食源性細菌低溫適應的分子機制研究進展

李秋瑩，張東棟，王司雯，孫彤，李婷婷，勵建榮*

1(渤海大學 食品科學與工程學院，遼寧 錦州，121013) 2(生鮮農產品貯藏加工及安全控制技術國家地方聯合工程研究中心(渤海大學)，遼寧 錦州，121013) 3(大連民族大學 生命科學學院，遼寧 大連，116600)

食品原料自身會攜帶一定量的微生物，在后續(xù)運輸及加工等多個過程中也容易受到微生物污染。微生物的控制是食品安全最重要的方面之一[1]。在食品生產、運輸、加工和購買后，通常被采用常規(guī)的冷藏方式進行貯藏。冷藏的溫度范圍通常為4～6 ℃(冰箱)和10～12 ℃(開放式冷藏柜)。在這一溫度范圍下，有些微生物仍能夠以一定的生長速率進行生長，如假單胞菌(Pseudomonasspp.),單核細胞增多性李斯特氏菌(Listeriamonocytogenes),小腸結腸炎耶爾森氏菌(Yersiniaenterocolitica)等耐冷菌[2]。因此，食源性細菌的低溫適應性對冷藏食品的質量和安全構成了嚴重威脅，當細菌菌群達到一定水平，能夠引起嚴重的食品腐敗或食物中毒。理解食源性細菌的低溫適應機制是提出有效的保藏策略的基礎。在細菌的生存溫度降低時，其細胞生理機能會發(fā)生重要的變化，比如膜流動性降低，核酸二級結構穩(wěn)定性增強，轉錄和翻譯效率降低，以及蛋白折疊效率降低等。這時細菌會啟動大量的基因來調整低溫對其生存的影響[3]。目前，關于低溫微生物適冷機制的研究已成為熱點，而食源性耐冷菌的適冷機制仍有待深入研究。本文主要從食源性細菌低溫應激響應關鍵基因的發(fā)掘，轉錄組學和蛋白組學在食源性細菌低溫適應機制研究中的應用兩個方面展開綜述，對國內外近年來對食源性細菌低溫適應的分子機制研究進行總結，為我國食源性細菌的研究和控制提供理論參考。

1 食源性細菌低溫響應的關鍵基因

1.1 典型冷激蛋白Csp家族

低溫促使微生物發(fā)生一系列的生理變化，其中，RNA的二級結構趨向穩(wěn)定，易形成發(fā)夾結構，會導致轉錄過早終止或造成RNAs的翻譯和降解無法正常進行。因此，對RNA代謝的調節(jié)是微生物低溫適應的重要策略之一[4]。冷激蛋白(cold shock proteins，Csps)是一類包含核酸結合冷休克結構域(CSD)的高度保守小分子量蛋白(～7.4 kDa)，可結合單鏈RNA和單鏈DNA[5]。在低溫時，冷激蛋白作為核酸伴侶可能通過與mRNA的結合防止其二級結構的形成，進而促進翻譯的進行。目前研究最為透徹的是大腸桿菌(Escherichiacoli)和枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)的冷激蛋白。大腸桿菌有9個冷激蛋白同源基因，命名為CspA～CspI，枯草芽孢桿菌有3個冷激蛋白(CspB～CspD)家族成員，其中大腸桿菌的CspA和枯草芽孢桿菌中的CspB是細菌中比較典型的受低溫誘導的冷激蛋白[6-7]。目前已經對多種食源性耐冷菌中的冷激蛋白在低溫適應中的作用進行了研究，如單核細胞增多性李斯特氏菌、鼠傷寒沙門氏菌(Salmonellatyphimurium)、腸炎沙門氏菌(S.enteritidis)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、小腸結腸炎耶爾森氏菌(Y.enterocolitica)等。

已報道的食源菌通常具有多個冷激蛋白，但冷激蛋白的作用規(guī)律是十分復雜的。在一些食源菌中，不是所有的冷激蛋白均受低溫誘導，而常有幾個冷激蛋白為最主要的低溫誘導蛋白。金黃色葡萄球菌表達3個冷激蛋白(CspA、CspB和CspC)，其中CspB是唯一受低溫誘導表達的，表明它是最主要的冷激蛋白[8]。類似的，在肉毒桿菌(ClostridiumbotulinumATCC 3502)應對低溫時，它的3個冷激蛋白(CspA、CspB和CspC)基因的轉錄水平均有升高，但僅有CspB基因缺失株在低溫下生長受阻，表明CspB基因是肉毒桿菌低溫適應中最主要的冷激蛋白[9]。在鼠傷寒沙門氏菌中，已經鑒定到了6個同源的冷激蛋白，StCspA-E和StCspH。已研究的StCspA、StCspB和StCspH的表達受低溫的誘導[10]。而在另外一些食源菌中，幾乎每個冷激蛋白均參與了低溫適應過程。比如單核細胞增多性李斯特氏菌，它具有3個冷激蛋白(CspA、CspB和CspD)，通過基因表達分析和突變體研究發(fā)現，在應對低溫時，這3個冷激蛋白均是必不可少的[11]。作為低溫脅迫的急性應激蛋白，冷激蛋白不僅在細菌遭遇低溫時立即響應，在后續(xù)較長時間的低溫適應中仍發(fā)揮作用。ANNAMALAI等[12]報道了在溫度從30 ℃降到4 ℃時，分別培養(yǎng)于LB培養(yǎng)基、牛奶和叉燒肉中的小腸結腸炎耶爾森氏菌的冷激蛋白基因表達情況。在低溫脅迫時，該菌迅速上調了CspA1和CspA2基因的表達水平，并在低溫處理后的24 h內持續(xù)表達；在30 ℃培養(yǎng)下，這兩個冷激蛋白是幾乎不表達的[13]。目前，針對食源性細菌的冷激蛋白的研究多集中于其受低溫誘導的表達規(guī)律研究及其突變體研究，而關于冷激蛋白的作用靶點、互作蛋白及其參與的食源菌低溫應激策略涉及哪些細胞進程，尚有待研究。

冷激蛋白作為廣泛存在的低溫誘導蛋白在細菌低溫適應中起到重要作用。而隨著越來越多的細菌完成了全基因組測序，發(fā)現多數細菌基因組具有多個冷激蛋白同源編碼基因，少數僅有一個冷激蛋白基因[6,14]。還有些細菌基因組中缺少冷激蛋白的存在。如食源性致病菌二型肉毒桿菌(Group IIClostridiumbotulinumtype E)的基因組中沒有發(fā)現冷激蛋白基因，表明該致病菌應具有其它應對低溫的策略[15]。

1.2 雙組分信號轉導系統(tǒng)

感應環(huán)境變化，應對環(huán)境變化引起的負面效應，這對細菌的生存是至關重要的。因此，細菌需要具備能識別和應對多種環(huán)境刺激的信號轉導機制。細菌的雙組分信號轉導系統(tǒng)就起到了這樣的關鍵作用。典型的雙組分信號轉導系統(tǒng)包括一個組氨酸激酶感應因子和一個結合DNA的響應調節(jié)蛋白[16]。雙組分系統(tǒng)的信號通路基于蛋白磷酸化。組氨酸激酶通常嵌在細胞膜中，通過它的N-端結構域感應一個特定的刺激信號。當受到特定刺激時，感應因子會發(fā)生構象的變化，激酶結構域中的C-端組氨酸殘基自動磷酸化，磷?；晦D移到細胞內同源響應調節(jié)蛋白接收結構域的N-端天冬氨酸殘基上。進一步，磷?；晦D移到其C-端輸出結構域，磷酸化的調節(jié)蛋白被激活，可誘導或抑制靶基因的轉錄[16]。雙組分系統(tǒng)參與許多環(huán)境應激反應，包括pH，滲透性，氧化應激和溫度[17-19]。研究較透徹的參與細菌低溫適應的雙組分系統(tǒng)是枯草芽孢桿菌中的DesK/DesR，該雙組分系統(tǒng)對于低溫下恢復膜流動性具有重要作用[20-21]。近來，多個食源性細菌中報道了參與低溫適應的雙組分系統(tǒng)。蠟樣芽胞桿菌(B.cereus)的CasKR雙組分系統(tǒng)對于該耐冷菌在低溫下的生長是必不可少的，與枯草芽孢桿菌DesK/DesR的作用類似，CasKR可能在低溫時參與調節(jié)膜脂肪酸的組成[22-23]。在一型肉毒桿菌(Group I type AC.botulinumATCC 3502)中，發(fā)現了兩套分別命名為CBO0366/CBO0365和CBO2306/CBO2307的雙組分系統(tǒng)在其低溫適應中發(fā)揮重要作用[24-25]。在二型肉毒桿菌(Group II type EC.botulinumBeluga)中也發(fā)現一套具有類似功能的雙組分系統(tǒng)，命名為CLO3403/CLO3404[26]。

PALONEN等發(fā)現雙組分系統(tǒng)CheA/CheY對于假結核耶爾森菌(Y.pseudotuberculosis)在低溫下的生長是十分重要的，突變編碼CheA組氨酸激酶的基因會導致該菌在低溫下生長受阻，而突變對應的編碼CheY調節(jié)蛋白的基因則不會影響該菌在低溫下的生長[27]，這表明雙組分系統(tǒng)參與低溫應激響應時，其感應因子和調節(jié)因子的重要性可能存在差異。雙組分系統(tǒng)中的組氨酸激酶感應因子和調節(jié)蛋白也可能在細菌應對低溫脅迫時單獨起作用。PALONEN等發(fā)現假結核耶爾森菌中有4個組氨酸激酶和2個調節(jié)蛋白在3 ℃下表達上調，而與它們對應的4個調節(jié)蛋白和2個組氨酸激酶的表達水平保持不變[27]。關于雙組分系統(tǒng)單個組分在低溫適應中的作用，在李斯特氏菌中研究較多。在單核增多性李斯特氏菌野生型EGD-e的基因組中有16個雙組分系統(tǒng)，其中一個僅具有調節(jié)蛋白lmo2512 (degU)[28]。CHAN等通過突變分析了3個調節(jié)蛋白，lmo1060、lmo1172和lmo1377 (lisR)，發(fā)現它們對單核增多性李斯特氏菌在4℃下的低溫適應是必不可少的[29]。P?NTINEN等構建了每個雙組分系統(tǒng)組氨酸激酶基因的缺失突變株，并監(jiān)控EGD-e野生型和突變株在3 ℃和37 ℃下的生長情況。結果表明組氨酸激酶yycG和lisK基因表達受低溫誘導，并且其缺失造成低溫敏感的突變表型；其它基因在低溫下表達水平上調，但不產生冷敏感突變株；表明李斯特氏菌的組氨酸激酶yycG和lisK對于其在低溫下的生長和適應更為重要[30]。盡管已從各類食源性菌中發(fā)現了很多與低溫調控有關的雙組分系統(tǒng)，但對于這些雙組分系統(tǒng)所調控的下游靶點的研究還有待深入。

1.3 Sigma因子

Sigma因子是RNA聚合酶的一個亞基，結合到RAN聚合酶的核心酶上負責轉錄的起始。Sigma因子對調控細菌的基因表達起著重要作用，以使細菌能適應快速變化的環(huán)境條件[31]。參與應激響應的Sigma因子主要包括一些革蘭氏陰性菌中的Sigma S(RpoS)和革蘭氏陽性菌中的Sigma B，許多研究者認為它們是功能同源的兩個Sigma因子[32]。細胞質外功能(ECF)Sigma因子被用于將細胞質外信號傳遞到細胞質[33]。目前，基因組序列分析顯示一些食源性菌中存在細胞質外功能Sigma因子，但是它們的在低溫適應中的確切功能尚不明確[34]。

RpoS不是低溫誘導蛋白，但它與許多參與應對低溫脅迫基因的表達有關。對大腸桿菌的研究發(fā)現，低溫下40%差異表達的基因受到RpoS的調控[4,35]。鼠傷寒沙門氏菌RpoS的缺失突變株與野生株在低溫下的生長速率及表型差別不大，表明RpoS對該菌在低溫下的生長并不起至關重要的作用[36]。但是，另一組研究發(fā)現Rpos還是參與了沙門氏菌的低溫適應的[37-42]。MCMEECHAN等調查了應激響應RpoS因子和細胞質外功能RpoE因子對鼠傷寒沙門氏菌在低溫下生存能力的貢獻。在檢測環(huán)境中，rpoE/rpoS雙突變菌株的生長和存活能力弱于單基因突變菌株，表明這兩個Sigma因子對該菌應對低溫脅迫的過程中均起一定作用[37]。

革蘭氏陽性菌通過招募Sigma B(sigB)因子來實現應對各種環(huán)境刺激的調控[38]。雖然研究發(fā)現肉毒桿菌中似乎缺少編碼sigB的同源基因[39]，但在一型肉毒桿菌中，孢子形成Sigma因子sigK是受低溫誘導的[40-41]。單核細胞增多李斯特氏菌中受sigB調控的一些基因在應對低溫脅迫時表達上調，推測sigB可能在低溫脅迫時起到一定調控作用[42]。近來，UTRATNA等人的研究發(fā)現李斯特氏菌群sigB因子在低溫和最適溫度生長下具有類似的表達模式，推測sigB在該菌低溫適應中沒有起到非常關鍵的作用。但是，在4 ℃，抗Sigma因子拮抗劑RsbV缺失的情況下能檢測到sigB活性；在37 ℃，抗Sigma因子RsbV的缺失下未能檢測到sigB活性，表明低溫時sigB獨特的作用方式，但支撐這種效應的機制需要進一步研究[43]。

2 食源性細菌低溫適應的組學研究

2.1 轉錄組學研究

微陣列技術和高通量RNA測序技術的飛速發(fā)展，推動著食源性細菌低溫適應機制的轉錄組學研究取得較大進展，為發(fā)現參與低溫適應的新基因、全面闡述食源性菌的低溫適應機制提供了可能。CHAN等[28]通過微陣列技術比較分析了單核細胞增多性李斯特氏菌在4 ℃和37 ℃下的全基因組轉錄水平。4 ℃與37 ℃生長條件下的李斯特氏菌相比，大量基因呈現了差異轉錄，轉錄水平上調的基因數多于下調的基因數，其中，轉錄水平較高的基因均為之前報道過的參與低溫適應的關鍵基因，如雙組分系統(tǒng)，冷激蛋白，RNA解旋酶等[28]。在4 ℃下轉錄水平較低的基因包括毒力相關基因以及一些熱激蛋白基因。

一型肉毒桿菌(ClostridiumbotulinumATCC 3502)進行了低溫下的全基因組微陣列分析，當溫度從37 ℃降到15 ℃ 1 h時，觀察到16個基因表達顯著上調，11個基因顯著下調，在溫度降低5 h后，199個基因上調，210基因下調。低溫脅迫最初，相對較少的基因表達受到了影響，表明存在有針對性的急性冷休克反應，而隨著處于低溫的時間不斷延長，該細菌發(fā)生了廣泛代謝重構。除了之前發(fā)現的細菌耐冷性相關的機制，與脂肪酸生物合成有關的機制也被顯著影響，數據分析表明一型肉毒桿菌可能能夠利用低溫誘導脂質生物合成和修飾機制來應對低溫導致的脂質固化。一些未知的DNA結合轉錄因子編碼基因是受低溫誘導的，表明可能存在新的調節(jié)機制參與肉毒桿菌的冷激脅迫。此外，氧化應激反應，鐵吸收和儲存及氧化還原平衡等相關基因的轉錄水平也受到低溫脅迫的影響[44]。

副溶血弧菌全基因組基因表達分析表明不同程度的低溫脅迫下該菌的基因表達模式不同，該菌根據溫度降低程度的不同，采用不同的應激策略[45]。與37 ℃的轉錄組數據相比，4 ℃條件下有193個差異表達基因，而15 ℃條件下有638個差異表達基因。在4 ℃時, 78% 的差異基因表達下調，僅有22%為上調，上調的基因包括轉錄調節(jié)因子、參與RNA代謝的基因、及部分參與能量代謝的基因。在15 ℃時，參與能量代謝的基因的表達受到抑制，如戊糖磷酸途徑，糖酵解和三羧酸循環(huán)的基因表達下降。與4 ℃不同，15 ℃下參與氨基酸種類和DNA合成的基因誘導表達了。另外，轉錄組分析結果還表明該菌的毒力相關基因(如tdh1, tdh2, toxR, toxS, vopC，T6SS-1，T6SS-2)沒有受到低溫的影響。

2.2 蛋白組學研究

在食源性細菌中，蛋白組學不僅被用來研究致病、致腐機制，也已應用到低溫適應機制的研究中，這促進了對食源性細菌的低溫適應機制更全面的了解。蛋白組結合轉錄組、代謝組等其他組學技術可彌補單個組學技術產生的偏差。

蛋白質組學分析表明食源性細菌在低溫下誘導表達了大量的蛋白。在副溶血弧菌中，低溫下69個蛋白顯著上調，涉及核酸轉運和代謝，轉錄等多種功能[46]。在麥氏弧菌(V.metschnikovii)中，低溫下有288個蛋白表達量上調，最豐富的包括冷激蛋白，延伸因子，分子伴侶，核糖體蛋白，外膜蛋白等[47]。低溫使麥氏弧菌增加了大量冷激蛋白和核糖體蛋白的表達，減少了參與能量轉換和新陳代謝的蛋白表達。生長在不同溫度下(5 ℃和26 ℃)的乳酸菌(Lactococcuspiscium)的蛋白組研究發(fā)現，低溫條件下該菌上調了參與氧化應激反應、脂肪酸和能量代謝的蛋白[48]。蛋白組學分析有助于發(fā)掘一些參與低溫適應的關鍵基因。例如，在腐敗菌腸系膜明串珠菌(LeuconostocmesenteroidesNH04)的蛋白組分析中，鑒定了一個受低溫誘導表達的蛋白，烷基氫過氧化物還原酶的同源蛋白(AhpC)[49]。AhpC催化烷基氫過氧化物和過氧化氫的還原，在各種細菌中具有抗氧化的作用。在低溫條件下，AhpC在NH04菌株中的表達量是對照菌株中的六倍，AhpC可能增強了NH04的抗氧化能力并在促進生長方面起重要作用[49]。蛋白組學不僅能鑒定大量參與低溫適應的蛋白質，還能分析食源性細菌低溫適應的特定機制。李斯特氏菌的蛋白組分析發(fā)現該菌的低溫適應過程主要影響了與蛋白合成和折疊，營養(yǎng)吸收和氧化應激有關的生化途徑。在4 ℃生長的李斯特氏菌細胞中，與能量產生的代謝途徑有關的蛋白呈現出更高的表達水平，如糖酵解和Pta-AckA通路，這表明細胞通過增強對能源的需求來維持低溫下的生長[50]。在金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)的低溫適應研究中，蛋白組與代謝組結合起來用于比較指數生長中期細胞在37 ℃與低溫脅迫條件下(4 ℃，2周)的細胞質蛋白和代謝變化[51]。蛋白組和代謝組數據的主成份分析表明，在指數生長中期，不同溫度條件下的蛋白和代謝表達譜不同，在受低溫脅迫的細胞中，9個核糖體蛋白含量大幅升高，但大多數氨基酸含量卻減少了，表明代謝穩(wěn)態(tài)和蛋白組成的特定變化對細菌低溫脅迫下的適應是至關重要[51]。這些研究與轉錄組學分析類似，均反映了食源性細菌更全面的低溫適應過程，這個過程涉及到多個系統(tǒng)的參與。全面的蛋白組學研究將有助于增加我們對食源性細菌低溫適應機制的理解。

3 結論

許多食源性致病菌和腐敗菌具有較強的低溫適應能力，它們通過自身的基因調控抵消了低溫帶來的有害影響。但是，在這個過程中，不同的細菌可能采用了不同的策略，這是不同細菌分子進化和適應的結果。轉錄組學和蛋白組學都能很好的揭示了食源性細菌在低溫適應過程中的全細胞反應。而通過基因組學、轉錄組學、蛋白組學及代謝組學等多個組學的結合分析將為食源性細菌低溫適應機制的研究提供了強有力的基礎。盡管目前已經發(fā)現了許多參與低溫適應的關鍵響應基因，但是這些基因的上下調控通路尚不夠清楚。隨著多組學技術的應用，越來越多參與低溫適應的關鍵基因會被發(fā)掘，細菌的整個低溫適應調控網絡會越來越明晰。食源性細菌在低溫下的生存能力對食品的質量與安全是至關重要的，通過分子生物學角度研究其低溫適應的機制，能幫助人們更加深入的了解食源性細菌在低溫下的生理行為，進而為更好的控制食源性細菌提供了指導。