)細(xì)胞凋亡通過(guò)現(xiàn)代醫(yī)學(xué)影像手段，如CT、PET、SPECT和MRI等進(jìn)行顯像將對(duì)相關(guān)疾病的診斷、治療和預(yù)后分析至關(guān)重要。其定性、定量、實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)和精準(zhǔn)靶向性已被證實(shí)遠(yuǎn)超過(guò)傳統(tǒng)意義上的宏觀醫(yī)學(xué)影像[2-3]。利用特異性凋亡分子靶向探針作為對(duì)比劑進(jìn)行磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)即產(chǎn)生了細(xì)胞凋亡分子磁共振影像。筆者對(duì)國(guó)內(nèi)外應(yīng)用MRI技術(shù)對(duì)細(xì)胞凋亡進(jìn)行分子顯像的研究進(jìn)展進(jìn)行總結(jié)，以便為推動(dòng)細(xì)胞凋亡檢測(cè)應(yīng)用臨床診斷和療效判斷提供有益線索和思路。

1 細(xì)胞凋亡MR分子成像技術(shù)基礎(chǔ)

細(xì)胞凋亡是一種程序化細(xì)胞死亡執(zhí)行過(guò)程，伴隨著蛋白質(zhì)、核酸等生命物質(zhì)的降解、重新合成和耗能。細(xì)胞凋亡始于細(xì)胞結(jié)構(gòu)和生理過(guò)程發(fā)生改變，直至凋亡小體產(chǎn)生、被巨噬細(xì)胞吞噬而導(dǎo)致細(xì)胞的完全消失。可用于MRI的細(xì)胞凋亡典型事件有兩類：(1)細(xì)胞膜磷脂雙分子層內(nèi)側(cè)小頁(yè)(inner leaflet)上的磷脂酰絲氨酸(phosphatidylserine，PS)或磷脂酰乙醇胺(phosphatidylethanolamine，PE)外翻移位到外側(cè)小頁(yè)(outer leaflet)。鈣離子依賴性Annexin V蛋白(36kDa)可特異性識(shí)別細(xì)胞膜PS或PE而吸附到凋亡細(xì)胞表面，對(duì)此類細(xì)胞進(jìn)行標(biāo)記。PS或PE外翻是早期細(xì)胞凋亡檢測(cè)的生化基礎(chǔ)之一[4-5]；(2)細(xì)胞凋亡的進(jìn)程主要由胞內(nèi)的一系列稱為半胱氨酸-天冬氨酸特異性蛋白酶(cysteinylaspartate-specific proteases，Caspase)的蛋白裂解酶控制和調(diào)節(jié)。Caspase能識(shí)別底物蛋白中的特定序列而將其切割。目前共發(fā)現(xiàn)了大約13種Caspase蛋白酶，其中Caspase 3、Caspase 7和Caspase 8被特異性抑制劑阻斷活性后，細(xì)胞凋亡進(jìn)程被延遲或終止，故Caspase 3和7被稱為凋亡執(zhí)行者，Caspase 8為啟動(dòng)者。凋亡細(xì)胞內(nèi)Caspase 3、7和8蛋白酶對(duì)底物蛋白切割識(shí)別序列為DEVD (Asp-Glu-Val-ASP，天冬氨酸-谷氨酸-纈氨酸-天冬氨酸)。當(dāng)細(xì)胞內(nèi)關(guān)鍵性靶蛋白被Caspase裂解酶切割后，生物學(xué)功能活性喪失，細(xì)胞不可逆的進(jìn)入凋亡狀態(tài)。常見(jiàn)的Caspase切割底物有多聚ADP2核糖核酸聚合酶(PARP)，Lamin以及Caspase自身也可以成為上游Caspase切割的對(duì)象[6]。

MRI是一種利用原子核在磁場(chǎng)內(nèi)所產(chǎn)生的信號(hào)經(jīng)重建成像的一種影像技術(shù)。MRI具有高空間解析率、無(wú)放射性、可任意方向成像、軟組織分辨率高、無(wú)骨硬化偽影等優(yōu)點(diǎn)。新型對(duì)比劑的出現(xiàn)和廣泛應(yīng)用極大地改善了MRI的信噪比和精準(zhǔn)度，縮短了成像時(shí)間。目前最主要分子磁共振對(duì)比劑有兩類[7]，一類是基于螯合釓(Godalinium，Gd)，通過(guò)縮短組織縱向弛豫時(shí)間(T1對(duì)比劑)。另一類是基于磁性氧化鐵顆粒通過(guò)縮短組織橫向弛豫時(shí)間(T2對(duì)比劑)。但是這種分類也不是絕對(duì)，有報(bào)道Gd復(fù)合物也可以用于T2對(duì)比劑，氧化鐵顆粒也可用于T1對(duì)比劑。將上述Gd或氧化鐵納米顆粒與凋亡特異性檢測(cè)標(biāo)志物，如Annexin V或含有CASPase切割序列(如DEVD)的肽類分子偶聯(lián)后形成的復(fù)合物，即可應(yīng)用于細(xì)胞凋亡分子MRI。

2 細(xì)胞凋亡磁共振分子探針

2.1 基于超順磁性氧化鐵的凋亡探針

超順磁性氧化鐵(superparamagnetic iron oxide，SPIO)應(yīng)用于MRI已有30多年的歷史。由于其在T2或T2*序列加權(quán)成像中具有強(qiáng)陰性對(duì)比性，極為容易檢出而具有強(qiáng)大的臨床應(yīng)用前景。目前針對(duì)的細(xì)胞凋亡的SPIO分子磁共振探針主要包括C2–SPIO、Annexin V-SPIO、Annexin V–VSOP、R832-USPIO/R826-USPIO、Annexin V-CLIO和Annexin V-CLIO-Cy5.5等。

2.1.1 C2-SPIO

C2-SPIO [C2 domain of synaptotagmin I (C2)- superparamagnetic iron oxide (SPIO)，C2-SPIO]為突觸結(jié)合蛋白I (synaptotagmin I)的C2結(jié)構(gòu)域(C2 domain)片段與超順磁性氧化鐵納米顆粒交聯(lián)后形成的復(fù)合物分子。其中突觸結(jié)合蛋白I的C2結(jié)構(gòu)域(分子量約為11 kDa)可與細(xì)胞膜外翻的磷脂酰絲氨酸(PS)結(jié)合，這是構(gòu)成C2-SPIO識(shí)別凋亡細(xì)胞的生化基礎(chǔ)[8]。體外實(shí)驗(yàn)中，MR T2*WI掃描結(jié)果顯示C2-SPIO可識(shí)別Etoposide (依托泊甙，DNA拓?fù)洚悩?gòu)酶II抑制劑)誘導(dǎo)的大鼠淋巴瘤EL4細(xì)胞早期凋亡，而對(duì)正常未處理的對(duì)照細(xì)胞沒(méi)有結(jié)合，不產(chǎn)生鐵沉積信號(hào)，表明離體凋亡細(xì)胞可特異性吸附C2-SPIO。C2-SPIO還可通過(guò)血液循環(huán)到達(dá)腫瘤部位，檢測(cè)其是否有凋亡的發(fā)生。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)鼠尾靜脈注射C2-SPIO后，進(jìn)行T2WI成像(TE 30 ms)。Cyclophosphamide (環(huán)磷酰胺)和Etoposide聯(lián)合化療C57/Bl6荷瘤小鼠EL4移植腫瘤誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，MRI只在聯(lián)合化療組小鼠腫瘤部位檢測(cè)到顯著鐵沉積信號(hào)，而在安慰劑處理組沒(méi)有明顯信號(hào)，表明C2-SPIO可在體內(nèi)特異性識(shí)別凋亡細(xì)胞[9]。考慮到SPIO已在臨床上用于檢測(cè)血液磁共振[10]，因此C2-SPIO具有成為細(xì)胞凋亡檢測(cè)的臨床應(yīng)用潛在價(jià)值。值得關(guān)注的是該研究中小鼠鼠尾靜脈注射探針Fe含量為20 mg/kg換算成成人劑量應(yīng)為1400 mg/70 kg。而正常情況下Fe的正常給予應(yīng)該300 mg/person，因此進(jìn)一步的臨床試驗(yàn)可能會(huì)給患者或測(cè)試者帶來(lái)Fe過(guò)量服用的問(wèn)題，引起毒性。過(guò)高的C2-SPIO可能激活網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬細(xì)胞活性而誘發(fā)Fe累積沉淀。這些都是其臨床應(yīng)用亟待解決的問(wèn)題。

2.1.2 Annexin V-SPIO

將體外重組表達(dá)的Annexin V蛋白直接與SPIO交聯(lián)后可得到Annexin V-SPIO。Annexin V-SPIO應(yīng)用于MRI檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡得到初步的驗(yàn)證。Annexin V-SPIO可特異性識(shí)別阿霉素(Doxorubicin，Dox)誘導(dǎo)新生胎鼠心肌細(xì)胞和成年鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡[11]。處理組和對(duì)照組細(xì)胞分別與Annexin V-SPIO (10 μg)孵育，只有Dox處理組細(xì)胞Annexin V-SPIO可引起MR T2*WI信號(hào)衰減，表明凋亡細(xì)胞產(chǎn)生探針沉積。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)同樣證實(shí)Annexin V-SPIO可通過(guò)血液到達(dá)病變部位。FVB/NJ雄性小鼠腹腔注射25 mg/kg的Dox，48 h后鼠尾靜脈注射Annexin V-SPIO或SPIO后行MR T2*WI掃描即可觀察到Dox處理組注射Annexin V-SPIO后右心室壁出現(xiàn)信號(hào)衰減(探針沉積)，生理鹽水注射對(duì)照組SPIO則無(wú)明顯信號(hào)。平行實(shí)驗(yàn)還顯示皮下注射10 ng/kg的α腎上腺素受體激動(dòng)劑A61603 [N-(5-(4，5-二氫-(1H)-吲哚-2-基)-2-羥基-5，6，7，8-四氫萘-1-基)甲烷磺酰胺氫溴酸，簡(jiǎn)稱A61603]，可顯著減弱Dox誘導(dǎo)的信號(hào)衰減(Annexin V-SPIO沉積減少)，表明A61603可以降低Dox 誘發(fā)的心肌細(xì)胞凋亡。鑒于Annexin V-SPIO做對(duì)比劑情況下，MRI檢測(cè)到細(xì)胞凋亡信號(hào)最低細(xì)胞數(shù)目可在200個(gè)細(xì)胞左右。因此Annexin V-SPIO可作為一種高靈敏性分子MRI探針在體內(nèi)或體外條件下通過(guò)MR T2*WI序列顯示心肌細(xì)胞凋亡的存在。

2.1.3 Annexin V-VSIOP

將Annexin V蛋白與極小氧化鐵納米顆粒(very small iron oxide particles，VSIOP)通過(guò)巰基(Thiol)交聯(lián)可形成Annexin V-VSIOP。Annexin V-VSIOP磁性核心約為5 nm，外面包被75個(gè)檸檬酸鹽分子。每個(gè)VSIOP可交聯(lián)5個(gè)Annexin V分子，整個(gè)納米顆粒直徑約為14 nm。研究證實(shí)Annexin V-VSIOP可識(shí)別喜樹(shù)堿(Camptothecin)誘導(dǎo)淋巴瘤Jurkat細(xì)胞凋亡。對(duì)照細(xì)胞(凋亡率約為10%)與喜樹(shù)堿處理組(約有47%死亡)與Annexin V-VSIOP或M1234-VSOP(陰性對(duì)照)孵育后行MR T2WI和T2*WI，結(jié)果顯示Annexin V-VSIOP孵育的對(duì)照組和處理組的T2WI值為(82 ms和29 ms)，T2*WI值為(23 ms和10 ms)。表明喜樹(shù)堿處理可引起探針沉積。這種沉積由VSIOP攜帶的Annexin V特異性吸附所致且與凋亡細(xì)胞數(shù)量成正相關(guān)[12]。

2.1.4 R826/ R832-USPIO/Annexin V-USPIO

極小超順磁氧化鐵(ultrasmall superparamagnetic iron oxide，USPIO)交聯(lián)寡肽分子形成兩種磁共振探針。一種是超小超順磁氧化鐵與一種環(huán)狀七肽交聯(lián)形成的USPIO-832。USPIO-832可特異性識(shí)別并結(jié)合炎癥標(biāo)志物血管細(xì)胞粘附分子I (vascular cell adhesion molecule-I，VCAM-I)；另一種是超小超順磁氧化鐵與一種線狀六肽交聯(lián)形成的USPIO-826。USPIO-826可識(shí)別并結(jié)合細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸分子。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)證實(shí)USPIO-826可識(shí)別腫瘤壞死因子TNF-α誘導(dǎo)的人臍帶靜脈內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞凋亡和喜樹(shù)堿誘導(dǎo)的淋巴瘤Jurkat細(xì)胞凋亡。載脂蛋白APOE敲除小鼠高脂飲食可產(chǎn)生動(dòng)脈粥樣斑塊。實(shí)驗(yàn)證實(shí)雌性載脂蛋白APOE敲除小鼠鼠尾靜脈注射0.1 mmol Fe/kg的USPIO衍生物(包括USPIO-832、USPIO-826、USPIO-PEG等)。MR T2*WI 成像結(jié)果顯示在腹主動(dòng)脈粥樣斑塊處相同位置檢測(cè)到USPIO-832和USPIO-826高攝取。由于USPIO-832可識(shí)別粥樣斑塊，USPIO-826可識(shí)別凋亡細(xì)胞，因此二者成像結(jié)果顯示在動(dòng)脈粥樣斑塊處有細(xì)胞凋亡的發(fā)生。提示這類斑塊處于更加危險(xiǎn)期[13]。Nishie等[14]報(bào)道了Annexin V-USPIO經(jīng)鼠尾靜脈注射到達(dá)腫瘤部位，可識(shí)別Etoposide 和Cyclophosphamide聯(lián)合化療誘導(dǎo)的C57/Bl6荷瘤小鼠EL4細(xì)胞凋亡。與以往包括SPIO在內(nèi)的磁共振分子探針相比較，USPIO直徑遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于毛細(xì)血管孔徑，使得其可從毛細(xì)血管直接擴(kuò)散更容易到達(dá)靶點(diǎn)。兩種對(duì)比劑較以往研究的探針具有背景噪音低、高弛豫值、成像所需時(shí)間短、靶向性強(qiáng)等特點(diǎn)。因此二者具有更好的的臨床應(yīng)用價(jià)值，值得進(jìn)一步開(kāi)發(fā)用于檢測(cè)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的分期和腫瘤化療療效判斷。

2.1.5 Annexin V-CLIO

Annexin V還可以與鐵納米顆粒交聯(lián)構(gòu)成Annexin V-CLIO (Annexin V-Cross linked iron oxide)。每個(gè)Annexin V-CLIO分子約含有2.7個(gè)Annexin V蛋白。體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Annexin V-CLIO可識(shí)別喜樹(shù)堿誘導(dǎo)淋巴瘤Jurkat (Clone E6-1)細(xì)胞凋亡[15]。Annexin V-CLIO探針通過(guò)再次交聯(lián)熒光分子Cy5.5后可形成雙模探針[16]。該探針在MRI鑒定活體心肌細(xì)胞凋亡中得到一定的應(yīng)用。與前面報(bào)道的Annexin V-CLIO相比較，Annexin V-CLIO-Cy5.5不僅具有磁性對(duì)比功能，還可產(chǎn)生熒光，故可提供更多的信息。利用20 μg/ml Cycloheximide處理心肌細(xì)胞培養(yǎng)物18 h后可誘導(dǎo)約34.2%細(xì)胞發(fā)生凋亡。1 μg Fe/ml 的Annexin V-CLIOCy5.5與對(duì)未處理(對(duì)照組)和處理組細(xì)胞孵育后行MRI T2WI成像，結(jié)果顯示Annexin V-CLIO-Cy5.5在處理樣本中具有明顯沉積，而對(duì)照細(xì)胞沒(méi)有明顯攝取?；贑y5.5的熒光實(shí)驗(yàn)同時(shí)顯示只有處理組細(xì)胞具有熒光。表明Annexin V-CLIO-Cy5.5具有特異性結(jié)合凋亡細(xì)胞的能力。動(dòng)物活體實(shí)驗(yàn)中通過(guò)小鼠冠狀動(dòng)脈[left anterior descending (LAD) coronary artery]短暫性結(jié)扎30 min造成缺血損傷。鼠尾靜脈注射Annexin V CLIO-Cy5.5(2 mg Fe/kg) 或者CLIO-Cy5.5 (2 mg Fe/kg)。24 h后MR FLASH T2*WI顯像獲得舒張期和收縮期的圖像，結(jié)果顯示與陰性對(duì)照CLIO-Cy5.5對(duì)比，Annexin V CLIOCy5.5組出現(xiàn)明顯信號(hào)丟失(出現(xiàn)Fe沉積)。提示心室前部和前部外側(cè)出現(xiàn)功能性損傷。

Gaq高表達(dá)轉(zhuǎn)基因小鼠由于心肌肥厚可導(dǎo)致心衰。研究人員通過(guò)Annexin V CLIO-Cy5.5 MRI顯像在這種動(dòng)物心衰模型中檢測(cè)到心內(nèi)膜下微量細(xì)胞凋亡(約為2%)[17]。與此同時(shí)，研究人員還將Annexin V-CLIOCy5.5和Gd-DTPA-NBD 雙對(duì)比劑用于鑒定心肌梗塞中的細(xì)胞凋亡和細(xì)胞壞死。該研究基于Gd-DTPA-NBD探針不能進(jìn)入凋亡細(xì)胞(細(xì)胞膜仍然具有完整性)，但可以進(jìn)入壞死細(xì)胞(細(xì)胞膜不具備完整性)或其產(chǎn)生的碎片。而Annexin V-CLIO-Cy5.5能與凋亡細(xì)胞PS或PE結(jié)合可識(shí)別早期凋亡細(xì)胞。通過(guò)雙對(duì)比分子MRI探針可發(fā)現(xiàn)心肌細(xì)胞早期凋亡最容易發(fā)生在心肌中部。而細(xì)胞壞死最早發(fā)生在心內(nèi)膜。由于缺血再灌注的第4～6 h大部分發(fā)生凋亡的細(xì)胞還保持一定的活性(尚處于凋亡最早期)，由于凋亡早期是一個(gè)可以被阻斷的過(guò)程，因此這一部分可以作為治療挽救的對(duì)象，因此該探針具有一定的臨床應(yīng)用價(jià)值?？紤]到包括99Tcm-annexin V分子探針臨床試驗(yàn)中并不能將壞死細(xì)胞和凋亡細(xì)胞區(qū)分開(kāi)。而該研究通過(guò)雙對(duì)比劑的使用，成功將二者分開(kāi)，是一個(gè)巨大的進(jìn)步。該研究所采用的的熒光探針NBD，由于其分子量較小，不帶電荷而不易和血液組織中的白蛋白(albumin)及其他大分子物質(zhì)結(jié)合。因此NBD與Gd-DTPA交聯(lián)后并未對(duì)其物化性質(zhì)構(gòu)成影響而同樣適用于延遲增強(qiáng)(delay enhancement，DE)成像。研究人員還發(fā)現(xiàn)當(dāng)有約3%的心肌細(xì)胞發(fā)生凋亡是即可通過(guò)基于Annexin V-CLIO對(duì)比劑的MRI檢出。此時(shí)探針濃度僅為0.1 μg Fe/ml，低于SPIO等約100多倍，表明Annexin V-CLIO具有更強(qiáng)的特異性和靈敏度。其中的原因之一可能在與每個(gè)CLIO可攜帶2.7個(gè)Annexin V分子有關(guān)。由于Gaq高表達(dá)小鼠模型可以模擬人類心衰過(guò)程，故該探針介導(dǎo)的分子磁共振技術(shù)如在臨床得到進(jìn)一步試驗(yàn)和推廣，將可對(duì)人類心肌肥厚導(dǎo)致的心衰病情進(jìn)行非入侵性心肌凋亡動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。

2. 2 釓元素(Gd)

目前臨床應(yīng)用的MR T1對(duì)比劑主要由釓、錳、鋅等離子螯合而成，且以釓劑應(yīng)用最多[18]。基于釓元素(Gadolinium，Gd)的對(duì)比劑因具有高弛豫率的特點(diǎn)而廣泛應(yīng)用于磁共振增強(qiáng)檢查。釓噴酸葡胺Gd-DTPA(商品名Magnevist)是臨床上應(yīng)用最早的一種非特異性細(xì)胞外間隙對(duì)比劑。釓特酸葡胺Gd-DOTA則是一種新型的離子型大環(huán)類結(jié)構(gòu)的釓對(duì)比劑，穩(wěn)定性高于Gd-DTPA，亦開(kāi)始在臨床上日益得到廣泛應(yīng)用。目前基于Gd-DTPA和Dd-DOTA的細(xì)胞凋亡靶向分子探針主要有Gd-DTPA-g-R826、Gd-PMN-E3和C-SNAM。

2.2.1 Gd-DTPA-g-R826

Gd-DTPA-g-R826是Gd-DTPA交聯(lián)一個(gè)六肽(LIKKPF)形成的復(fù)合物分子，LIKKPF多肽可識(shí)別細(xì)胞膜外翻的PS組分，故可用于檢測(cè)細(xì)胞凋亡。利用雌性載脂蛋白APOE敲除小鼠(C57bl/6 ApoEtm1unc，APOE-/-)建立動(dòng)脈粥樣斑塊模型后，鼠尾靜脈注射0.1 mmol/kg的 Gd-DTPA-g-R826或隨機(jī)對(duì)照探針Gd-DTPA-g-R826.Sc以及游離探針Gd-DTPA。MRI RARE 成像結(jié)果顯示Gd-DTPA-g-R826在動(dòng)脈壁粥樣斑塊出有高攝取，對(duì)照組Gd-DTPA-g-R826.Sc或Gd-DTPA沒(méi)有明顯變化，表明動(dòng)脈壁粥樣斑塊存在細(xì)胞凋亡?？梢?jiàn)Gd-DTPA-g-R826具有靶向?qū)Ρ仍鰪?qiáng)作用，能夠清晰地顯示出斑塊的解剖學(xué)結(jié)構(gòu)，將有細(xì)胞死亡的部分與周圍組織區(qū)分開(kāi)來(lái)。平行免疫組化實(shí)驗(yàn)證實(shí)了相同部位動(dòng)脈壁出現(xiàn)了顯著細(xì)胞凋亡[19]。表明Gd-DTPAg-R826可特異性結(jié)合到病變部位而被MRI顯影。在眾多的致殘疾病中，急性動(dòng)脈粥樣硬化綜合征(acute atherothrombotic syndromes)所誘發(fā)的死亡率和發(fā)生率都居于前列。盡管該疾病治療手段有了一定的提高，但是很多患者還是在沒(méi)有任何征兆的情況下突然發(fā)病而死亡。因此人們?cè)趯ふ腋鞣N影像學(xué)方法來(lái)試圖鑒別哪些患者居于高危狀態(tài)。其中細(xì)胞凋亡對(duì)動(dòng)脈粥樣病變的促進(jìn)作用已經(jīng)比較明確。巨噬細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞凋亡促進(jìn)了纖維帽變薄和壞死性脂質(zhì)核的擴(kuò)大，最終導(dǎo)致斑塊的破裂和血栓的形成。脂質(zhì)核內(nèi)就是細(xì)胞表面暴露磷脂酰絲氨酸(PS)是斑塊的促凝血元兇之一?；贕d-DTPA-g-R826的分子磁共振顯影不僅可評(píng)估纖維帽的厚度(fibrous cap thickness)和脂質(zhì)核(size of the lipid core)的尺寸大小，還可對(duì)粥樣斑塊的細(xì)胞凋亡生物學(xué)性質(zhì)進(jìn)行定性，能為臨床提供更為精確的診斷和提供治療方案。

2.2.2 Gd-PMN-E3

Gd-PMN-E3分子探針中的E3蛋白通過(guò)噬菌體展示技術(shù)得到的能與細(xì)胞膜磷脂酰絲氨酸(Phosphatidylserine，PS)結(jié)合的線性寡肽分子，序列為TVLSSL；PMN為[2，6-pyridinediylbis (methylene nitrilo)-tetraacetic a c i d)]。體外實(shí)驗(yàn)中利用攜帶磷脂酰絲氨酸的微泡(1，2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phospho-L-serine micelles，PS-micelles)模擬細(xì)胞凋亡中外翻的PS；利用攜帶磷脂膽堿的微泡(1，2-dipalmitoyl-sn-glycero-3-phosphocholine micelles，PC-micelles)陰性對(duì)照。這些微泡與Gd-PMN-E3體外條件孵育后行MRI掃描，結(jié)果顯示Gd-PMN-E3與PS-micelles孵育時(shí)質(zhì)子弛豫在20～60 MHz時(shí)顯著增加。而陰性對(duì)照PC-micelles磁共振信號(hào)無(wú)顯著性變化。表明該探針能夠?qū)ξ砻娴腜S進(jìn)行識(shí)別而對(duì)PC沒(méi)有特異性結(jié)合[20]。該研究表明Gd-PMN-E3和Gd-DTPA-826可以作為細(xì)胞凋亡特異性的MRI對(duì)比劑，未來(lái)研究值得在細(xì)胞和動(dòng)物水平進(jìn)一步檢測(cè)它們體內(nèi)靶向病灶在磁共振診斷中的應(yīng)用。

2.2.3 C-SNAM

C-SNAM是一種基于Caspase活性檢測(cè)細(xì)胞凋亡的磁共振探針(caspase-sensitive nano-aggregation MRI probe，C-SNAM)。C-SNAM主要由2-氰基-6-羥基喹啉(2-cyano-6-hydroxyquinoline CHQ)、D-半胱氨酸殘基(D-cysteine residue)、二硫鍵、Caspase3/7識(shí)別并切割的DEVD短肽序列(Asp-Glu-Val-Asp)和Gd-DOTA螯合基團(tuán)等組成的復(fù)合體。當(dāng)C-SNAM進(jìn)入組織細(xì)胞后，由于細(xì)胞內(nèi)Caspase 3或7處于失活狀態(tài)且細(xì)胞具有還原性的微環(huán)境，C-SNAM保持未激活開(kāi)環(huán)狀態(tài)。當(dāng)細(xì)胞處于受到凋亡刺激信號(hào)處于應(yīng)激狀態(tài)時(shí)，細(xì)胞內(nèi)可產(chǎn)生ROS氧化環(huán)境及活化的Caspase激酶，復(fù)合物中的二硫鍵被氧化且DEVD被Caspase切割，此時(shí)的C-SNAM將變?yōu)榄h(huán)狀結(jié)構(gòu)并產(chǎn)生疏水性，最終自我分子堆積聚集形成Gd納米顆粒(Gd-nanoparticles，GdNP，直徑約為50～164 nm)。GdNP的r1弛豫值要高于未激活狀態(tài)的C-SNAM。250 μm的C-SNAM與2 μm的星孢霉素(Staurosporine，STS)處理過(guò)的宮頸癌Hela細(xì)胞(可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡)以及未處理的細(xì)胞共孵育。結(jié)果顯示STS處理細(xì)胞行MRI掃描，T1WI成像結(jié)果顯示STS處理組T1值顯著降低。這種降低可通過(guò)Caspase活性抑制劑Z-VAD-fmk (50 μm)阻斷STS誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡而消失。表明C-SNAM的攝取與Caspase激活相關(guān)，即激活的Caspase 3或7切割C-SNAM成環(huán)后在細(xì)胞內(nèi)積累。Dox誘導(dǎo)Hela細(xì)胞裸鼠移植瘤生長(zhǎng)抑制實(shí)驗(yàn)中，鼠尾靜脈注射C-SNAM (0.1 mmol/kg)或陰性對(duì)照Dotarem (non-activatable small molecular Gd-chelate Gd-DOTA)，T1加權(quán)自旋回波多層MR圖像結(jié)果顯示Dox可誘導(dǎo)瘤內(nèi)信號(hào)顯著升高。表明瘤內(nèi)Caspase激活導(dǎo)致了Gd積累[21]。

C-SNAM磁共振成像還可用于基質(zhì)相關(guān)干細(xì)胞移植(matrix associated stem cell implants，MASI)療效判斷。作為一種小分子探針C-SNAM，可通過(guò)關(guān)節(jié)內(nèi)注射通過(guò)被動(dòng)擴(kuò)散進(jìn)入損傷關(guān)節(jié)內(nèi)的移植細(xì)胞中。當(dāng)移植細(xì)胞發(fā)生凋亡時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的Caspase 3被激活而切割C-SNAM導(dǎo)致Gd-NP形成。因此基于MRI的C-SNAM增強(qiáng)成像可用于指導(dǎo)MASI治療關(guān)節(jié)軟骨修復(fù)條件的優(yōu)化，即通過(guò)調(diào)整治療方案避免移植細(xì)胞過(guò)度凋亡。在利用大鼠脂肪干細(xì)胞(rat adipose derived stem cell，rASC)進(jìn)行股骨遠(yuǎn)端骨軟骨損傷修復(fù)實(shí)驗(yàn)中，Mitocycin處理組細(xì)胞(可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡)與未處理組細(xì)胞分別注射到軟骨損傷處。而后再次注射C-SNAM后行MR T1WI造影。結(jié)果顯示注射Mitocycin處理組細(xì)胞的關(guān)節(jié)處出現(xiàn)信號(hào)顯著增強(qiáng)(與對(duì)照組注射活細(xì)胞關(guān)節(jié)對(duì)比)，即T1弛豫時(shí)間顯著縮短。相應(yīng)的部位進(jìn)行組織染色檢測(cè)細(xì)胞凋亡顯示T1信號(hào)增強(qiáng)處Caspase 3活性顯著增高[22]。表明由于Caspase 3的激活使得C-SNAM探針出現(xiàn)高攝取滯留。當(dāng)前細(xì)胞移植面臨的一個(gè)重要問(wèn)題就是移植細(xì)胞由于生長(zhǎng)環(huán)境的變化或免疫反應(yīng)會(huì)發(fā)生細(xì)胞凋亡。與此同時(shí)通過(guò)各種手段，如在細(xì)胞移植的時(shí)候加入生長(zhǎng)因子強(qiáng)化，干細(xì)胞導(dǎo)入存活基因，短期免疫抑制或加入凋亡抑制因子等保證移植細(xì)胞更多的存活。利用基于C-SNAM的MRI成像觀察移植細(xì)胞生長(zhǎng)狀況(是否發(fā)生凋亡)將有助于及時(shí)干預(yù)，提高干細(xì)胞存活，將有助于該治療手段的發(fā)展。上述研究在一定程度上為干細(xì)胞移植療效判斷提供了基礎(chǔ)性的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。

3 小結(jié)與展望

個(gè)性化和精準(zhǔn)醫(yī)療已經(jīng)成為臨床治療的必然發(fā)展趨勢(shì)，而精準(zhǔn)醫(yī)療的實(shí)施和療效判斷往往離不開(kāi)精準(zhǔn)影像的發(fā)展。具有細(xì)胞、組織或器官靶向性的磁共振對(duì)比劑在提高疾病的早期檢出、定性，對(duì)疾病進(jìn)行準(zhǔn)確分期或分級(jí)、療效的量化評(píng)估中具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)[23-24]。首先，臨床腫瘤放化療療效的判斷通?；趥鹘y(tǒng)意義上的CT或MR顯示的腫瘤的解剖學(xué)體積大小變化。它們并不能區(qū)分已經(jīng)凋亡的組織細(xì)胞。這種明顯的體積變化通常需要4～8周。分子MRI對(duì)放化療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡進(jìn)行非入侵式、無(wú)放射性評(píng)估對(duì)于腫瘤極早期療效評(píng)估具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。一方面凋亡事件可在48～96 h內(nèi)發(fā)生。另一方面由于每個(gè)鐵納米顆?？蓴y帶超過(guò)兩個(gè)以上的生物標(biāo)志物分子，使得其更加靈敏，當(dāng)有200個(gè)凋亡細(xì)胞發(fā)生時(shí)即可進(jìn)行成像，將磁共振鑒定細(xì)胞凋亡推向精準(zhǔn)成像。這在手術(shù)后利用化療藥物進(jìn)行癌細(xì)胞清除臨床診斷分析中將會(huì)發(fā)揮重要作用，值得進(jìn)一步深入探索。其次，分子MRI也可對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中的細(xì)胞凋亡無(wú)創(chuàng)檢測(cè)，精準(zhǔn)判斷其進(jìn)展?fàn)顟B(tài)，從而彌補(bǔ)現(xiàn)有診斷技術(shù)存在的缺陷。值得一提的是心肌細(xì)胞凋亡可誘發(fā)多種心臟疾病，如缺血，心衰和再灌注損傷。如何避免由細(xì)胞凋亡造成的心肌細(xì)胞減少具有重要的臨床意義也是藥物研發(fā)的熱點(diǎn)領(lǐng)域。盡管對(duì)心肌細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制基礎(chǔ)研究有了長(zhǎng)足的發(fā)展，但是由于這些研究發(fā)現(xiàn)未能實(shí)現(xiàn)臨床應(yīng)用轉(zhuǎn)化而存在巨大挑戰(zhàn)。尋找可靠的凋亡生物標(biāo)志物進(jìn)行活體(人體內(nèi))心肌細(xì)胞凋亡特征成像將解決上述問(wèn)題。雖然基于99Tcm-Annexin V的SPECT成像在大鼠心臟移植排斥，心肌炎，甚至在臨床心臟移植排斥和急性冠狀動(dòng)脈綜合征診斷中得到一定的應(yīng)用，但是由于其空間分辨率不夠和核素探針過(guò)長(zhǎng)時(shí)間的體內(nèi)清除阻礙了其應(yīng)用。分子靶向磁共振則不僅可提供清晰的人類和小動(dòng)物的心臟解剖學(xué)圖形和功能判斷，而且可以避免核素污染。磁共振延遲增強(qiáng)成像已經(jīng)在鑒定心肌梗塞細(xì)胞死亡的位置和范圍中得到應(yīng)用。第三，外傷或骨關(guān)節(jié)炎癥導(dǎo)致的關(guān)節(jié)軟骨損傷導(dǎo)致關(guān)節(jié)痛甚至功能性殘疾。關(guān)節(jié)軟骨損傷后難以治療是由于關(guān)節(jié)軟骨難以再生。嚴(yán)重性關(guān)節(jié)損傷通常以人工關(guān)節(jié)置換解決問(wèn)題。但是目前人工關(guān)節(jié)僅能維持10年。10年后由于各種并發(fā)癥導(dǎo)致二次植入人工關(guān)節(jié)愈發(fā)困難。分子細(xì)胞生物研究發(fā)現(xiàn)在關(guān)節(jié)軟骨產(chǎn)生損傷的早期進(jìn)行干預(yù)治療將可避免帶來(lái)結(jié)構(gòu)性徹底破壞。自體軟骨細(xì)胞或軟骨干細(xì)胞移植等細(xì)胞療法為此類疾病的治愈提供了希望。分子MRI可以無(wú)損非入侵性對(duì)移植細(xì)胞生長(zhǎng)和凋亡進(jìn)行檢測(cè)，為推動(dòng)移植免疫反應(yīng)等相關(guān)臨床研究提供了有力的保證。綜上所述，雖然基于PS和Caspase識(shí)別的MR分子成像不能將細(xì)胞壞死和程序性死亡嚴(yán)格區(qū)分開(kāi)來(lái)[25]，但仍然有著重要的臨床應(yīng)用價(jià)值，值得深入探討。

利益沖突：無(wú)。