β-地中海貧血分子生物學(xué)治療研究進(jìn)展

馬玉媛，劉云春

（大理大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南大理 671000）

β-地中海貧血是一種具有遺傳性的單基因溶血性貧血疾病，發(fā)生機(jī)制是調(diào)控β珠蛋白基因片段的缺失或者突變?cè)斐搔轮榈鞍缀铣涉湵壤Ш?。在全世界范圍?nèi)，每年出生的患有純合子或雙重雜合子基因型的β-地中海貧血新生兒至少有20萬(wàn)人[1]，常見(jiàn)發(fā)病地區(qū)有撒哈拉以南的非洲、地中海地區(qū)、中東、印度次大陸以及東亞和東南亞[2-3]，我國(guó)則集中在南方，主要發(fā)生于華南和西南地區(qū)，包括廣東、廣西、海南、四川、云南和貴州等地，其中廣東、廣西、云南以及海南是地中海貧血的高發(fā)區(qū)[4]。根據(jù)其臨床表現(xiàn)，β-地中海貧血可分為輕型、中間型和重型3種，表現(xiàn)為不同程度的進(jìn)行性溶血性貧血、黃疸、肝脾腫大等，嚴(yán)重的會(huì)引起死亡。國(guó)內(nèi)目前仍舊以輸血、切脾、造血干細(xì)胞移植為主，花費(fèi)大且治療效果不一[5]，雖然大量的輸血實(shí)踐結(jié)合鐵螯合療法已取得重大進(jìn)展，并成功地延長(zhǎng)了β-地中海貧血患者的預(yù)期壽命，提高了生活質(zhì)量，減輕了并發(fā)癥，增加了生存率，然而，為了獲得最佳的治療效果，必須在不可逆的鐵沉積過(guò)多介導(dǎo)心肌、肝、腦組織發(fā)生損傷之前盡早開(kāi)始有效的鐵螯合治療，但是隨著新的螯合劑的引入和心臟，肝臟磁共振成像作為監(jiān)測(cè)鐵超載方法的治療手段，治療成本的增加對(duì)于家庭經(jīng)濟(jì)和社會(huì)醫(yī)療體系都是沉重負(fù)擔(dān)[6]。以下將對(duì)地中海貧血的疾病機(jī)制及減少無(wú)效紅細(xì)胞的生成、鐵過(guò)載的調(diào)節(jié)、基因治療三方面的進(jìn)展進(jìn)行論述。

1 疾病分子機(jī)制

β-地中海貧血主要是11（p15.5）染色體上β珠蛋白基因點(diǎn)突變引起，也發(fā)現(xiàn)有少部分β-地中海貧血是由于β-珠蛋白基因缺失所致[7]。目前，全世界已發(fā)現(xiàn)超過(guò)200種β-地中海貧血突變型，我國(guó)報(bào)道發(fā)現(xiàn)46種[8］。不同類(lèi)型珠蛋白鏈間數(shù)量失衡以及受遺傳因素和地域環(huán)境方面的影響，使得β地中海貧血臨床表型多樣，從無(wú)癥狀，貧血到嚴(yán)重貧血合并多種并發(fā)癥（如肺動(dòng)脈高壓、血栓形成、感染、內(nèi)分泌功能障礙和下肢潰瘍等）。按照珠蛋白鏈缺失程度，珠蛋白肽鏈合成減少造成部分缺失的（稱(chēng)為β+，輕型突變），珠蛋白肽鏈不合成造成完全缺失的（稱(chēng)為β0，重型突變），不同組合有不同臨床癥狀。

β珠蛋白基因簇位于第11號(hào)染色體，包含珠蛋白基因（HBB）以及其他4種類(lèi)β-珠蛋白基因：胚胎期表達(dá)的ε-珠蛋白基因（HBE1）、胎兒期表達(dá)的γ-蛋白基因（HBG2和HBG1）和成年期低量表達(dá)的δ-珠蛋白基因（HBD），這些珠蛋白基因的表達(dá)調(diào)控精密，有高度的發(fā)育時(shí)序性[9]。人類(lèi)β珠蛋白基因簇隨個(gè)體發(fā)育的不同階段而出現(xiàn)特異性表達(dá)與關(guān)閉，存在胚胎→胎兒→成人的轉(zhuǎn)換，即有兩次開(kāi)關(guān)，分別為ε→γ和γ→β（δ）[10]。從受孕到妊娠5周內(nèi)，胚胎血紅蛋白主要在卵黃囊中合成，ε-珠蛋白基因在這段時(shí)期表達(dá)。第一次基因表達(dá)切換發(fā)生在懷孕后6周左右：ε-珠蛋白基因表達(dá)被逐漸關(guān)閉，γ-珠蛋白基因表達(dá)開(kāi)啟；從懷孕后12周到胎兒出生這段時(shí)間，血紅蛋白F（HbF）是胎兒紅細(xì)胞中最主要的血紅蛋白；第二次基因表達(dá)切換發(fā)生在出生后，γ-珠蛋白基因表達(dá)被逐漸關(guān)閉，β-珠蛋白基因開(kāi)始表達(dá)；出生6個(gè)月后，胎兒血紅蛋白的HbF會(huì)下降到血紅蛋白總量的1%以下，成人血紅蛋白HbA達(dá)到97%左右，另外2%為HbA2[10]。在對(duì)遺傳性胎兒血紅蛋白持續(xù)存在綜合征（HPFH）的病人的研究中發(fā)現(xiàn)，這是一種由于β-珠蛋白基因簇上的DNA序列缺失或γ-珠蛋白蛋白啟動(dòng)子區(qū)域發(fā)生點(diǎn)突變導(dǎo)致的成人紅細(xì)胞中持續(xù)存在過(guò)量的HbF的遺傳性血紅蛋白病，無(wú)臨床癥狀，不需要治療。因此，除了直接針對(duì)β-珠蛋白基因的表達(dá)調(diào)控，對(duì)γ-珠蛋白基因的表達(dá)調(diào)控在地中海貧血的治療上有重要作用，通過(guò)對(duì)γ-珠蛋白基因的一些調(diào)節(jié)蛋白或轉(zhuǎn)錄因子進(jìn)行干預(yù)，上調(diào)γ-珠蛋白的表達(dá)，能為β-地中海貧血的治療提供了更多的研究依據(jù)和參考作用。

2 治療進(jìn)展

2.1 減少無(wú)效紅細(xì)胞生成的方法

由于珠蛋白基因片段的缺失或者點(diǎn)突變?cè)斐芍榈鞍缀铣呻逆準(zhǔn)Ш鈱?dǎo)致無(wú)效紅細(xì)胞生成是地中海貧血的標(biāo)志。β-地中海貧血中的β珠蛋白基因部分表達(dá)（β+）或表達(dá)完全受限（β0）從而使α-珠蛋白肽鏈相對(duì)過(guò)剩，不能形成穩(wěn)定的血紅蛋白四聚體，容易氧化沉積形成包涵體沉積在紅細(xì)胞膜上，紅細(xì)胞變形能力降低，造成紅細(xì)胞膜破壞，紅細(xì)胞壽命縮短，大量無(wú)效紅細(xì)胞生成，引起了嚴(yán)重的溶血性貧血[11]。無(wú)效紅細(xì)胞生成是β-地中海貧血患者慢性貧血和復(fù)雜多發(fā)病率的關(guān)鍵病理生理機(jī)制，目前正在研究許多針對(duì)無(wú)效紅細(xì)胞生成的藥劑，用于治療由β-地中海貧血引起的貧血。例如，促紅細(xì)胞生成素（EPO）、HbF誘導(dǎo)類(lèi)藥物、鐵調(diào)素等，其中Janus激酶2（JAK2）抑制劑-魯索利替尼（ruxolitinib）和激活素受體-Ⅱ藥物-sotatercept（ACE-011）和luspatercept（ACE-536）處于最先進(jìn)的研究發(fā)展階段。

2.1.1 促紅細(xì)胞生成素（EPO）

促紅細(xì)胞生成素（EPO）是由腎臟在缺氧條件下產(chǎn)生的糖蛋白激素，具有刺激骨髓中紅系祖細(xì)胞的生長(zhǎng)和分化并防止其凋亡的作用。重組人促紅細(xì)胞生成素（rHuEPO）治療β-地中海貧血的基本原理來(lái)源于狒狒和小鼠的研究[12-13]，結(jié)果證明了rHuEPO對(duì)刺激HbF合成有益。臨床研究中，一直將EPO作為誘導(dǎo)HbF合成來(lái)增強(qiáng)紅細(xì)胞生成的藥劑，但是結(jié)果表明在很大程度上是具有變化性和不可預(yù)測(cè)性的[14-15]。rHuEPO可被視為β-中間型地中海貧血患者定期輸血的安全替代治療，特別是脾切除患者以及初始HbF患者＞40%或低EPO水平患者，但對(duì)于嚴(yán)重的β-中間地中海貧血患者，需要進(jìn)一步進(jìn)行更大規(guī)模的臨床試驗(yàn)以得到更好的治療評(píng)估效果[16]。另有研究表明，羥基脲（Hydroxyurea，HU）作為治療鐮狀細(xì)胞貧血的主要藥物，同時(shí)也是一種核苷二磷酸還原酶抑制劑，存在著誘導(dǎo)HbF生成的作用，在與rHuEPO聯(lián)合治療β-中間型地中海貧血患者的過(guò)程中顯示有良好的治療優(yōu)勢(shì)和安全性[17]。

2.1.2 Jak2抑制劑

紅細(xì)胞生成受細(xì)胞外和細(xì)胞內(nèi)因子的復(fù)雜信號(hào)通路的調(diào)節(jié)。EPO是紅細(xì)胞生成的主要調(diào)節(jié)因子，EPO經(jīng)其受體（EPOR）通過(guò)多種信號(hào)通路主要作用于JAK2/STAT5（Janus激酶2/信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子5）。Jak2是Jak酪氨酸激酶家族的成員，它與EPO的關(guān)聯(lián)特別，Jak2是唯一與EPOR相關(guān)的激酶，因此也是EPO的唯一信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)物[18]，Jak2的激活最終導(dǎo)致信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子Stat5a和b以及平行信號(hào)通路的激活[18]，促進(jìn)紅系祖細(xì)胞的增殖、分化和存活[19]。通過(guò)抑制JAK2/STAT5途徑對(duì)β-地中海貧血疾病中EPO過(guò)度刺激的負(fù)面影響一直是治療探索過(guò)程中有吸引力的領(lǐng)域。作為被美國(guó)FDA批準(zhǔn)的首批JAK2抑制劑藥物之一的魯索利替尼，一開(kāi)始被批準(zhǔn)用于治療患有紅細(xì)胞增多癥和骨髓纖維化的患者[20-21]，在治療的結(jié)果中表明，JAK2抑制劑在減少脾腫大方面具有臨床療效，但存在相關(guān)的副作用，包括血小板減少和貧血[22]，以及疾病癥狀的急性復(fù)發(fā)[23]；在β-地中海貧血中間型的小鼠模型中已顯示，JAK2抑制劑可改善無(wú)效紅細(xì)胞生成和逆轉(zhuǎn)脾腫大[24]，最近報(bào)道的一項(xiàng)為期30周的二期臨床試驗(yàn)中，評(píng)估了30例輸血依賴(lài)性貧血（TDT）和脾腫大患者使用魯索利替尼的藥物療效和安全性[25]。每天兩次魯索利替尼以10mg的起始劑量口服給藥治療，觀(guān)察結(jié)果表明平均脾臟體積明顯減少（第30周時(shí)從基線(xiàn)減少26.4%；n=25），最常報(bào)告的不良事件是上呼吸道感染（8/30）、惡心（6/30）、上腹痛（5/30）、貧血（5/30）、腹瀉（5/30）和體重增加（5/30）[25]。由于紅細(xì)胞輸注量略有減少，但并未減少輸血需求，輸血前血紅蛋白水平也并未有相關(guān)改善，導(dǎo)致沒(méi)有計(jì)劃對(duì)TDT進(jìn)行進(jìn)一步的研究。JAK2抑制劑將會(huì)是一種有效的治療選擇，理想情況下，JAK2抑制劑可以有助于減少重型β-地中海貧血的輸血，緩解非輸血依賴(lài)性地中海貧血的脾腫大和無(wú)效紅細(xì)胞生成的情況，但其安全性和耐受性目前還尚在研究中。

2.1.3 激活素受體藥物（TGF-β超家族）

TGF-β超家族由4組在細(xì)胞水平上具有相似結(jié)構(gòu)和調(diào)節(jié)活性的蛋白質(zhì)組成：TGF-β、BMP（骨形態(tài)發(fā)生蛋白）、GDFs（生長(zhǎng)和分化因子）和激活素。GDFs或激活素的抑制劑可能對(duì)紅細(xì)胞生成的晚期具有積極的影響，在由無(wú)效的紅細(xì)胞生成引起的貧血，如β-地中海貧血等疾病中具有治療作用[26]。激活素受體-Ⅱ藥物是在細(xì)胞外與配體結(jié)合的試劑，并且用于阻止在預(yù)期受體上的信號(hào)傳導(dǎo)。它們最初是通過(guò)抑制激活素依賴(lài)性信號(hào)傳導(dǎo)來(lái)預(yù)防破骨細(xì)胞依賴(lài)性骨吸收，用于改善絕經(jīng)后婦女的骨密度，但結(jié)果意外發(fā)現(xiàn)Hb值有了顯著的增加[27]。針對(duì)激活素受體-Ⅱ（ActRIIA或ActRIIB）開(kāi)發(fā)了兩種藥物——Sotatercept（ACE-011）和Luspatercept（ACE-536），用于治療與無(wú)效紅細(xì)胞生成相關(guān)的病癥。

Luspatercept和sotatercept是結(jié)合轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）家族配體的重組化合物，是激活素ⅡB型和ⅡA型受體（ActRIIB和ActRIIA）修飾受體，與人免疫球蛋白IgG1的Fc部分融合。因此，它們分別阻止TGF-β超家族配體結(jié)合ActRIIB和ActRIIA，抑制通過(guò)下游信號(hào)傳導(dǎo)對(duì)Smad2/3通路傳導(dǎo)的抑制作用。相對(duì)于激活素或其他TGF-β家族成員（例如GDF11）來(lái)說(shuō)，它們具有更強(qiáng)的結(jié)合能力[28]，在臨床的Ⅰ期和Ⅱ期的初始研究表明[29-30]，使用Luspatercept和sotatercept藥物的治療實(shí)驗(yàn)中，地中海貧血人群耐受性良好，血紅蛋白水平得到提高，貧血程度改善，輸血負(fù)荷減少，但確定具有輸血依賴(lài)性或非輸血依賴(lài)性β-地中海貧血的成人中可接受的活性劑量還需要在后期的Ⅲ期研究中進(jìn)行延續(xù)性觀(guān)察。

2.1.4 HbF誘導(dǎo)

自從發(fā)現(xiàn)具有胎兒Hb遺傳性持續(xù)存在的地中海貧血患者（HPFH）具有不太嚴(yán)重的表型[31]以來(lái)，研究人員一直致力于提高胎兒Hb（HbF）水平，將胎兒血紅蛋白（HbF）合成的再活化作為減輕β-血紅蛋白病癥狀的可行性策略。開(kāi)發(fā)新的基因組工具已經(jīng)確定了血紅蛋白轉(zhuǎn)換的重要天然遺傳修飾因子，包括BCL11A、KLF1、HBSIL-MYB、LRF、LSD1、LDB1、組蛋白脫乙酰酶1和2（HDAC1和HDAC2）。miRNA也是有希望的治療靶標(biāo)，用于誘導(dǎo)HbF產(chǎn)生，是更有效的新策略。許多新的HbF生產(chǎn)的小分子藥理學(xué)誘導(dǎo)劑已經(jīng)處于臨床前期和臨床開(kāi)發(fā)階段，例如甲基化抑制劑（5-氮雜胞苷、地西他濱、羥基脲）、細(xì)胞毒性和組蛋白去乙?；敢种苿?、如丁酸鹽衍生物。

最近的分子研究加深了我們對(duì)有希望的分子靶標(biāo)的理解，例如BCL11A、KLF1、MYB、LRF和影響HbF沉默的miRNA。然而，在將這些潛在的遺傳修飾物轉(zhuǎn)化為臨床治療之前，需要進(jìn)行更多的臨床前研究[32]。

2.1.5 Forkhead-box-O3（Foxo3）

Forkhead-box-O3（Foxo3）是一種關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子，發(fā)揮著許多基本的生物學(xué)功能，包括細(xì)胞周期調(diào)控、細(xì)胞凋亡、DNA修復(fù)和代謝和最重要的抗氧化作用，F(xiàn)oxo3通過(guò)在紅細(xì)胞生成的早期階段上調(diào)抗氧化酶來(lái)保護(hù)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激[33]。Foxo3的失活將導(dǎo)致細(xì)胞周期改變與成紅細(xì)胞前體的延遲成熟以及氧化應(yīng)激介導(dǎo)引起晚期成紅細(xì)胞的氧化損傷和壽命減少。因此，foxo3在減少無(wú)效紅細(xì)胞生成的過(guò)程中發(fā)揮著重要作用，雖然在血紅蛋白中的作用機(jī)制仍待闡述，但作為潛在的HbF誘導(dǎo)劑的Foxo3的活化可有利于改善β-地中海貧血中的貧血。在β-地中海貧血中間型小鼠中，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)Foxo3由于EPOR-pI3K/AKT/mTOR途徑的持續(xù)激活而下調(diào)，使用雷帕霉素（mTOR抑制劑）在β-地中海貧血中間型小鼠模型中，觀(guān)察到通過(guò)Foxo3的激活顯著改善紅細(xì)胞成熟，促進(jìn)了β-珠蛋白產(chǎn)生和緩解貧血狀況[34]。二甲雙胍作為二型糖尿病治療的批準(zhǔn)藥物，同時(shí)能作為是Foxo3誘導(dǎo)劑，能通過(guò)激活Foxo3誘導(dǎo)HbF的紅細(xì)胞表達(dá)。最新研究[35]表明，在鐮狀細(xì)胞性貧血和非依賴(lài)性輸血地中海貧血患者正在進(jìn)行的Ⅰ期臨床試驗(yàn)中正在研究其作為HbF誘導(dǎo)劑的用途，雖然已證明二甲雙胍能增加紅細(xì)胞祖細(xì)胞中Foxo3的活性，并且在與羥基脲的聯(lián)合使用中具有累加效應(yīng)，但正在臨床前研究階段，這些藥物需要進(jìn)一步的評(píng)估觀(guān)察。

2.2 鐵過(guò)載的調(diào)節(jié)治療方式

目前，監(jiān)管機(jī)構(gòu)已批準(zhǔn)3種鐵螯合劑用于治療β-地中海貧血患者的鐵過(guò)載，其中去鐵胺是第一種市售的鐵螯合劑，半衰期短需通過(guò)皮下注射長(zhǎng)時(shí)間給藥，另外兩種口服活性鐵螯合劑——去鐵酮、地拉羅司的引入代表了β-地中海貧血患者管理的巨大進(jìn)步。雖然3種鐵螯合劑的短期臨床療效相似，但不同器官的療效可能不同，并且受到可用性、功效和安全性問(wèn)題的限制，去鐵酮和地拉羅司都需要密切和持續(xù)的監(jiān)測(cè)以防止不良反應(yīng)發(fā)生。出于需要長(zhǎng)期堅(jiān)持治療和總治療費(fèi)用的考慮，它的治療滿(mǎn)意度仍不是最理想的。此外，F(xiàn)BS0701作為新型的口服去鐵藥，目前已完成臨床Ⅱ期研究，其不良反應(yīng)要比地拉羅司少1/4，對(duì)腎功能影響較小[36]，但較少的臨床Ⅰ、Ⅱ期的報(bào)道中研究對(duì)象僅針對(duì)輸血依賴(lài)型的鐵過(guò)載患者，也許在后面的臨床Ⅲ、Ⅳ期研究中也會(huì)將非輸血依賴(lài)型的鐵過(guò)載患者納入研究對(duì)象，進(jìn)一步擴(kuò)大診治范圍深入研究。針對(duì)鐵過(guò)載的調(diào)節(jié)治療方式，現(xiàn)在正在從改善鐵調(diào)素，調(diào)控鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及相關(guān)分子方面開(kāi)展著研究。

2.2.1 改善鐵調(diào)素

鐵調(diào)素（Hepcidin）是體內(nèi)調(diào)節(jié)鐵代謝的重要激素，由HAMP基因編碼，生物活性形式的hepcidin是25個(gè)小分子氨基酸多肽組成的[37]，主要由肝細(xì)胞分泌，通過(guò)血液循環(huán)發(fā)揮作用。無(wú)效紅細(xì)胞生成和慢性組織缺氧抑制鐵調(diào)素在肝臟合成和分泌。hepcidin的體內(nèi)低循環(huán)水平，又增加了十二指腸攝取鐵，從網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)再釋放鐵，最終肝臟鐵儲(chǔ)存過(guò)多導(dǎo)致鐵過(guò)載。在β-地中海貧血小鼠模型中過(guò)度表達(dá)hepcidin可改善無(wú)效紅細(xì)胞生成，增加血紅蛋白水平，逆轉(zhuǎn)脾腫大和鐵超負(fù)荷[38]。由此，可以通過(guò)調(diào)控hepcidin的水平來(lái)預(yù)防β-地中海貧血中的原發(fā)性鐵超負(fù)荷，并且可能減少現(xiàn)有的鐵負(fù)荷。最近研究發(fā)現(xiàn)，Minihepcidins是一種模擬內(nèi)源性hepcidin活性的短肽[39]，這種微量鐵調(diào)素的使用顯著改善了小鼠模型中的無(wú)效紅細(xì)胞生成、貧血和鐵超負(fù)荷，有很好的治療效果。還有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，TMPRSS6是一種跨膜絲氨酸蛋白酶，可減少鐵調(diào)素的產(chǎn)生[40]，因此可以通過(guò)降低TMPRSS6的表達(dá)來(lái)刺激內(nèi)源性鐵調(diào)素的產(chǎn)生。來(lái)自地中海貧血小鼠模型的結(jié)果表明，TMPRSS6基因的缺失改善了貧血并減少了無(wú)效的紅細(xì)胞生成，脾腫大和鐵負(fù)荷[41]。有實(shí)驗(yàn)表明，使用靶向TMPRSS6的反義寡核苷酸或小干擾RNA已被證明可改善小鼠和其他β地中海貧血臨床前模型的貧血和鐵超負(fù)荷[42]。非輸血依賴(lài)性地中海貧血（NTDT）患者比使用輸血依賴(lài)性地中海貧血（TDT）的患者更有可能從操縱鐵調(diào)素表達(dá)的藥物中獲益，而微型鐵調(diào)素和TMPRSS6抑制劑仍值得用于輸血依賴(lài)性地中海貧血（TDT）患者治療的評(píng)估。以鐵調(diào)素為靶點(diǎn)研發(fā)新藥或許能面向更廣泛的地中海貧血人群疾病的治療，因此，現(xiàn)在也逐漸成為地中海貧血治療研究的一個(gè)關(guān)注熱點(diǎn)。

2.2.2 調(diào)控鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白及相關(guān)分子

鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白將鐵從腸細(xì)胞輸出到血液循環(huán)，并在鐵穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮重要作用。腸道缺氧誘導(dǎo)因子-2α（HIF2alpha）是鐵轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白調(diào)節(jié)鐵含量變化的一個(gè)關(guān)鍵因子。在地中海貧血小鼠模型中，HIF2alpha在β-地中海貧血的發(fā)病機(jī)制早期被激活，并有助于鐵的積累，HIF2alpha信號(hào)的破壞可以糾正β-地中海貧血小鼠模型中的鐵超負(fù)荷[44]。

2.3 基因編輯和基因治療

2.3.1 基因編輯

基因編輯技術(shù)的產(chǎn)生使得基因突變疾病的治愈成為了可能，基因編輯技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)對(duì)特定位點(diǎn)基因進(jìn)行“編輯”，修飾造血干細(xì)胞的內(nèi)源DNA。常用的基因編輯技術(shù)有鋅指核酸酶、轉(zhuǎn)錄激活因子樣效應(yīng)物核酸酶（TALEN）、規(guī)律成簇間隔短回文重復(fù)基因編輯技術(shù)（（CRISPR/Cas9）。在可編程靶向核酸酶應(yīng)用之前，主要是通過(guò)外源性引入染色體模板觸發(fā)哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)同源重組途徑[45]，在沒(méi)有其他核酸酶的情況下，利用聚核苷酸來(lái)觸發(fā)同源重組途徑，同時(shí)利用病毒攜帶基因作為模板進(jìn)行基因編輯[46]。當(dāng)前，使用最多病毒載體包括逆病毒載體（Retro virus vector，RV）和腺病毒相關(guān)病毒（Adenovirus associated virus，AAV）載體。RV具有宿主范圍廣、轉(zhuǎn)染效率高，整合的外源基因可在靶細(xì)胞中永久表達(dá)等優(yōu)點(diǎn)，但存在明顯的遺傳穩(wěn)定性、使用安全性等方面的隱患；AAV安全性雖然相對(duì)較高，但感染效率偏低，亦可能引起免疫排斥等方面不足。當(dāng)前實(shí)驗(yàn)表明，慢病毒（Lentiviral，LV）是基因治療的最為有效的轉(zhuǎn)移載體[47]。但是，反轉(zhuǎn)錄病毒整合可能干擾基因功能，同時(shí)也存在一定誘發(fā)癌變的風(fēng)險(xiǎn)。基因正確導(dǎo)入和基因充分表達(dá)是首要的關(guān)注問(wèn)題。涉及基因組的同源重組，以慢病毒作載體導(dǎo)入患者體內(nèi)，而動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明慢病毒能激活原癌基因，增加腫瘤發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)以及可能發(fā)生基因移位隨機(jī)插入導(dǎo)致基因表達(dá)不足的問(wèn)題[48]。優(yōu)化載體的構(gòu)建，提高轉(zhuǎn)染的效率和保證載體的穩(wěn)定也是目前研究需要解決的關(guān)鍵問(wèn)題。

針對(duì)地中海貧血疾病而言，許多患者的β-地中海貧血的發(fā)生是單個(gè)位點(diǎn)突變引起，這有助于使用基因編輯策略進(jìn)行校正。但β-地中海貧血相關(guān)的眾多突變超過(guò)200多種，突變位點(diǎn)因地域不一，存在高度異質(zhì)性，因此基因編輯運(yùn)用的一個(gè)關(guān)鍵挑戰(zhàn)是確定有利于廣泛人群的分子靶標(biāo)。

2.3.2 基因治療

β地中海貧血的基因治療根據(jù)分子機(jī)制可以通過(guò)修復(fù)β-珠蛋白基因（HBB），或者重新激活γ-珠蛋白基因（HBG）誘導(dǎo)HbF的增加，平衡α和β-珠蛋白肽鏈的比例，改善紅細(xì)胞生成，從而達(dá)到有效治療目的。

使用自體干細(xì)胞的基因治療可以作為造血干細(xì)胞移植（HSCT）另一種治療方法，HSCT僅限于具有適當(dāng)匹配供體的患者。分離造血干細(xì)胞和祖細(xì)胞（HSPCs），使用慢病毒載體將外源性β-或γ-珠蛋白基因整合到宿主細(xì)胞基因組中。在完全或部分清髓后，遺傳修飾的自體HSPC返回患者，其中修飾的細(xì)胞重新填充造血。人類(lèi)CD34[49]細(xì)胞的慢病毒載體轉(zhuǎn)導(dǎo)現(xiàn)已成為一種成熟的技術(shù)，在一些患有嚴(yán)重聯(lián)合免疫缺陷或代謝紊亂的患者中產(chǎn)生了治愈反應(yīng)，這種方法使用相對(duì)較弱的增強(qiáng)子和啟動(dòng)子，迄今已被證明是安全的。還有依賴(lài)于靶向基因編輯的替代方法，如利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)在β-地中海貧血患者的人造血干細(xì)胞（CD34+）上將α-珠蛋白MCS-R2增強(qiáng)子進(jìn)行刪除突變，形成α-地中海貧血。編輯后的CD34+細(xì)胞分化為成熟紅細(xì)胞，導(dǎo)致減少α-珠蛋白表達(dá)，糾正肽鏈中的α與β珠蛋白的不平衡，改善了病理狀況[50]。由于在真正的造血干細(xì)胞（HSC）中存在核酸酶有效編輯靶向基因組DNA的困難，靶向基因遞送方法在臨床適用性受限。在使用靶向編輯做基因治療研究的同時(shí)需要更好地定義靶核酸酶的遺傳毒性（脫靶活性），通過(guò)不斷改進(jìn)和完善，有望成為治療β-地中海貧血最適合的手段。

3 結(jié)語(yǔ)

地中海貧血作為全球分布最廣泛、危害最大的遺傳性疾病，其管理和治療在全球都是巨大的負(fù)擔(dān)。十幾年來(lái)，β-地中海貧血的管理與治療都取得了很大的進(jìn)步，新型分子靶向藥物的研發(fā)針對(duì)不同類(lèi)型的地中海貧血患者都取得了一定的療效，一些在臨床前期研究的藥物，雖然存在很多的治療局限性和病理機(jī)制的不明確，但有很大發(fā)展?jié)摿τ写纳坪兔鞔_?；蛑委熢讦?地中海貧血治療中有很大的前景，大量實(shí)驗(yàn)證明方法的有效性的同時(shí)也要關(guān)注其治療的遠(yuǎn)期療效和安全性。隨著疾病相關(guān)機(jī)制的不斷明確，一些藥理學(xué)或遺傳學(xué)的新治療靶點(diǎn)有望被繼續(xù)發(fā)現(xiàn)。